康婦炎膠囊治療盆腔炎性疾病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制分析

樊亞東，張曉雨，王惠津*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津 301617； 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300380）

盆腔炎性疾?。╬elvic inflammatory disease，PID）是一種累及女性上生殖道及其周圍組織包括：子宮內(nèi)膜、輸卵管、卵巢或盆腔腹膜的感染性疾病［1］。PID的遷延不愈和反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致長期的生殖障礙如不孕癥、異位妊娠和慢性盆腔疼痛等，嚴重影響女性生活質(zhì)量及生殖健康［2］。廣譜抗菌、抗感染、必要的微創(chuàng)介入和手術(shù)治療仍是PID的主要治療手段，然而仍然存在見效慢、抗菌藥物耐藥性和不良反應(yīng)多等問題［3］。

中醫(yī)治療PID積累了豐富的臨床經(jīng)驗，治療效果良好且不良反應(yīng)少［4］。根據(jù)PID的臨床特點將其歸屬于中醫(yī)“帶下病”、“癥瘕”、“婦人腹痛”等范疇，其病機為濕熱毒邪瘀結(jié)胞宮，氣血相搏損耗，導(dǎo)致沖任受損，瘀血阻滯脈絡(luò)［5-6］。中醫(yī)辨證分型可分為：氣滯血瘀、濕熱瘀阻、肝郁脾虛和脾腎陽虛等型［3,7］。山東步長神州制藥有限公司生產(chǎn)的中藥康婦炎膠囊（國藥準字Z20055634）由經(jīng)典名方當歸芍藥散、薏苡附子敗醬散和二妙散化裁而來。全方共11味中藥，組方中香附、川芎、赤芍、延胡索、當歸化瘀行滯止痛，白花蛇舌草、蒲公英清熱解毒，澤瀉、薏苡仁、敗醬草、蒼術(shù)除濕止帶，臨床常用于PID、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、附件炎、陰道炎等婦科炎癥疾病的治療?？祴D炎膠囊能有效改善濕熱蘊結(jié)型PID患者的中醫(yī)證候，降低疼痛程度及改善肌體免疫水平［8］?？祴D炎膠囊能夠提高PID患者臨床治療總有效率，縮短癥狀消失時間，且不良反應(yīng)輕微，值得臨床推廣應(yīng)用［9］。目前，康婦炎膠囊已入選中華中醫(yī)藥學(xué)會《中醫(yī)婦科常見病診療指南》帶下病、盆腔炎推薦用藥目錄，中成藥優(yōu)勢病種（盆腔炎）推薦用藥目錄［10］。

然而，康婦炎膠囊治療PID的藥理學(xué)作用機制仍不清晰，很大程度地阻礙了本藥的現(xiàn)代化研究進展和臨床應(yīng)用。隨著中醫(yī)藥信息和組學(xué)研究數(shù)據(jù)的不斷完善和豐富，中藥復(fù)方現(xiàn)代化研究正飛速發(fā)展［11］。以中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，從藥物-疾病相互作用的系統(tǒng)性出發(fā)，構(gòu)建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，虛擬篩選潛在活性物質(zhì)、作用靶點和通路的中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成為研究中藥復(fù)方研究的重要手段［12-13］。因此本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探索和闡述康婦炎膠囊治療PID的潛在機制，并為進一步的藥理學(xué)機制研究和驗證提供依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)來源與方法

1.1 PID相關(guān)靶點獲取 在OMIM（www.omim.org）、Drugbank（www.drugbank.com）和GeneCards（www.genecards.org）（設(shè)置Relevance score≥20）數(shù)據(jù)庫中，以“pelvic inflammatory disease”、“pelvic infection”、“pelvic inflammation”和“PID”等為檢索詞分別獲取和整合盆腔炎性疾病相關(guān)靶點。

1.2 康婦炎膠囊成分與靶點挖掘 使用Batman-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數(shù)據(jù)庫挖掘康婦炎膠囊（白花蛇舌草、蒲公英、澤瀉、延胡索、香附、川芎、當歸、薏苡仁、赤芍、敗醬草、蒼術(shù)）單味中藥的化學(xué)成分。設(shè)置化合物靶點預(yù)測的閾值（score cutoff＞20）篩選康婦炎膠囊單味藥的潛在藥物靶點。使用Uniport數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，對篩選出的靶點進行規(guī)范轉(zhuǎn)化。

1.3 建立康婦炎膠囊治療PID的中藥-成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò) 將康婦炎膠囊中藥化學(xué)成分靶點與PID靶點取交集，得到康婦炎膠囊治療疾病的作用靶點，并通過String Version 11.0平臺（https：//string-db.org/）構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。選取分值＞0.9分的高置信度區(qū)間蛋白，并根據(jù)自由度值（≥10）篩選關(guān)鍵藥物作用靶點。將康婦炎膠囊單味藥、化學(xué)成分、作用靶點信息導(dǎo)入Cytoscape 3.4.0軟件繪制中藥-成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 康婦炎膠囊治療PID的通路和功能注釋分析利用KOBAS3.0在線基因富集網(wǎng)站（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/）對康婦炎膠囊治療PID的關(guān)鍵靶點進行通路和功能注釋分析。

1.5 康婦炎膠囊關(guān)鍵藥物作用靶點組織和亞細胞分布分析 將康婦炎膠囊治療PID的關(guān)鍵藥物作用靶點分別導(dǎo)入BioGPS和Genecards數(shù)據(jù)庫中獲得組織和亞細胞分布相關(guān)信息，并進行可視化繪圖。

2 結(jié)果

2.1 康婦炎膠囊治療PID的作用靶點的獲取 檢索數(shù)據(jù)庫得到PID靶點為389個。收集康婦炎膠囊化合物成分和靶點信息見表1。將康婦炎膠囊化學(xué)成分的1 582個靶點與PID靶點取交集，獲得康婦炎膠囊治療PID的136個作用靶點。見圖1。

表1 康婦炎膠囊化合物和靶點情況

圖1 康婦炎膠囊和PID靶點情況

2.2 建立康婦炎膠囊中藥-成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò) 將136個作用靶點導(dǎo)入String Version 11.0平臺進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，根據(jù)自由度篩選得到29個關(guān)鍵作用靶點并進行可視化繪圖，見表2及圖2。將康婦炎膠囊11個單味中藥、168個化學(xué)成分和29個靶點信息導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制中藥-成分、成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)圖。采用Merge功能合并網(wǎng)絡(luò)，對單味中藥、成分和靶點進行標識。如圖3所示，節(jié)點表示單味中藥、成分和靶點，邊表示三者彼此間的關(guān)聯(lián)。其中八邊形節(jié)點表示單味中藥，V形節(jié)點表示化學(xué)成分，圓形節(jié)點表示關(guān)鍵作用靶點。

圖2 康婦炎膠囊治療PID關(guān)鍵作用靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.3 康婦炎膠囊治療PID的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制分析 將29個康婦炎膠囊治療PID的關(guān)鍵靶點導(dǎo)入KOBAS 3.0網(wǎng)站，通過“KEGG通路富集分析”和“GO功能富集分析”模塊分別進行通路和功能分析，結(jié)果見圖4。X軸表示靶點富集通路，Y軸表示富集的通路或功能的相關(guān)靶點數(shù)目及顯著性度值。結(jié)果顯示：在預(yù)測通路機制層面，流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、C-型凝集素受體信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、T細胞受體信號通路、IL-17信號通路、Toll樣受體信號通路、Jak-STAT信號通路、內(nèi)分泌抵抗、Th17細胞分化、凋亡、MAPK信號通路、Th1和Th2細胞分化、細胞因子信號通路、細胞因子間受體互作、炎癥介質(zhì)對瞬時受體電位離子通道的調(diào)節(jié)、NF-κB信號通路、自噬、胰島素信號通路等可能是康婦炎膠囊發(fā)揮治療PID作用的重要信號通路。在生物功能層面，29個關(guān)鍵靶點與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自噬、凋亡相關(guān)功能、細胞因子產(chǎn)生、免疫細胞（白細胞、淋巴細胞、T細胞、巨噬細胞）活化、分化和增殖、細菌和病毒抵抗等密切相關(guān)。

圖4 康婦炎膠囊治療PID相關(guān)通路（A）和功能(B)分析

2.4 康婦炎膠囊治療PID關(guān)鍵作用靶點組織和亞細胞分布情況 將29個康婦炎膠囊治療PID關(guān)鍵作用靶點導(dǎo)入BioGPS數(shù)據(jù)庫，獲得其組織分布信息。保留每個基因表達量較高的前4位組織，將組織分布信息導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建組織-靶點網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖5-A。其中菱形節(jié)點表示組織，節(jié)點表示度值大小，圓形節(jié)點表示靶點。結(jié)果顯示，心肌細胞（度值=8）、眾多免疫細胞包括：CD33+髓細胞（度值=7）、B淋巴細胞（度值=6）、BDCA4+樹突細胞（度值=5）、CD4+T細胞（度值=4）、CD56+NK細胞（度值=4）、CD19+B細胞（度值=4）、CD8+T細胞（度值=2）、CD14+單核細胞（度值=1）、肝臟（度值=6）、（胚胎）肺臟（度值=5和4）、子宮及附件（度值=4和2），在康婦炎膠囊治療PID的過程中發(fā)揮重要作用，能為進一步的分子驗證提供方向。

將上述29個關(guān)鍵作用靶點導(dǎo)入Genecards數(shù)據(jù)庫，獲取和保留confidence大于5的各靶點亞細胞分布信息。采用Cytoscape軟件構(gòu)建亞細胞-靶點網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖5-B。其中八形節(jié)點代表靶點，三角形節(jié)點代表亞細胞結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，靶點更多分布于胞外區(qū)（度值=16）、細胞核（度值=14）、細胞質(zhì)（度值=13）、胞外區(qū)、細胞膜（度值=13），可能為藥物作用的重要細胞結(jié)構(gòu)。

圖5 29個康婦炎膠囊治療PID關(guān)鍵作用靶點組織-靶點網(wǎng)絡(luò)（A）和亞細胞-靶點網(wǎng)絡(luò)(B)

3 討論

PID是臨床常見婦科疾病，主要見腰骶酸痛、下腹墜脹疼痛不適、月經(jīng)不調(diào)、陰道分泌物增多，因其抗生素及激素類藥物干預(yù)效果的不理想，以及較高的并發(fā)癥發(fā)病率和復(fù)發(fā)率，嚴重影響患者工作和身心健康［14］。中醫(yī)辨證論治以活血化瘀為總綱，重視臟腑調(diào)理，中西醫(yī)結(jié)合治療PID取得了較為滿意的臨床收益［15-16］。Meta分析結(jié)果表明：抗菌藥物基礎(chǔ)治療上加用康婦炎膠囊，可提高PID臨床療效，減少后遺癥的發(fā)生且不增加不良反應(yīng)［2］。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，挖掘康婦炎膠囊治療PID的潛在168個化學(xué)成分和29個關(guān)鍵治療靶點。結(jié)合KEGG通路和GO功能富集分析結(jié)果表明，康婦炎膠囊可能通過流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化相關(guān)信號通路、內(nèi)分泌抵抗、胰島素信號通路改善血流變，調(diào)節(jié)免疫細胞及相關(guān)細胞因子信號通路（C-型凝集素受體信號通路、PI3K-Akt信號通路、Jak-STAT信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路、Th17細胞分化、Th1和Th2細胞分化）調(diào)節(jié)肌體組織細胞凋亡、氧化應(yīng)激、自噬和炎癥水平，進而發(fā)揮抵抗細菌和病毒，治療PID的作用。PID發(fā)病機制復(fù)雜，但與肌體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［1］。臨床療效研究表明，康婦炎膠囊聯(lián)合敏感抗生素能顯著減輕慢性盆腔炎炎癥反應(yīng)，改善子宮動脈血流動力學(xué)［17］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，康婦炎膠囊中潛在化合物如：丹皮酚可抑制肌體免疫炎癥和水腫滲出，白花蛇舌草總黃酮能降低毛細血管通透性，蒲公英提取物可抑制白細胞浸潤減少炎性因子釋放［4］。

值得注意的是，康婦炎膠囊對眾多免疫細胞如T細胞的活化、分化和增殖具有重要的調(diào)節(jié)作用。靶點組織和亞細胞分布情況結(jié)果表明，康婦炎膠囊治療PID的關(guān)鍵作用靶點傾向分布于眾多的免疫細胞、子宮及其附件上，靶點更多分布于胞外區(qū)，提示細胞因子及因子間受體相互作用在本藥治療PID中的重要作用，與KEGG通路和GO功能分析結(jié)果一致，符合其作用的生理學(xué)基礎(chǔ)。已有研究也證實，康婦炎膠囊能夠增強肌體免疫抗炎功能，降低CD8+亞群比例，提高CD4+和CD4+/CD8+表達［18-19］。此外康婦炎膠囊還可抑制中性粒細胞產(chǎn)生活性氧、髓過氧化物酶，調(diào)節(jié)中性粒細胞殺菌方式，減少組織損傷［20］。這些結(jié)果進一步證實了本研究結(jié)果的可靠性，研究結(jié)果可為深入的調(diào)節(jié)機制的研究提供前期基礎(chǔ)和思路參考。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法挖掘證實：康婦炎膠囊可能通過調(diào)節(jié)血流變，調(diào)控免疫細胞及相關(guān)細胞因子信號通路，改善肌體組織細胞凋亡、氧化應(yīng)激、自噬和炎癥水平，治療PID。本研究結(jié)果具有網(wǎng)絡(luò)分析的局限性，未來我們可基于此，對康婦炎膠囊治療PID的藥理學(xué)機制進行深入挖掘及驗證。