制備方法對乳清分離蛋白-綠原酸共價接枝物結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響

陳衛(wèi)軍，劉東紅，李云成，孟凡冰，劉達(dá)玉

（1.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）是生產(chǎn)干酪、酪蛋白等產(chǎn)品的副產(chǎn)物，主要成分為β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-La）、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）等[1]。WPI營養(yǎng)價值高且具有優(yōu)良的乳化性、凝膠性、起泡性和配體結(jié)合性等多種功能性質(zhì)，不僅常作為一種功能性和活性成分廣泛應(yīng)用于食品中[2]，也越來越多地作為載體材料用于構(gòu)建生物活性物質(zhì)的傳遞體系[3]。基于WPI可以構(gòu)建乳液、納米復(fù)合物、凝膠等多種傳遞體系，但以單一蛋白質(zhì)構(gòu)建的傳遞體系通常存在化學(xué)穩(wěn)定性較差、被包埋的生物活性物質(zhì)容易發(fā)生氧化降解等不足[4]。研究證實，多酚的共價接枝可以賦予蛋白質(zhì)優(yōu)良的抗氧化活性，形成的蛋白質(zhì)-多酚共價接枝物可作為一種抗氧化性載體材料，其構(gòu)建的傳遞體系能夠有效提高被包埋生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性[5]。

多酚可以通過非酶促和酶促反應(yīng)與蛋白質(zhì)發(fā)生共價接枝，常用的方法有堿法、自由基法和酶法，不同方法所涉及的反應(yīng)機(jī)理不同。其中，堿法和酶法是指在有氧條件下，多酚分別在堿性條件或酶的催化作用下首先被氧化成相應(yīng)的醌，然后與蛋白質(zhì)分子中的親核試劑（如賴氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和色氨酸等）結(jié)合，形成蛋白質(zhì)-多酚共價接枝物。自由基法則是指通過自由基引發(fā)劑產(chǎn)生的自由基使蛋白質(zhì)分子活化，活化的蛋白質(zhì)分子再與多酚結(jié)合形成共價接枝物[6]。蛋白質(zhì)和多酚的接枝反應(yīng)過程十分復(fù)雜，反應(yīng)底物和接枝方法都會影響產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，進(jìn)而影響其在傳遞體系構(gòu)建中的應(yīng)用。因此，需要系統(tǒng)研究底物種類、結(jié)構(gòu)、分子大小等在不同條件下接枝對接枝物結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響，以進(jìn)一步明確其構(gòu)效關(guān)系，為定向制備功能性專一的接枝物提供依據(jù)。

綠原酸（chlorogenic acid，CA）是一種廣泛分布于食用植物中的膳食多酚，具有優(yōu)良的抗氧化活性和多種生物學(xué)特性[7]。據(jù)報道，CA的共價接枝能夠顯著改善蛋清蛋白、乳鐵蛋白、β-Lg等蛋白質(zhì)的抗氧化活性，進(jìn)而增強(qiáng)其構(gòu)建傳遞體系的化學(xué)穩(wěn)定性[4,6,8]。但是，關(guān)于CA與蛋白質(zhì)的共價接枝多采用單一方法進(jìn)行，不同方法之間的系統(tǒng)比較尚鮮見報道。因此，本實驗以WPI和CA為原料，分別采用堿法、自由基法和酶法誘導(dǎo)其共價接枝，系統(tǒng)比較不同方法制備的WPI-CA共價接枝物在接枝效率、結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)上的差異，以期為制備理想的抗氧化性載體材料以用于傳遞體系的構(gòu)建提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)93%、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.5%、乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%） 美國Hilmar公司；CA（純度98%）、多酚氧化酶（活力≥500 U/mg干質(zhì)量）、水溶性VE（Trolox）、三吡啶基三嗪（2,4,6-tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazine，TPTZ）、2,2’-偶氮-二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）（純度98%） 上海市阿拉丁試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）、福林-酚（H＋濃度2 mol/L）、5,5’-二硫硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate，ABTS）、8-苯氨基萘-1-磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma-Aldrich公司；o-鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、過硫酸鉀、H2O2溶液（體積分?jǐn)?shù)30%）、硝酸、Tris、甘氨酸、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、脲、碳酸鈉、乙酸、甲醇、三氯化鐵（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司；J1500圓二色光譜儀 日本Jasco公司；Cary Eclipse熒光分光光度計 美國瓦里安公司；ZCEC-130263F差示掃描量熱儀、FE20K pH計、GB204電子天平瑞士Mettler Toledo公司；UV-2550紫外-可見分光光度計日本島津公司；MultiskanTMGO酶標(biāo)儀 美國Thermo Scientific公司；磁力攪拌器 金壇市富華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WPI-CA共價接枝物的制備

堿法和自由基法接枝均參考劉夫國[6]的方法，酶法接枝參考Prigent等[9]的方法。

堿法接枝：以超純水溶解制備質(zhì)量濃度20 mg/mL的WPI溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%疊氮化鈉溶液抑制微生物生長。采用0.2 mol/L NaOH溶液將WPI溶液pH值調(diào)節(jié)至9.0，4 ℃下溶脹過夜。取pH 9.0 WPI溶液與0.70 mmol/L CA溶液（超純水配制）等體積混合，再次調(diào)節(jié)pH值至9.0。該混合液于室溫下敞口攪拌反應(yīng)24 h，然后轉(zhuǎn)移至透析袋（截留分子質(zhì)量3 500 Da）內(nèi)，4 ℃下于超純水中透析48 h（每隔6 h換一次超純水）。透析后的溶液冷凍干燥即得WPI-CA共價接枝物。

自由基法接枝：以超純水溶解制備質(zhì)量濃度10 mg/mL的WPI溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%疊氮化鈉溶液抑制微生物生長，4 ℃下溶脹過夜。向100 mL上述溶液中依次加入1 mL 5 mol/L H2O2溶液和0.25 g VC，室溫下反應(yīng)2 h。然后向反應(yīng)液中加入一定量CA使其終濃度為0.35 mmol/L，繼續(xù)反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后將溶液轉(zhuǎn)移至透析袋（截留分子質(zhì)量3 500 Da）內(nèi)，4 ℃下于超純水中透析48 h（每隔6 h換一次水），透析后的溶液冷凍干燥即得WPI-CA共價接枝物。

酶法接枝：以超純水溶解制備質(zhì)量濃度10 mg/mL的WPI溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%疊氮化鈉抑制微生物生長，于4 ℃下溶脹過夜。向WPI溶液中加入一定量的多酚氧化酶（10 U/mL），用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，室溫下攪拌2 h。向反應(yīng)液中加入一定量CA使其終濃度為0.35 mmol/L，繼續(xù)反應(yīng)24 h后加入5 μmol/L NaHSO3終止反應(yīng)。然后將溶液轉(zhuǎn)移至透析袋（截留分子質(zhì)量3 500 Da）內(nèi)，4 ℃下于超純水中透析48 h（每隔6 h換一次水），透析后的溶液冷凍干燥即得WPI-CA共價接枝物。

所得3 種WPI-CA共價接枝物均通過凱氏定氮法測定其中的WPI含量，用于后續(xù)實驗樣品溶液配制。

1.3.2 自由氨基含量的測定

參考文獻(xiàn)[10]報道的OPA法測定樣品自由氨基含量。OPA試劑的配制（現(xiàn)配現(xiàn)用）：將40 mg OPA溶于1 mL甲醇，與25 mL 10 mmol/L四硼酸鈉溶液、2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% SDS溶液和0.1 mLβ-巰基乙醇混合后用超純水定容至50 mL。將4 mL OPA試劑與0.2 mL樣品溶液（WPI質(zhì)量濃度0.2 mg/mL）混合后于35 ℃下反應(yīng)2 min，然后測定其在340 nm波長處的吸光度。以L-賴氨酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中自由氨基含量。

1.3.3 巰基含量的測定

參考Chen Weijun等[11]的方法測定樣品中巰基含量。用Tris-甘氨酸緩沖液（86 mmol/L Tris、90 mmol/L甘氨酸、4 mmol/L EDTA、8 mol/L尿素和0.5 g/100 mL SDS，pH 8.0）配制WPI質(zhì)量濃度為2 mg/mL的樣品溶液。將5 mL樣品溶液與0.05 mL Ellman試劑（含4 mg/mL DTNB的Tris-甘氨酸緩沖液）混合，室溫下避光反應(yīng)1 h后測定其在412 nm波長處的吸光度（A412nm）。巰基含量按式（1）計算。

式中：ρ為樣品溶液中WPI質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.4 游離色氨酸含量的測定

向0.9 mL 1 mg/mL樣品溶液中加入1 mL 16 mol/L硝酸溶液，混合后于50 ℃下水浴加熱15 min，快速冷卻后依次加入4 mL 5 mol/L氫氧化鈉溶液和4 mL無水乙醇，充分混合后分別于360 nm和430 nm波長處測定吸光度。色氨酸質(zhì)量濃度按式（2）計算。

1.3.5 CA接枝量的測定

采用福林-酚法測定接枝物中CA接枝量。將0.5 mL 1 mg/mL樣品溶液與2.5 mL福林-酚試劑混合后于室溫下避光反應(yīng)5 min，向混合液中加入2 mL 7.5 g/100 mL碳酸鈉溶液，漩渦混勻后繼續(xù)避光反應(yīng)2 h，然后測定反應(yīng)液在760 nm波長處的吸光度。樣品溶液吸光度需扣除相同質(zhì)量濃度WPI溶液在相同反應(yīng)條件下的吸光度。通過CA標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中CA含量，結(jié)果用每克樣品所含CA物質(zhì)的量表示，單位為μmol/g。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

將2 mg樣品與0.5 g溴化鉀充分混勻、研磨、壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。分辨率設(shè)置為4 cm－1，結(jié)果采用OMNIC軟件導(dǎo)出。

1.3.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

參考Chen Weijun等[12]的方法，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析接枝對蛋白分子質(zhì)量的影響。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%濃縮膠和12%分離膠，以Tris-甘氨酸緩沖液（pH 8.3）作為電泳液。樣品溶液（2 mg/mL）經(jīng)上樣緩沖液稀釋5 倍后于沸水中加熱5 min，冰浴冷卻后取適量樣品上樣。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色凝膠，以脫色液（V（甲醇）∶V（冰乙酸）∶V（水）＝5∶4∶1）進(jìn)行脫色。

1.3.8 圓二色光譜分析

參考Yin Zhucheng等[13]的方法分析樣品二級結(jié)構(gòu)，并做適當(dāng)調(diào)整。取適量樣品溶于pH 7.0 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中得到WPI質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的樣品溶液，室溫下用圓二色光譜儀在190～260 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描速率50 nm/min，比色皿光程1 mm。以PBS作為空白，WPI二級結(jié)構(gòu)組成采用DichroWeb數(shù)據(jù)庫分析。

1.3.9 內(nèi)源熒光光譜分析

取適量樣品溶于pH 7.0 10 mmol/L PBS中得到WPI質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的樣品溶液，室溫下用熒光分光光度計分析其內(nèi)源熒光光譜。激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長范圍300～450 nm，狹縫寬度均設(shè)置為5 nm。

1.3.10 表面疏水性測定

采用ANS熒光探針法分析[14]。用10 mmol/L PBS（pH 7.0）配制WPI質(zhì)量濃度為0.005～0.5 mg/mL的樣品溶液。向4 mL樣品溶液中加入50 μL 8 mmol/L ANS溶液，混勻后在激發(fā)熒光波長365 nm下測定發(fā)射波長484 nm處的熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度對WPI質(zhì)量濃度作圖，所得曲線初始段斜率即為WPI表面疏水性指數(shù)（H0）。

1.3.11 熱學(xué)特性分析

參考文獻(xiàn)[6]的方法采用差示掃描量熱儀測定樣品的熱學(xué)特性。稱取約6.0 mg樣品置于鋁盤中并密封，鋁蓋中央扎孔，以空盤作為對照。氮氣流速30 mL/min，升溫范圍3～160 ℃，升溫速率10 ℃/min。利用TA60軟件分析樣品的變性溫度。

1.3.12 抗氧化活性分析

樣品抗氧化活性的測定參考支梓鑒[15]的方法，并作適當(dāng)修改。

DPPH自由基清除能力：將0.5 mg/mL樣品溶液與0.2 mol/L DPPH-乙醇溶液等體積混合，室溫下避光反應(yīng)30 min后測定其在517 nm波長處吸光度。

鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）：將0.1 μmol/L乙酸緩沖液（pH 3.6）、0.02 μmol/L三氯化鐵和0.01 μmol/L TPTZ溶液（用0.04 μmol/L鹽酸配制）按體積比10∶1∶1混合制備Fe3＋-TPTZ試劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。將0.5 mg/mL樣品溶液與Fe3＋-TPTZ試劑等體積混合，37 ℃下振蕩反應(yīng)10 min后測定其在593 nm波長處的吸光度。

ABTS陽離子自由基清除能力：將18 mg ABTS和4 mg過硫酸鉀分別溶于4 mL超純水中，二者混合搖勻后避光反應(yīng)16 h得ABTS儲備液。取3 mL ABTS儲備液用無水乙醇定容至100 mL得到ABTS工作液。將1 mL 0.5 mg/mL樣品溶液與3 mL ABTS工作液混合，室溫下反應(yīng)1 h后測定混合溶液在734 nm波長處的吸光度。

氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）：用75 mmol/L PBS（pH 7.4）配制質(zhì)量濃度0.2 mg/mL樣品溶液和40 mg/mL AAPH溶液。將50 μL樣品溶液和50 μL 0.5 μmol/L熒光素鈉鹽溶液混合于黑色96 孔板中，37 ℃下孵育15 min后迅速加入100 μL AAPH溶液，振蕩5 s，用酶標(biāo)儀于激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長538 nm下每2 min測定一次熒光強(qiáng)度，共測定2 h。通過軟件計算熒光素鈉鹽熒光衰變曲線下積分面積。

4 種方法分別建立Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有結(jié)果均以每克樣品所含Trolox物質(zhì)的量表示，單位為μmol/g。

1.3.13 乳化特性分析

參考文獻(xiàn)[11]報道的方法測定接枝物乳化性質(zhì)。用10 mmol/L PBS（pH 7.0）溶解樣品，制備WPI質(zhì)量濃度2.0 mg/mL的樣品溶液。取15 mL樣品溶液加入5 mL大豆油，13 500 r/min均質(zhì)2 min后分別于0 min和10 min從底部取100 μL乳液，用質(zhì)量濃度0.1 g/100 mL SDS溶液稀釋100 倍后于500 nm波長處測定其吸光度。分別根據(jù)式（3）、（4）計算其乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsion stability index，ESI）。

式中：A0和A10分別為均質(zhì)后0 min和10 min時的吸光度；ρ為WPI質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為油相體積分?jǐn)?shù)/%；n為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均設(shè)置3 組平行，所得數(shù)據(jù)采用SPSS 22軟件以鄧肯新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析，顯著水平為5%，運(yùn)用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 WPI和WPI-CA接枝物中反應(yīng)基團(tuán)含量和接枝量分析結(jié)果

據(jù)報道，多酚可與蛋白分子中的自由氨基、色氨酸和游離巰基等發(fā)生共價結(jié)合而形成蛋白質(zhì)-多酚共價接枝物[16]。因此，本實驗測定反應(yīng)前后這3 種反應(yīng)基團(tuán)含量的變化。由表1可知，與WPI相比，接枝物的自由氨基、色氨酸和游離巰基含量均顯著降低（P＜0.05）。自由氨基含量測定中使用的SDS會破壞蛋白分子間的非共價相互作用，而在游離巰基分析中使用的尿素可以抑制巰基向二硫鍵的轉(zhuǎn)換。因此，共價接枝物中自由氨基、色氨酸和游離巰基含量的降低表明這些基團(tuán)與CA發(fā)生了共價結(jié)合。這3 種反應(yīng)基團(tuán)中自由氨基參與共價結(jié)合的量最多，這可能是因為其在WPI中的含量最高。本實驗結(jié)果與文獻(xiàn)[5,17]報道的結(jié)果一致。與WPI相比，不同方法制備的接枝物中各反應(yīng)基團(tuán)的減少量從高到低依次為酶法接枝物＞堿法接枝物＞自由基法接枝物。劉夫國[6]發(fā)現(xiàn)，在制備乳鐵蛋白-CA接枝物時堿法的接枝率明顯高于自由基法。這可能是因為不同制備方法的反應(yīng)原理和反應(yīng)條件不同。

表1 WPI和WPI-CA接枝物中自由氨基、色氨酸、游離巰基含量和CA接枝量Table 1 Free amino, tyrosine and thiol group and CA contents of WPI and WPI-CA conjugates

由表1可知，WPI-CA接枝物中CA接枝量與反應(yīng)基團(tuán)含量變化趨勢相反，即參與反應(yīng)的氨基酸基團(tuán)越多，CA接枝量越高。以堿法、自由基法和酶法制備的接枝物中CA接枝量分別為（52.70±1.81）、（42.57±1.85）μmol/g和（63.75±2.50）μmol/g。表明酶法在誘導(dǎo)WPI與CA的共價接枝反應(yīng)中效率最高，其次為堿法和自由基法。

2.2 WPI和WPI-CA接枝物的傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

由圖1可知，WPI光譜中在3 289、2 928、1 651 cm－1和1 532 cm－1處的主要吸收峰分別代表其中存在的酰胺A帶（N—H伸縮）、酰胺B帶（C—H伸縮）、酰胺I帶（C＝O伸縮）和酰胺II帶（N—H彎曲和C—N伸縮）[18]。與WPI相比，采用堿法、自由基法和酶法制備的WPI-CA共價接枝物位于3 289 cm－1處的吸收峰分別發(fā)生了10、4 cm－1和15 cm－1的紅移，而位于1 532 cm－1處的吸收峰均發(fā)生了6 cm－1的紅移，說明WPI的氨基參與了接枝反應(yīng)。這與文獻(xiàn)[6]報道的結(jié)果一致。

圖1 WPI和WPI-CA接枝物的傅里葉變換紅外光譜Fig. 1 Fourier transform infrared spectra of WPI and WPI-CA conjugates

2.3 WPI和WPI-CA接枝物的SDS-PAGE分析結(jié)果

由圖2可知，WPI主要存在α-La和β-Lg兩種蛋白條帶。與WPI相比，WPI-CA接枝物中α-La和β-Lg的條帶均輕微向上遷移，說明CA的接枝使WPI分子質(zhì)量增大，且每個蛋白分子共價連接的CA數(shù)量有限。這些高分子質(zhì)量的接枝物并未被電泳過程中使用的SDS或β-巰基乙醇所分解，說明WPI-CA接枝物是由WPI與CA通過共價鍵結(jié)合而形成[19]。相關(guān)研究指出，α-La/溶菌酶/BSA/乳鐵蛋白-CA接枝物中約共價結(jié)合有2～4 個CA分子[9,17]，與本實驗結(jié)果類似。

圖2 WPI和WPI-CA接枝物的電泳圖譜Fig. 2 SDS-PAGE profiles of WPI and WPI-CA conjugates

2.4 WPI和WPI-CA接枝物的圓二色光譜分析結(jié)果

采用圓二色光譜分析CA的共價接枝對WPI二級結(jié)構(gòu)的影響，并通過DichroWeb數(shù)據(jù)庫分析WPI和WPI-CA接枝物的二級結(jié)構(gòu)含量。由表2可知，與WPI相比，WPI-CA接枝物的α-螺旋相對含量明顯降低，而無規(guī)卷曲相對含量明顯增加，說明CA的共價接枝導(dǎo)致WPI分子結(jié)構(gòu)的解聚。魏子淏[5]和Wu Xuli等[19]分別在β-Lg-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）和β-Lg-EGCG/CA接枝物的相關(guān)研究中證實了這一現(xiàn)象。此外，不同方法制備的WPI-CA接枝物二級結(jié)構(gòu)含量變化程度也不同。堿法和自由基法制備的WPI-CA接枝物二級結(jié)構(gòu)含量變化程度較大，而酶法制備WPI-CA接枝物二級結(jié)構(gòu)含量變化程度較小。這可能是不同接枝方法的反應(yīng)條件不同導(dǎo)致。堿法接枝過程中，由于反應(yīng)體系pH值長時間偏離WPI等電點，導(dǎo)致WPI分子產(chǎn)生部分不可逆的伸展，破壞其α-螺旋結(jié)構(gòu)，增加分子無序程度[20]。自由基法接枝體系中高活性羥自由基（·OH）進(jìn)攻蛋白質(zhì)分子則可能會引起α-螺旋向β-折疊和無規(guī)卷曲的轉(zhuǎn)變[21]。而酶法反應(yīng)條件溫和，pH值接近中性，所以其接枝物二級結(jié)構(gòu)含量變化最小。

表2 WPI和WPI-CA接枝物的二級結(jié)構(gòu)相對含量Table 2 Secondary structure contents of WPI and WPI-CA conjugates

2.5 WPI和WPI-CA接枝物的內(nèi)源熒光光譜分析結(jié)果

通過內(nèi)源熒光光譜分析蛋白質(zhì)熒光基團(tuán)周圍微環(huán)境的變化研究其三級結(jié)構(gòu)變化。蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光主要來自色氨酸和酪氨酸，這兩種氨基酸在280 nm激發(fā)波長下均能發(fā)射熒光[22]。由圖3可知，與WPI相比，WPI-CA接枝物的熒光強(qiáng)度明顯降低，其中酶法接枝物降低程度最大，其次為堿法接枝物。熒光強(qiáng)度的降低一方面是因為部分色氨酸參與了接枝反應(yīng)；另一方面則是因為CA的苯環(huán)與WPI熒光基團(tuán)相互作用對熒光產(chǎn)生猝滅作用[6]。雖然3 種接枝物中參與反應(yīng)的色氨酸殘基量沒有顯著差異（P＞0.05），但酶法接枝物中的CA接枝量最大（表1），因此對WPI熒光的猝滅作用也最強(qiáng)。此外，由圖3還可發(fā)現(xiàn)，CA的共價接枝使WPI的最大熒光發(fā)射波長紅移4～5 nm，該結(jié)果與Feng Jin等[23]的研究結(jié)果一致。說明與CA的接枝反應(yīng)改變了WPI的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其熒光基團(tuán)微環(huán)境極性增加[24]。

圖3 WPI和WPI-CA接枝物的內(nèi)源熒光光譜圖Fig. 3 Intrinsic fluorescence spectra of WPI and WPI-CA conjugates

2.6 WPI和WPI-CA接枝物的表面疏水性分析結(jié)果

采用ANS熒光探針法分析CA的共價接枝對WPI表面疏水性的影響。由圖4可知，堿法和酶法接枝會顯著降低WPI的H0（P＜0.05），而自由基法接枝則顯著提高WPI的H0（P＜0.05）。多酚的共價接枝對蛋白質(zhì)表面疏水性的影響主要有兩方面[25]：一是由于含有親水性羥基，多酚的共價接枝會增加蛋白質(zhì)的親水性；二是接枝過程中蛋白分子內(nèi)部的一些疏水性基團(tuán)可能會暴露，導(dǎo)致H0增加。因此，由于反應(yīng)條件不同，不同方法制備的WPI-CA接枝物H0變化趨勢不同。魏子淏[5]報道，采用堿法誘導(dǎo)EGCG的共價接枝會顯著降低乳蛋白的H0（P＜0.05）。Feng Jin等[23]研究則發(fā)現(xiàn)，與卵白蛋白相比，采用自由基法制備的卵白蛋白-兒茶素接枝物H0顯著升高（P＜0.05）。這可能是因為自由基法接枝過程中·OH的氧化作用會促進(jìn)蛋白質(zhì)分子解折疊，使分子內(nèi)部一些疏水性氨基酸暴露，導(dǎo)致其H0增加[26]。

圖4 WPI和WPI-CA接枝物的表面疏水性Fig. 4 Surface hydrophobicity of WPI and WPI-CA conjugates

2.7 WPI和WPI-CA接枝物的熱穩(wěn)定性分析結(jié)果

采用差示掃描量熱法分析CA共價接枝對WPI熱穩(wěn)定性的影響，由圖5可知，WPI的熱變性溫度為94.00 ℃，而堿法接枝物、自由基法接枝物和酶法接枝物的熱變性溫度分別為96.67、93.17 ℃和97.67 ℃，說明接枝方法會影響WPI-CA接枝物的熱穩(wěn)定性，這可能是因為不同接枝方法制備的接枝物結(jié)構(gòu)存在差異。Ali等[27]研究發(fā)現(xiàn)，采用酶法和堿法誘導(dǎo)5-咖啡?？崴岬墓矁r接枝會顯著提高β-Lg的熱變性溫度，但會導(dǎo)致其變性焓（ΔH）降低，推測這可能是因為5-咖啡?？崴岬墓矁r結(jié)合使β-Lg的某些區(qū)域部分展開，使得ΔH降低并提高其他區(qū)域的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致更高的熱變性溫度。劉夫國[6]在采用自由基法和堿法制備乳鐵蛋白-CA/EGCG/沒食子酸接枝物時也得出相似結(jié)論。但也有研究指出，堿法制備的BSA-CA接枝物[28]和自由基法制備的卵白蛋白-兒茶素接枝物[23]的熱變性溫度和ΔH均低于對照蛋白。綜上，蛋白質(zhì)-多酚共價接枝物的熱穩(wěn)定性不僅受制備方法的影響，還可能與底物種類相關(guān)。

圖5 WPI和WPI-CA接枝物的差示掃描量熱圖譜Fig. 5 Differential scanning calorimetric analyses of WPI and WPI-CA conjugates

2.8 WPI和WPI-CA接枝物的抗氧化活性分析結(jié)果

蛋白質(zhì)-多酚共價接枝物由于多酚的接入而具有優(yōu)良的抗氧化活性。由表3可知，WPI的抗氧化活性較弱，而CA的共價接枝可以將其抗氧化活性提高至1.29～27.79 倍，表明CA的共價接枝可以顯著增強(qiáng)WPI的抗氧化活性（P＜0.05）。不同方法所制備WPI-CA共價接枝物的抗氧化活性由大到小依次為酶法接枝物＞堿法接枝物＞自由基法接枝物，這與WPI-CA接枝物中的CA接枝量分析結(jié)果（表1）一致，表明蛋白質(zhì)-多酚接枝物的抗氧化活性取決于其多酚接枝量，這與文獻(xiàn)[6]的結(jié)果一致。

表3 WPI和WPI-CA接枝物的抗氧化活性Table 3 Antioxidant activities of WPI and WPI-CA conjugates

2.9 WPI和WPI-CA接枝物的乳化性分析結(jié)果

由圖6可知，與WPI相比，WPI-CA共價接枝物的EAI和ESI均顯著提高（P＜0.05），說明CA的共價接枝改善了WPI的乳化性質(zhì)。這與Sui Xiaonan等[29]關(guān)于大豆分離蛋白-花青素接枝物的研究結(jié)果一致。對于接枝物乳化性能的提高，一方面，可能是因為多酚的共價接枝增強(qiáng)了蛋白質(zhì)在油-水界面的表面張力，使其形成的乳液粒徑更?。涣硪环矫?，多酚的共價接枝提高了蛋白質(zhì)分子Zeta電勢，從而增強(qiáng)乳液液滴間的排斥力，提高乳液穩(wěn)定性[30]。此外，共價接枝物結(jié)構(gòu)更為松散，這也有利于其乳化性能的改善。

圖6 WPI和WPI-CA接枝物的乳化性質(zhì)Fig. 6 Emulsifying properties of WPI and WPI-CA conjugates

3 結(jié) 論

本研究以堿法、自由基法和酶法制備WPI-CA共價接枝物，系統(tǒng)比較了不同方法的接枝效率及其對接枝物結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響。結(jié)果表明：3 種方法均能誘導(dǎo)WPI-CA接枝物的形成，但酶法接枝效率最高，其次為堿法；CA的接枝會改變WPI的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和表面親疏水性，其中酶法接枝對WPI二級結(jié)構(gòu)影響最?。蛔杂苫ń又δ軌蛱岣遅PI的表面疏水性，其他2 種方法則相反；堿法和酶法接枝能夠提高WPI的熱穩(wěn)定性，而自由基法則相反。與WPI相比，接枝物的抗氧化活性和乳化性質(zhì)均顯著增強(qiáng)，且抗氧化活性與CA接枝量成正比。酶法接枝物的熱穩(wěn)定性和抗氧化活性最好。