蒙海勤，葉建仁，王旻嘉，曹伊揚

(南京林業(yè)大學林學院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

松材線蟲病是由松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)引起的一種毀滅性病害，具有寄主范圍廣、致病力強、染病寄主死亡速度快等特點[1-3]。該病于1905年在日本首次發(fā)現(xiàn)，至2018年已在我國18個省發(fā)生[4-5]，目前全世界已有52個國家將其列為重要的檢疫性病害，其中在中國和日本發(fā)生最嚴重[6-10]。幾十年來各國學者一直致力于松材線蟲病的相關(guān)研究，但有關(guān)松材線蟲病的致病機理仍不完全清楚。在防治松材線蟲病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)中，疫木就地或就近處理技術(shù)有待重大突破[11-12]。防治實踐中，檢疫、監(jiān)測、疫木處理、媒介昆蟲防治等環(huán)節(jié)中的關(guān)鍵在于疫木處理[13]，當前疫木處理主要采用粉碎或焚燒等方法，但實際應用中在一些地區(qū)存在如交通嚴重不便、人員很難到達等困難，導致疫木處理質(zhì)量難以保證[14-15]。

在自然界中普遍存在通過改變疫木內(nèi)微生境，從而使疫木內(nèi)松材線蟲數(shù)量減少的微生物。陳瑤等[16]利用木腐菌硫磺菌(Laetiporussulphureus)處理病死樹伐樁，發(fā)現(xiàn)該木腐菌可有效分解伐樁，并能夠有效抑制伐樁內(nèi)的松材線蟲數(shù)量，伐樁的質(zhì)量與松材線蟲含量成正比。鄧習金等[17]研究發(fā)現(xiàn)，木腐菌硫磺菌和茯苓(Poriacocos)等可有效減少疫木內(nèi)松材線蟲的數(shù)量，可作為處理松材線蟲病疫木的潛力菌株。本研究擬篩選出既能抑制松材線蟲生長繁殖又能降解黑松木質(zhì)的優(yōu)良真菌菌株，經(jīng)大量培養(yǎng)后接種于松材線蟲病疫木中，以期實現(xiàn)松材線蟲病的侵染循環(huán)在疫木環(huán)節(jié)被阻斷的目標，為松材線蟲病的有效防控提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從南京林業(yè)大學下蜀林場和江蘇省句容市搖令口工區(qū)感染松材線蟲病不同腐朽階段的病死松木上分離純化獲得B18、C11、C25、C28、D16、D17、D23等7個真菌菌株(未鑒定，不同腐朽階段對菌株的命名不一樣，第1個階段分離獲得的菌株以A1、A2命名，第2個階段以B1、B2命名，以此類推)并置于南京林業(yè)大學森林病理實驗室保存。綠色木霉(Trichodermaviride，編號Tv)購自廣東省微生物菌種保藏中心，黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium,編號Phc)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學保藏中心)，茯苓(Poriacocos，編號Pc)取自安徽省六安金寨縣金山寨菌種廠，灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea,編號Bc)保存于南京林業(yè)大學森林病理實驗室。

松材線蟲強致病力蟲株AMA3，保存于南京林業(yè)大學森林病理實驗室。

試驗疫木來源于江蘇省句容市搖令口工區(qū)感染松材線蟲病14年生的黑松病死木。

1.2 試驗方法

1.2.1 松材線蟲在木腐真菌平板上的生長繁殖

分別將2 000條松材線蟲接種至培養(yǎng)成熟的各種木腐真菌菌落平板上，每種真菌接種3皿，以灰葡萄孢菌培養(yǎng)的松材線蟲作為陽性對照，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。采用貝爾曼漏斗法對平板中的松材線蟲進行分離，在光學顯微鏡下對松材線蟲進行計數(shù)，最后分別計算各種真菌平板上松材線蟲數(shù)量變化情況。

1.2.2 木腐真菌對黑松木質(zhì)量和纖維素的影響

將木腐真菌接種至平板中，待菌絲即將長滿平板時放入已滅過菌的小木塊，以不接菌的PDA平板作為對照，每處理3皿。在15 ℃下培養(yǎng)120 d后，去掉木塊上的菌絲并將木塊烘干至質(zhì)量恒定，并稱質(zhì)量，按如下公式計算木塊的質(zhì)量損失率：

式中：x1表示試樣降解后的質(zhì)量損失率，%；ω0表示試樣降解前的絕干質(zhì)量，g；ω1表示試樣降解后的絕干質(zhì)量，g。

取絕干后的木塊，將其粉碎，利用化學法測定木質(zhì)纖維素含量的變化，降解木材各組分降解率的計算依照以下公式：

式中：x10表示降解木材試樣中某組分降解率，%；x0表示健康試樣中某成分含量，g；x表示降解木材試樣中某成分含量，g；x5表示試樣降解后質(zhì)量損失率，%[18]。

1.2.3 木腐真菌對疫木內(nèi)松材線蟲數(shù)量消長的影響

首先制作液體PDA培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌后接入已活化的木腐真菌置于25 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)10 d以獲得液體培養(yǎng)菌絲。固體培養(yǎng)菌絲的制作配方為：松木屑2 000 g、稻殼100 g、小麥粉200 g、葡萄糖20 g、七水硫酸鎂4 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸銨4 g、水1 000 mL，這些原料混勻后分裝200 g置于17 cm×33 cm的耐高壓高溫聚乙烯透氣袋中，于105 ℃的高壓滅菌鍋中滅菌4 h，連續(xù)重復滅菌3次，滅菌時間達到12 h，滅好菌后待營養(yǎng)袋中的材料冷卻至室溫，將液體培養(yǎng)好的木腐真菌按照每袋100 mL的菌種量接種于營養(yǎng)菌袋中，置于恒溫為25 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d使用。

用油鋸伐倒疫木，去除側(cè)枝后將主干運至南京林業(yè)大學下蜀林場，利用電鋸將疫木主干截成每段約60 cm長的木段，在木段上每隔15 cm用電鉆打孔，每木段正反兩面交錯分布共計3個孔，每個孔深度40 mm、直徑35 mm，并對圓孔進行編號，木段兩端為1號和3號，中間為2號。將所有木段進行編號、分類。

在疫木木段上接種木腐真菌。疫木伐倒12 d后，采用由液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種方式培養(yǎng)的菌絲進行接種。接種前先在接種孔周圍噴灑75% 的酒精，待酒精全部揮發(fā)后進行接種試驗，試驗設(shè)置5個不同菌株和2種培養(yǎng)菌絲接種方式，每個處理接種6個木段(基本來源于不同株)，分別以接種液體PDA和固體培養(yǎng)基作為空白對照。將事先培養(yǎng)好的木腐真菌接種至疫木小孔中，液體搖培菌絲每孔接種40 mL，固體菌絲每孔接種20 g，接種后利用保鮮膜封口以保溫保濕和防止其他雜菌污染。由于接種液體培養(yǎng)菌絲受取樣時間限制，每個處理不是所有木段都有天牛蛀道，而且蛀道數(shù)量不一，導致收集到的樣本數(shù)量不同，因此未做顯著性分析。

接種木腐真菌后，分析不同處理的疫木中松材線蟲種群的變化。定期觀察接種于木段上的木腐真菌生長情況，發(fā)現(xiàn)天牛即將羽化(即在接種150 d)時分別鉆取接種孔正面木樣，然后用斧頭將整個木段劈開，收集天牛蛀道周圍的木樣，分析蛀道周圍木樣內(nèi)松材線蟲數(shù)量(用貝爾曼漏斗法分離其中線蟲數(shù)量)。同時收集漏斗上的木屑并用信封包好，放置于105 ℃烘箱中烘至質(zhì)量恒定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010和SPSS 24.0處理和分析數(shù)據(jù)，Origin 2018 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同木腐真菌對松材線蟲生長的抑制分析

分別將2 000條松材線蟲接入不同木腐真菌的平板上培養(yǎng)10 d后，每個平板上松材線蟲數(shù)量見圖1。由圖1可知，松材線蟲在茯苓(Pc)、黃孢原毛平革菌(Phc)、B18、C11、D16 這5種真菌的平板上幾乎不能生長，從茯苓的菌落中未分離到松材線蟲，在其他4種真菌的菌落上也僅分離到極少量的松材線蟲。多重比較結(jié)果表明，這5種木腐真菌對松材線蟲生長繁殖的影響不具有顯著性差異。與接種前的數(shù)量相比，這5種菌完全不適合松材線蟲的生長繁殖。當利用綠色木霉(Tv)培養(yǎng)松材線蟲時，10 d后平板上的松材線蟲數(shù)量顯著高于作為對照的灰葡萄孢平板上的松材線蟲數(shù)量，說明綠色木霉的菌絲極其適合于松材線蟲的生長，在綠色木霉菌落上松材線蟲生長快、數(shù)量多。松材線蟲也能在其他D17、D23、C28和C25等菌種平板上生長，但非常緩慢，生長繁殖顯著差于作為對照的灰葡萄孢上培養(yǎng)的松材線蟲。由此初步選出茯苓、黃孢原毛平革菌、B18、C11、D16這5個明顯不適宜松材線蟲生長繁殖的菌株作為進一步研究的菌/菌株。

Pc.茯苓Poria cocos；Phc.黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium；Bc.灰葡萄孢菌Botrytis cinerea；Tv.綠色木霉Trichoderma viride。不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Different lower case letters indicate significant difference among all treatments (P<0.05)．The same below.

2.2 不同木腐真菌感染對黑松木塊質(zhì)量和木質(zhì)纖維素的影響

將松木塊接入能抑制松材線蟲生長的優(yōu)良木腐菌-茯苓、B18、黃孢原毛平革菌、C11和D16菌落上培養(yǎng)120 d后，去掉木塊表面菌絲并把木塊烘干至質(zhì)量恒定后稱量，比較黑松木塊質(zhì)量變化(圖2)。由圖2可知，松木塊在5個木腐真菌的菌落上培養(yǎng)120 d后均造成了質(zhì)量損失，損失率顯著高于對照(df = 5，F(xiàn)= 288.957，P<0. 05)。其中茯苓菌對松木塊質(zhì)量的影響最顯著，使木塊質(zhì)量損失率達7.5%；其次是B18菌，使木塊質(zhì)量損失率達6%以上。黃孢原毛平革菌和D16菌株對木塊質(zhì)量的影響僅次于B18菌株，C11菌株使木塊質(zhì)量損失率達4%。說明這5個木腐真菌/菌株都可以定殖松木塊，降解木塊組織使其質(zhì)量減少。

圖2 木腐真菌對黑松木塊質(zhì)量的影響

所用木腐真菌培養(yǎng)至120 d后，烘干木塊至質(zhì)量恒定，粉碎后測定木質(zhì)纖維素含量的變化，結(jié)果見圖3。由圖3可知，不同的木腐真菌分解木質(zhì)纖維素能力不一樣，相同菌/菌株降解不同的木質(zhì)組分能力也有差異。茯苓分解纖維素和半纖維素能力最強，分解纖維素19.21%和半纖維素29.65%，而對木質(zhì)素降解能力僅為1.92%，表明茯苓分解木質(zhì)素能力較弱。其他的4個木腐真菌/菌株，降解纖維素和半纖維素能力大小依次為B18 > C11 > D16 > 黃孢原毛平革菌，降解木質(zhì)素能力大小依次為黃孢原毛平革菌 > C11 > D16 > B18。雖然黃孢原毛平革菌分解纖維素能力較弱，但其降解木質(zhì)素最多，降解率為31.59%，降解能力顯著優(yōu)于其他處理(纖維素：df = 5，F(xiàn)= 136.704，P<0.05。半纖維素：df=5，F(xiàn)=78.751，P<0.05。木質(zhì)素：df=5，F(xiàn)=63.425，P<0.05)。

圖3 木腐真菌對黑松木塊木質(zhì)纖維素含量的影響

2.4 不同方式接種木腐真菌后疫木內(nèi)松材線蟲數(shù)量的變化

接種不利于松材線蟲生長繁殖且具有降解松木塊能力的木腐真菌液體培養(yǎng)菌絲和固體培養(yǎng)菌絲150 d后，取樣分離疫木內(nèi)松材線蟲數(shù)量，接種前后取樣的誤差均在5%以內(nèi)，比較接種前后疫木內(nèi)線蟲數(shù)量的變化(圖4)。由圖4可知，接種5個木腐真菌后，兩種不同培養(yǎng)方式的菌絲均可使疫木內(nèi)松材線蟲數(shù)量顯著減少(接種液體培養(yǎng)菌絲：df=5，F(xiàn)=1 588.329，P<0. 05。接種固體培養(yǎng)菌絲：df = 5，F(xiàn)=752.951，P<0. 05)，同種木腐真菌以接種液體培養(yǎng)菌絲效果優(yōu)于接種固體培養(yǎng)菌絲的。這5個木腐真菌中，不論是液體培養(yǎng)菌絲還是固體培養(yǎng)菌絲接種，茯苓效果最顯著，線蟲數(shù)量減少率均達65%以上，其次效果較好的為黃孢原毛平革菌和B18菌株，均可使線蟲數(shù)量減少55% 以上。C11亦能使松材線蟲數(shù)量顯著減少，但減少率較小；而D16菌株固體培養(yǎng)菌絲處理后線蟲數(shù)量減少率與對照無顯著差異，說明此菌接種疫木后對其中線蟲的數(shù)量變化影響不大。

圖4 接種兩種培養(yǎng)方式木腐菌絲150 d后松材線蟲的數(shù)量

2.5 接種液體培養(yǎng)木腐真菌菌絲后天牛蛀道松材線蟲數(shù)量的變化

將液體培養(yǎng)菌絲接種于疫木150 d后，用斧頭將疫木劈開，收集天牛蛀道周圍的木樣，不同天牛蛀道周圍的木樣內(nèi)松材線蟲數(shù)量見圖5。由圖5可知，不同木腐真菌處理疫木后，天牛蛀道周圍的木材線蟲數(shù)量減少率各異。接種茯苓菌后可使天牛蛀道周圍的木材中松材線蟲數(shù)量減少最多，減少率達65.45%。其次接種效果較好的為B18和黃孢原毛平革菌，可分別減少疫木內(nèi)松材線蟲數(shù)量55% 和57%。接種C11菌株的可減少47%，接種D16菌株的減少16%(對照在同期減少12%)。由此可知，接種茯苓、黃孢原毛平革菌、B18和C11后可減少木材中天牛蛀道周圍的松材線蟲數(shù)量。

圖5 接種液體培養(yǎng)木腐菌絲150 d后天牛蛀道周圍松材線蟲數(shù)量

3 討 論

本研究通過將松材線蟲接種于培養(yǎng)成熟的木腐菌菌落上，構(gòu)成松材線蟲與木腐菌的微小生態(tài)系統(tǒng)，使兩者之間形成共生、拮抗、競爭和捕食寄生的關(guān)系[19]。研究發(fā)現(xiàn)包括茯苓菌在內(nèi)的5種真菌可不同程度地抑制松材線蟲的生長繁殖，其中茯苓菌的抑制作用最強。陳瑤等[16]研究亦發(fā)現(xiàn)，松材線蟲也完全不能在茯苓菌落上存活。自然界中亦存在對松材線蟲有不良作用的其他菌株，如總狀共頭霉(Syncephalastrumracemosum)[20]、日本亮耳(Lampteromycesjaponicus)[21]可較好抑制松材線蟲的活性，少孢節(jié)叢孢(Arthrobotrysoligospora)[22]可捕食松材線蟲，但是很多研究僅停留在室內(nèi)實驗，有待應用于田間驗證。

松材線蟲病的疫木除害處理一直是松材線蟲病防控技術(shù)中的難點和要點，疫木處理的效果直接關(guān)系到松材線蟲病防治的成效[14-15]。當前疫木的就地除害處理或異地除害處理方法，均存在一定的缺陷，如就地處理存在難度大、成本高等難點，異地處理存在容易傳播擴散及除害效果難以管控等難題[23-25]。將木腐菌接種于疫木上，木腐真菌通過侵染疫木，改變疫木內(nèi)的微生境從而使松材線蟲數(shù)量減少。在兩種培養(yǎng)接種方式中，以液體培養(yǎng)菌絲接種效果明顯優(yōu)于固體培養(yǎng)菌絲，可能是因為液體培養(yǎng)菌絲接種，可增加疫木接種部位濕度，為木腐菌的生長提供了良好環(huán)境，有利于木腐菌的定殖和擴展。接種不同木腐真菌后減除線蟲效果不一，其中茯苓菌減除線蟲數(shù)量效果最佳，這與胡賽蓉等[26]、澤桑梓等[27]、吳云忠[28]研究結(jié)果相似。松材線蟲由南向北擴散過程中，在低溫條件下具有更強的繁殖能力和對低溫的適應性[29]。木腐真菌的最適生長溫度為25～30 ℃，而疫木的處理主要在天牛羽化前進行，此時溫度還比較低，可開展菌株的低溫馴化實驗，使菌株在低溫下仍能快速繁殖，從而達到更好的除治效果。

松材線蟲有向天牛蛹室聚集的效應[30]。本研究發(fā)現(xiàn)木腐真菌不僅具有消減松材線蟲種群數(shù)量的作用，還可大大減少松材線蟲向蛹室聚集。松墨天牛在羽化后開始傳播線蟲，且傳播擴散時間持續(xù)16～30 d后結(jié)束[31]。但是接種木腐菌后疫木中的線蟲不能向蛹室聚集，使得線蟲無法通過媒介昆蟲傳播到其他健康松樹上完成侵染循環(huán)，病害的傳播擴展就可以得到有效控制。綜上分析，應用不利于松材線蟲生長和繁殖的木腐真菌進行松材線蟲病的疫木除治具有技術(shù)可行性和應用前景，值得進一步深入開發(fā)研究。未來可通過菌株的低溫馴化，構(gòu)建復合菌，加大接種量或提早接種使木腐菌與疫木作用時間更長，從而達到消減疫木內(nèi)松材線蟲數(shù)量的效果。

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