包裝方式對牛排貯藏期間微生物數(shù)量和演替的影響

楊鴻博，楊嘯吟，張一敏，梁榮蓉，羅 欣，王芳芳，毛衍偉

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018）

牛肉營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)和水分含量高[1]。因此，牛肉在貯藏和銷售過程中，極易滋生微生物，導(dǎo)致肉色褐變、產(chǎn)生異味等品質(zhì)問題，縮短了產(chǎn)品的貨架期[2-3]。氣調(diào)包裝（modified atmosphere packaging，MAP）是一種有效的牛肉保鮮技術(shù)，能夠較好地保持牛肉品質(zhì)并延長其貨架期[4]。80%（體積分?jǐn)?shù)，下同）O2和20% CO2是氣調(diào)包裝中最常見的氣體組成方式，其中O2和CO2分別起到護(hù)色和抑菌作用。然而，高濃度的氧氣會造成脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化以及好氧菌的大量增殖，從而導(dǎo)致牛肉品質(zhì)下降。Yang Xiaoyin等[5]探究了不同氣調(diào)包裝方式對雪花牛排貨架期和品質(zhì)的影響，結(jié)果表明80% O2氣調(diào)包裝的牛排在前4 d呈現(xiàn)出誘人的鮮紅色，但在第4天之后開始發(fā)生褐變和氧化，從而縮短了牛排的貨架期。真空包裝（vacuum package，VP）能很大程度減少氧氣對牛肉品質(zhì)的影響，但是缺氧環(huán)境使牛肉呈現(xiàn)暗紫色，且真空包裝造成的汁液損失會大大降低消費者的購買欲[6]。因此，如何在延長牛肉貨架期的基礎(chǔ)上減少高氧包裝對牛肉造成的不良影響是當(dāng)前肉類科學(xué)中的亟待解決的問題。

50% O2氣調(diào)包裝（50% O2＋30% CO2＋20% N2）是一種新設(shè)計的氣調(diào)包裝，其主要目的是在保證良好肉色的前提下，盡量延緩肉類的氧化和腐敗[4]。Lücke等[7]指出，只要使O2體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%～50%便可以達(dá)到良好的護(hù)色效果，Zakrys-Waliwander等[8]也證明與其他含氧量相比，50% O2氣調(diào)包裝中的牛排具有更好的風(fēng)味和嫩度。Emser等[4]發(fā)現(xiàn)CO2、O2、N2比例不同的氣調(diào)包裝對牛肉糜貯藏期間的微生物數(shù)有重大影響，50% O2氣調(diào)包裝下牛肉糜的顏色和微生物數(shù)量控制得最好。與此同時，牛肉在貯藏過程中經(jīng)歷了一系列微生物的動態(tài)演替，不同的氣體組成對微生物群落的選擇作用不同[9]，而微生物的組成和演替是影響牛肉品質(zhì)和貨架期的重要因素。然而，目前缺乏對50% O2氣調(diào)包裝牛排貯藏過程中微生物演替及其與肉品質(zhì)關(guān)系的研究。因此，本研究對比了50% O2氣調(diào)包裝和真空包裝對牛肉貯藏期間微生物數(shù)量、細(xì)菌群落組成和演替的影響，并通過宏基因組的功能分析探討了不同包裝方式下微生物引起的肉類腐敗機(jī)制，為明確不同包裝方式下冷鮮牛肉的腐敗機(jī)理、根據(jù)不同包裝方式下微生物組成和演替開發(fā)有效的抑菌技術(shù)提供參考，從而進(jìn)一步延長產(chǎn)品貨架期、提高產(chǎn)品品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在山東省某商業(yè)屠宰場選出20 頭24 月齡雜交公牛（魯西黃?！廖鏖T塔爾），按GB/T 19477—2018《畜禽屠宰操作規(guī)程 ?！吠涝?。宰后48 h，取肉牛左半胴體的背最長肌，真空包裝后放在泡沫箱的碎冰上打包，3 h左右運至實驗室。

PCA培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、VRBGA培養(yǎng)基、CFC培養(yǎng)基、STAA培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；蛋白胨、氯化鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DNA提取試劑盒 天津迦美惠眾科技有限公司；核酸純化試劑盒美國Beckman Coulter公司；PicoGreen dsDNA定量檢測試劑盒 美國Invitrogen公司；20絲真空包裝袋 深圳喜之龍包裝制品有限公司；TQBC-0775氣調(diào)包裝盒、Lid 1050阻隔膜 希悅爾（中國）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣調(diào)包裝機(jī) 中國大江機(jī)械設(shè)備有限公司；Seven2Go pH計、數(shù)字天平 瑞士梅特勒-托利多公司；SP62色差計 美國愛色麗公司；真空包裝機(jī) 德國Haggenmüller GmbH公司；微孔板分光光度計 美國BioTek公司；離心機(jī) 德國Eppendorf公司；蒸汽壓力滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；Nano DropTM1000紫外-可見分光光度計、生物安全柜 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集和處理

將背最長肌去除真空包裝后分割成9 塊3 cm厚的牛排，在每條背最長肌中隨機(jī)取出一塊牛排，定義為貯藏0 d的樣本，剩余的牛排在室溫下分別進(jìn)行真空包裝（VP處理組）和50% O2氣調(diào)包裝（MAP處理組，50% O2＋30% CO2＋20% N2），然后于0～4 ℃條件下貯藏，分別在貯藏的0、3、7、14、21 d進(jìn)行取樣分析。

1.3.2 pH值和色澤的測定

色澤指標(biāo)由亮度（L*值）、紅度（a*值）和黃度（b*值）表示，使用色差計進(jìn)行測定。測定前使用白色和黑色標(biāo)準(zhǔn)板對色差計進(jìn)行校正，牛排去除包裝后在室溫下發(fā)色30 min，每塊牛排樣品在擦干表面水分之后測定5 個不同的位置，分別記錄每個位置的數(shù)據(jù)。用pH計（提前用pH值分別為4.00和7.00的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液在4 ℃下進(jìn)行校正）測定牛排的pH值，探頭插入深度約為3 cm，連續(xù)測定5 次。

1.3.3 微生物指標(biāo)測定

微生物指標(biāo)測定參考Yang Xiaoyin等[5]的方法。每塊牛排樣品獲取25 g表面肉樣，加入225 mL無菌蛋白胨生理鹽水溶液在拍打均質(zhì)機(jī)中室溫均質(zhì)90 s。樣品使用體積分?jǐn)?shù)0.1%無菌蛋白胨溶液進(jìn)行連續(xù)稀釋，挑選適當(dāng)?shù)南♂屘荻冗M(jìn)行微生物培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如表1所示。

表1 微生物計數(shù)采用的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件Table 1 Culture media and culture conditions used for microbial counting

1.3.4 微生物多樣性分析

收集1.3.3節(jié)均質(zhì)后的溶液30 mL進(jìn)行過濾，然后在4 ℃下10 000×g離心5 min。棄上清液，將含DNA的沉淀溶于1.5 mL 0.15 mol/L的NaCl溶液中，4 ℃下12 000×g離心5 min。使用DNA提取試劑盒提取DNA。采用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對細(xì)菌16S rDNA的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25～30 個循環(huán)；最終72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。

使用Illumina Mi Seq PE250平臺對提取的DNA進(jìn)行測序，并截去Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列。以97%的相似度將DNA測序數(shù)據(jù)聚類成操作分類單元（operational taxonomy unit，OTU）并篩選出代表序列。通過SILVA數(shù)據(jù)庫（http://www.arb-siLva.de/）對OTU代表序列進(jìn)行對比，在分類學(xué)上劃分OTU。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

除特殊說明外，指標(biāo)測定均設(shè)3 次平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。分析肉色、pH值、微生物指標(biāo)時，以包裝方式和貯藏時間及其交互作用為固定效應(yīng)，牛胴體為隨機(jī)效應(yīng)，采用SPSS一般線性模型單變量進(jìn)行差異顯著性分析，多重比較采用Tukey’s法，P＜0.05表明數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異。

對于微生物多樣性結(jié)果，對97%相似度的OTU分析其Alpha多樣性（Chao 1、ACE和Shannon指數(shù)）和Beta多樣性。利用樣品之間物種的進(jìn)化信息及物種的豐度信息進(jìn)行Unifrac分析，將得到的樣品之間距離矩陣信息進(jìn)行主成分分析和熱圖分析。對測序分析得到的OTU豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，從細(xì)菌的基因組信息得到對應(yīng)的基因信息及注釋信息，再結(jié)合均一化的OTU豐度來預(yù)測樣品中可能存在的各級京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛排貯藏過程中pH值的變化

分析結(jié)果表明，包裝方式與貯藏時間的交互作用對pH值無顯著影響（P＞0.05）。由圖1可知，兩組牛排貯藏初期pH值較為穩(wěn)定，貯藏7 d后pH值升高，到第21天時pH值顯著高于0～7 d（P＜0.05）。Karabagias等[10]認(rèn)為貯藏后期pH值升高可能是蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生NH3和胺類化合物等堿性物質(zhì)所致，這種現(xiàn)象在一定程度上反映了肉的腐敗。

圖1 真空包裝和50% O2氣調(diào)包裝下牛排pH值的變化趨勢Fig. 1 Evolution of pH during storage of beef steaks in vacuum and modified atmosphere

2.2 牛排貯藏過程中色澤的變化

肉色是評價肉品質(zhì)最直觀的指標(biāo)，也是消費者購買肉時評價肉品新鮮度的首要指標(biāo)，牛排的褐變通常會讓消費者聯(lián)想到肉的腐敗，導(dǎo)致拒絕購買[11]。

在整個貯藏期間，包裝方式與貯藏時間交互作用對L*值無顯著影響（P＞0.05），但貯藏時間對L*值有顯著影響（P＜0.05）。兩組排骨在貯藏過程中L*值呈顯著增加的趨勢（表2），這是因為貯藏過程中往往伴隨著肌肉纖維收縮和蛋白質(zhì)降解等現(xiàn)象，這會導(dǎo)致肌肉顏色變淺、肌細(xì)胞胞外空間增加，且肌細(xì)胞胞外空間增加會導(dǎo)致產(chǎn)生更多的光散射和反射，從而使L*值增加[12-14]。

表2 真空包裝和50% O2氣調(diào)包裝下牛排色澤的變化趨勢Table 2 Evolution of color parameters during storage of beef steaks in vacuum and modified atmosphere

肉的顏色主要由氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，Oxy-Mb）、脫氧肌紅蛋白（deoxymyoglobin，Deo-Mb）和高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，Met-Mb）的濃度和比例決定[15]。表2結(jié)果表明，包裝方式對a*值和b*值均有顯著影響（P＜0.05）。相比于真空包裝組，50% O2氣調(diào)包裝牛排具有更高的a*值和b*值，這是因為50% O2的含氧環(huán)境有利于形成Oxy-Mb，使肉呈現(xiàn)鮮紅色[16]。Esmer[4]和Raines[17]等研究也指出a*值的降低反映了肉紅色的損失，與Met-Mb的形成以及肉色從鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽睾稚芮邢嚓P(guān)。O’Sullivan等[18]的研究表明，b*值與肉類褐變以及肉類感官評定中的評分呈負(fù)相關(guān)性，b*值的下降表明Met-Mb的形成。研究認(rèn)為，氣調(diào)包裝的牛排，如果貯藏后期包裝中氧的濃度下降，當(dāng)牛排表面的氧分壓降低到有利于Met-Mb形成的范圍時，可以加速Met-Mb的積累[19]。Bevilacqua等[20]認(rèn)為一旦菌落總數(shù)超過7（lg（CFU/g）），肉表面的氧分壓就會由于微生物的呼吸耗氧而快速降低，從而加速肉的褐變。真空包裝牛排雖然不存在氧濃度降低的問題，但是其本身很低的氧分壓以及后期快速增長的微生物數(shù)量同樣有影響。

2.3 牛排貯藏過程中微生物的變化

如表3所示，在本研究中，各微生物的數(shù)量在牛排貯藏期間均呈現(xiàn)上升趨勢。新鮮牛排的初始菌落總數(shù)為3.71（lg（CFU/g）），屬于正常水平[8]。菌落總數(shù)、乳酸菌數(shù)和假單胞菌數(shù)在前7 d內(nèi)整體上無顯著變化，7 d之后顯著增加（P＜0.05）。50% O2氣調(diào)包裝組菌落總數(shù)貯藏期間低于真空包裝組，且在貯藏末期具有顯著性差異（P＜0.05）。

表3 真空包裝和50% O2氣調(diào)包裝牛排貯藏期間微生物的變化Table 3 Evolution of microbial counts during storage of beef steaks in vacuum and modified atmosphere lg（CFU/g）

乳酸菌是一類兼性厭氧革蘭氏陽性菌，無論有氧無氧條件都可生存[8]。許多研究表明，高濃度的二氧化碳對乳酸菌沒有顯著的抑制作用，所以乳酸菌通常能適應(yīng)氣調(diào)包裝環(huán)境，這也使得乳酸菌成為氣調(diào)包裝肉中菌群的重要組成部分[21]。然而在本研究中，貯藏14 d后50% O2氣調(diào)包裝牛排中的乳酸菌數(shù)顯著低于真空包裝組（P＜0.05）。這可能是因為高濃度的氧在微生物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，導(dǎo)致微生物蛋白氧化損傷，對微生物產(chǎn)生毒害作用，致使微生物死亡[22]。

假單胞菌是專性好氧革蘭氏陰性菌，是生肉有氧冷藏條件下的優(yōu)勢菌群。但在本研究貯藏后期，50% O2氣調(diào)包裝牛排中的假單胞菌數(shù)顯著低于真空包裝組（P＜0.05）。Lorenzo等[23]發(fā)現(xiàn)真空包裝和80% O2氣調(diào)包裝的馬駒肉中假單胞菌數(shù)差異不顯著（P＞0.05），而30% O2氣調(diào)包裝組（30% O2＋70% CO2）肉中的假單胞菌數(shù)顯著低于真空包裝和80% O2氣調(diào)包裝組樣品（P＜0.05），這與本研究結(jié)果類似。CO2濃度對膜流動性、細(xì)胞內(nèi)酶促反應(yīng)過程以及代謝反應(yīng)等有直接影響[24-27]。CO2的溶解可能是氣調(diào)包裝抑制假單胞菌生長的主要原因之一。總而言之，O2和CO2對假單胞菌的生長都有影響，但50% O2氣調(diào)包裝抑制假單胞菌的主要原因還需要進(jìn)一步研究。

熱死環(huán)絲菌是一種兼性厭氧微生物，是氣調(diào)包裝肉類和海鮮產(chǎn)品的優(yōu)勢菌群[28]。隨著貯藏時間的延長，熱死環(huán)絲菌數(shù)顯著上升（P＜0.05），兩種包裝的熱死環(huán)絲菌數(shù)在整個貯藏時間內(nèi)差異不顯著（P＞0.05）。Lopez-Galvez等[29]研究表明，當(dāng)氧氣體積分?jǐn)?shù)高于0.2%時，CO2對熱死環(huán)絲菌的抑制效果會顯著降低，另一項研究則顯示，真空包裝中殘留的氧氣可以促進(jìn)熱死環(huán)絲菌的生長[30]?？傮w看來，50% O2氣調(diào)包裝和真空包裝對熱死環(huán)絲菌的抑菌作用差異不顯著（P＞0.05），影響其在肉中生長和代謝的因素也較為復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究探索。

腸桿菌科是一類兼性厭氧革蘭氏陰性菌，其中的大腸菌群數(shù)常作為檢測肉類被糞便污染程度的指標(biāo)。貯藏前7 d，兩種包裝的腸桿菌數(shù)略有增加，但差異不顯著（P＞0.05）；7 d之后，腸桿菌數(shù)顯著增加（P＜0.05）。Berruga等[31]發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)高于40%時，CO2才能抑制腸桿菌的生長。因此，CO2對腸桿菌的抑菌作用需要進(jìn)一步研究。此外，本研究中腸桿菌科初始數(shù)量為3.26（lg（CFU/g）），高于之前的研究結(jié)果[31]，這可能也是導(dǎo)致氣調(diào)包裝對腸桿菌科抑制不顯著的重要原因。

2.4 牛排貯藏過程中微生物多樣性分析結(jié)果

如表4所示，真空包裝組樣本的有效測序量在43 810～52 919之間，而50% O2氣調(diào)包裝組樣本的有效測序量則在43 058～57 881之間。此外，本研究還分析了OTU數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)。其中OTU數(shù)與微生物種類相關(guān)，OTU數(shù)越多則表明測序樣品中的微生物種類越多。ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)反映了樣品中微生物群落的物種豐度，單指群落中物種的數(shù)量，而不考慮群落中每個物種的豐度分布情況。與ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)不同，Shannon指數(shù)則反映群落的多樣性。一般Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)越高，說明樣品的微生物多樣性越豐富。

表4 貯藏期間氣調(diào)包裝與真空包裝牛排測序的微生物群落物種豐度及多樣性Table 4 Species richness and diversity of bacterial community in beef steaks during storage in vacuum and modified atmosphere

整個貯藏期間，氣調(diào)包裝和真空包裝牛排測序樣本的OTU數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)均呈先上升后下降的趨勢，這意味著隨著貯藏時間的延長，兩種包裝環(huán)境下的微生物多樣性先升高再降低。這是因為肉中的初始微生物種類繁多，在適應(yīng)環(huán)境之后會大量增殖；但隨著貯藏時間延長，一部分微生物在競爭中取得優(yōu)勢大量繁殖并抑制了其他微生物的生長，最終成為優(yōu)勢菌群[32]。此外，50% O2氣調(diào)包裝組在貯藏21 d時的OTU數(shù)、ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)均低于真空包裝組，這表明貯藏結(jié)束時50% O2氣調(diào)包裝牛排的微生物多樣性要小于真空包裝組。

對不同貯藏時間的真空包裝和氣調(diào)包裝牛排中的微生物基因進(jìn)行測序，共檢測到37 個門的微生物，其中相對豐度大于1%的有變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Acfinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）。由圖2A可知，在貯藏前14 d，無論真空包裝還是50% O2氣調(diào)包裝的牛排中，最主要的菌群都是變形菌門（相對豐度均大于50%），但是到貯藏期結(jié)束時，該菌群被厚壁菌門（Firmicutes）代替，厚壁菌門成為氣調(diào)包裝和真空包裝牛排中的優(yōu)勢菌群，這可能是由于貯藏14 d之后熱死環(huán)絲菌和乳酸菌快速增殖所致，這兩個菌屬都屬于厚壁菌門。

圖2 貯藏期間氣調(diào)包裝和真空包裝牛排微生物群落的相對豐度Fig. 2 Relative abundance of bacterial community in beef steaks during storage in vacuum and modified atmosphere

由圖2B可知，在屬水平上，初始微生物群落主要由不動桿菌屬（Acinetobacter）（15.24%）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）（9.00%）、棲熱菌屬（Thermus）（8.05%）和金黃桿菌屬（Chryseobacterium）（4.31%）等組成。這些微生物主要來源于肉牛的養(yǎng)殖環(huán)境和牛排生產(chǎn)的屠宰加工環(huán)境，例如土壤、水源和屠宰器械等污染源[33-34]。肉食桿菌（Carnobacterium）是一種異源發(fā)酵菌，能產(chǎn)生與真空包裝肉品腐敗有關(guān)的丁酸和硫化物。在本研究的真空包裝組中，肉食桿菌屬相對豐度在前7 d增長并不明顯，但從第14天開始迅速增加并于第21天達(dá)到最大值（62.5%），成為最主要的優(yōu)勢菌。這說明肉食桿菌在貯藏后期的真空包裝中具有更大的競爭優(yōu)勢，這也與之前的研究結(jié)論[35]類似。

不同于真空包裝組，50% O2氣調(diào)包裝組的優(yōu)勢菌群演變趨勢更為復(fù)雜，前7 d各種菌的相對豐度差異并不明顯，假單胞菌屬（Pseudomonas）和不動桿菌屬相對豐度較高；但從第14天開始，環(huán)絲菌屬（Brochothrix）相對豐度迅速上升。在貯藏后期（21 d），環(huán)絲菌屬（Brochothrix）（41.9%）、沙雷氏菌屬（Serratia）（22.0%）和乳桿菌屬（Lactobacillus）（15.8%）成為50% O2氣調(diào)包裝組的優(yōu)勢菌群，這3 種菌的比例超過了79%。熱死環(huán)絲菌通常被認(rèn)為是含氧包裝肉類的主要腐敗微生物[36]。本研究中，雖然環(huán)絲菌屬在初始菌中的相對豐度很低，但隨著貯藏時間的延長，當(dāng)其他微生物的生長消耗了包裝內(nèi)的氧氣造成局部低氧時，熱死環(huán)絲菌能首先利用葡萄糖作為生長基質(zhì)并快速生長[37]。因此，隨著貯藏時間延長，環(huán)絲菌屬相對豐度越來越高，最終成為了50% O2氣調(diào)包裝貯藏后期的最大優(yōu)勢菌群。乳桿菌屬同樣是50% O2氣調(diào)包裝組貯藏后期的優(yōu)勢菌群之一，隨著其優(yōu)勢地位的增強還會對其他菌群產(chǎn)生抑制作用，但在本研究中即使到了貯藏末期其相對豐度仍大大低于環(huán)絲菌屬，并不能對環(huán)絲菌屬起到很大的抑制作用。沙雷氏菌屬屬于腸桿菌科，常見于氣調(diào)包裝的生肉中，其與動物生活的環(huán)境密切相關(guān)，所以很容易進(jìn)入肉類加工生產(chǎn)鏈中。Carrizosa等[9]發(fā)現(xiàn)沙雷氏菌是導(dǎo)致高氧包裝肉類腐敗的優(yōu)勢菌群之一，與本研究得出的結(jié)果類似。

本研究對氣調(diào)包裝和真空包裝牛排的微生物DNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了主成分分析和熱圖分析，進(jìn)一步揭示了其在貯藏期間的微生物群落結(jié)構(gòu)變化。從主成分分析結(jié)果（圖3）可以看出，第一主成分（PC1）、第二主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率分別為56.20%、26.29%，二者之和大于80%。貯藏前7 d，真空包裝和50% O2氣調(diào)包裝牛排中的微生物群落結(jié)構(gòu)并無明顯不同，14 d之后兩種包裝牛排中的微生物群落結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)較大差異。這表明貯藏7 d后優(yōu)勢菌群發(fā)生了變化，最終導(dǎo)致肉品腐敗的關(guān)鍵微生物可能也發(fā)生了改變。

圖3 氣調(diào)包裝和真空包裝牛排貯藏期間微生物群落的主成分分析Fig. 3 Principal component analysis plot for the microbial community in beef steaks during storage in vacuum and modified atmosphere

通過熱圖分析（圖4）可知，50% O2氣調(diào)包裝中環(huán)絲菌屬、沙雷氏菌屬和乳桿菌屬聚類在一起，且這3 種菌對應(yīng)的OTUs相對含量在整個群落OTUs中最高，表明它們是50% O2氣調(diào)包裝牛排貯藏期間的主要優(yōu)勢菌群。肉食桿菌屬和哈夫尼菌屬在真空包裝組中被聚類到了一起，這表明它們是真空包裝牛排貯藏后期的優(yōu)勢菌群。類似的，熱圖分析把前7 d的所有樣本聚類在了一起，14 d后的樣本聚類在了一起，這表明7～14 d的貯藏過程中牛排的微生物菌落結(jié)構(gòu)發(fā)生了重大改變，這也與主成分分析結(jié)果相同。

圖4 氣調(diào)包裝與真空包裝牛排貯藏期間的微生物群落熱圖分析Fig. 4 Heat map showing the microbial community composition of beef steaks during storage in vacuum and modified atmosphere

微生物代謝對肉腐敗的影響與肉貯藏環(huán)境密切相關(guān)。與肉腐敗相關(guān)的微生物大多優(yōu)先利用葡萄糖，并產(chǎn)生代謝物。本實驗對氣調(diào)包裝與真空包裝牛排中的微生物群落進(jìn)行了宏基因組功能預(yù)測，研究了貯藏期間牛排的腐敗過程及機(jī)制。從圖5可以看出，在貯藏過程中，與碳水化合物代謝相關(guān)基因和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因的數(shù)量明顯高于其他代謝過程。貯藏前7 d，兩種包裝下牛排中的微生物的蛋白質(zhì)代謝基因數(shù)量差異并不明顯。而貯藏到第21天時，相比于真空包裝組，50% O2氣調(diào)包裝牛排中的微生物群落中，涉及碳水化合物代謝的基因數(shù)量更低，涉及蛋白質(zhì)代謝的基因數(shù)量更多。這說明貯藏后期，50% O2氣調(diào)包裝牛排中微生物群落具有比真空包裝牛排中微生物群落更低的糖代謝水平和更高的蛋白質(zhì)降解能力。

圖5 氣調(diào)包裝和真空包裝牛排在貯藏期間微生物群落的代謝功能預(yù)測Fig. 5 Predicted metabolic function of the microbial community in beef steaks stored in different packages for different periods of time

肉食桿菌通常會出現(xiàn)在貯藏初期的真空包裝牛排中，并在其微生物菌群結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)地位，但隨著貯藏時間延長通常會被其他乳酸菌所取代[38]。但是，Casaburi等[39]發(fā)現(xiàn)肉食桿菌是真空包裝冷鮮牛排貯藏末期的主要優(yōu)勢菌群，且相對豐度達(dá)到了80%，與本研究結(jié)果十分相似。作為乳酸菌的特殊分支，肉食桿菌屬是一類可以分解多種碳水化合物為自身代謝供能的細(xì)菌[40]，圖5也表明貯藏后期真空包裝組牛排中微生物群落的碳水化合物代謝水平較高，這與肉食桿菌是真空包裝牛排貯藏后期的主要優(yōu)勢菌群密切相關(guān)。

不同于肉食桿菌，在肉貯藏初期熱死環(huán)絲菌僅能代謝葡萄糖，當(dāng)葡萄糖消耗完之后會轉(zhuǎn)而分解蛋白質(zhì)，利用氨基酸來供能[39]。因為貯藏后期50% O2氣調(diào)包裝牛排中微生物的蛋白質(zhì)代謝水平高于真空包裝組，這表明在貯藏期間50% O2氣調(diào)包裝牛排中微生物對于蛋白質(zhì)的代謝大于真空包裝組。Braun等[41]研究指出，熱死環(huán)絲菌的胞外分泌物含有較高的蛋白酶活性，這表明熱死環(huán)絲菌具有較高的蛋白質(zhì)分解能力，能夠降解蛋白質(zhì)為自身供能，這或許是50% O2氣調(diào)包裝微生物群落具有更高蛋白質(zhì)降解能力的原因。

3 結(jié) 論

與真空包裝相比，50% O2氣調(diào)包裝具有更好的護(hù)色能力和抑菌效果。隨著貯藏時間的延長，氣調(diào)包裝和真空包裝牛排中的微生物從貯藏初期的變形菌門轉(zhuǎn)變?yōu)橘A藏后期的厚壁菌門。在屬水平上，牛排的初始微生物群落主要由不動桿菌屬、蒼白桿菌屬、棲熱菌屬和金黃桿菌屬組成，隨著貯藏時間的延長，肉食桿菌屬成為真空包裝牛排中的優(yōu)勢菌群，而環(huán)絲菌屬、沙雷氏菌屬和乳桿菌屬成為50% O2氣調(diào)包裝牛排的優(yōu)勢菌群；貯藏7～14 d是牛排中微生物種類產(chǎn)生變化的關(guān)鍵時間點。與真空包裝牛排相比，50% O2氣調(diào)包裝牛排中的微生物群落具有較低的糖代謝和較高的蛋白質(zhì)代謝能力。本研究明確了50% O2氣調(diào)包裝對貯藏過程中牛排品質(zhì)和微生物的影響，探明了50% O2氣調(diào)包裝和真空包裝貯藏過程中微生物的演替、微生物演替關(guān)鍵時間點和代謝異同，為開發(fā)牛排貯藏技術(shù)提供了科學(xué)參考。