謝 晨,熊澤語,李 慧,金素萊曼,陳百科,包海蓉,2,3,*
(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306;2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306;3.農業(yè)農村部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海),上海 201306)
大黃魚(Pseudosciaena crocea)因其年產量高、味道鮮美、魚肉內細魚骨較少、便于食用而深受消費者青睞,是消費者攝取蛋白質和不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質的優(yōu)質來源之一[1]。但由于大黃魚有較高的脂肪酸含量且內源酶活性強,再加上環(huán)境中和魚腸道中微生物的作用,如果不儲存于低溫環(huán)境中,則極易產生腐敗。因此保持產品捕撈后的新鮮度并延長貨架期對大黃魚產業(yè)是至關重要的。
微凍是將待保藏的產品溫度降至稍低于細胞汁液凍結點的溫度下,使之處于部分凍結狀態(tài)下的一種保藏方法[2]。微凍可以通過凍結魚體部分水,升高未凍結部分的滲透壓來抑制微生物生長[3],從而延長食品保質期。與冰藏相比,微凍極大地延長了水產品的貨架期,延緩微生物的繁殖增長,同時,微凍對水產品蛋白質冷凍變性的影響沒有冷凍貯藏那么嚴重??梢哉f,微凍是一種在短期內保持捕撈后水產品品質的較好方法。
為了更好地保持水產品品質,除了選用多種低溫貯藏方式來維持水產品捕撈后的鮮度,各種保鮮劑也常常被利用于水產品的保鮮中。生物保鮮劑是從動植物中提取或通過微生物發(fā)酵產生的天然活性物質,是目前保鮮劑研究開發(fā)的熱點。國內外研究人員已發(fā)現了多種動植物提取物能有效延緩水產品變質,如茶多酚[4]、海藻酸鈉[5]、海藻糖[6]、葡萄籽提取物[7]等。金針菇多糖(polysaccharide fromFlammulina velutipes,FVP)[8]是從金針菇子實體中提取出的水溶性多糖,主要由甘露糖和木糖組成。目前對FVP的研究主要集中在體外自由基清除能力[9]、免疫調節(jié)能力[10]的測定。Kawahara等[11]通過冷熱臺顯微鏡發(fā)現FVP溶液具有冰重結晶抑制能力和熱滯活性,表明FVP可作為抗凍保鮮劑使用。但目前FVP在水產品抗凍保鮮方面的應用研究鮮有報導。為了研究FVP對大黃魚及其魚片的保鮮效果,將兩者用不同質量濃度FVP浸漬處理,探究FVP對微凍大黃魚感官指標、巰基含量、Ca2+-ATPase活性、流變學特性以及水分遷移情況,旨在為FVP在水產品保鮮應用方面提供參考。
新鮮大黃魚,體質量為(500±50)g,購于福建寧德蔡氏水產有限公司,夜間捕撈,加冰置于泡沫箱內,在4 ℃下經13 h運輸至實驗室進行實驗處理。
酒石酸鉀鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、輕質氧化鎂、濃硫酸、ATP、5,5’-二硫代雙(5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB)、三氯乙酸、硼酸、曲拉通)、鉬酸銨、甲基紅/藍、Tris試劑、牛血清白蛋白、硫酸亞鐵、體積分數95%乙醇溶液、氯化鈉、濃鹽酸、無水硫酸銅等(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。
FA2004型電子天平 南京東邁科技儀器有限公司;SG2 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;D-130電動勻漿機 維根技術(北京)有限公司;Kjeltec8400型凱氏定氮儀 丹麥FOSS有限公司;LRH-100CL低溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司;MCR301流變儀 安東帕儀器(上海)有限公司;MesoMR23-060H.I低場核磁共振(low-field nuclear magnetic resonance,LF-NMR)成像分析儀 上海紐邁電子科技有限公司;GL-20B高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;UV1100型紫外-可見分光光度計 廣州罡然機電設備有限公司。
1.3.1 原料處理
金針菇洗凈、凍干、碾成粉末,取50 g金針菇粉末,用600 mL質量分數2% KOH溶液于100 ℃浸泡提取2.5 h后,10 000 r/min離心15 min,收集上清液,重復浸提3 次,合并上清液,約得到1 780 mL上清液,于55 ℃下旋轉蒸發(fā)濃縮至250 mL。在濃縮液中加乙酸中和至pH 7.0,加入4 倍體積的無水乙醇,使?jié)饪s液產生沉淀,沉淀用無水乙醇清洗,除去不溶性物質,并參照文獻[11]進行透析和純化,得到FVP。
將新鮮大黃魚隨機分成兩組,一組除去皮、鱗、內臟、魚骨,取完整背部肌肉片成5 cm×3 cm×1 cm大小的魚片,另一組不作處理,將兩組樣品分別置于0.03、0.06、0.09 g/L的FVP溶液中浸漬10 min,并以無菌水處理作為對照。樣品瀝水后裝入自封袋中,于-3 ℃冰箱中微凍貯藏(大黃魚冰點-1.5 ℃),在0、4、8、12、16 d隨機抽樣進行相關指標測定。
1.3.2 感官分析
根據SC/T 3101—2010《鮮大黃魚、凍大黃魚、鮮小黃魚、凍小黃魚》[12]以及GB/T 18108—2019《鮮海水魚通則》[13]對大黃魚魚肉進行感官分析。由5 名評價人員(進行了3 h不同新鮮度大黃魚感官評價的實物培訓,評價人員年齡段為22~25 歲,2男3女)對魚肉色澤、彈性、氣味進行綜合評價。滿分5 分,去掉1 個最高分和1 個最低分后計算平均值,代表樣品最終評分,具體標準見表1。
表1 大黃魚魚肉感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of Pseudosciaena crocea
1.3.3 總揮發(fā)性鹽基氮含量的測定
總揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)含量的測定參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[15],使用全自動凱氏定氮儀測定樣品TVB-N含量/(mg/100 g),每組樣品測定3 次。
1.3.4 肌原纖維蛋白提取
參照Katoh等[14]的方法提取肌原纖維蛋白,整個蛋白提取過程在冰浴中進行。向5 g魚肉中加入40 mL蛋白提取液(含40 mmol/L Tris-馬來酸、0.16 mol/L KCl、1%體積分數的曲拉通,pH 7.5),10 000 r/min均質2 min,4 ℃、5 000 r/min離心15 min,取沉淀加入40 mL蛋白提取液(含40 mmol/L Tris-馬來酸、0.16 mol/L KCl,pH 7.5),重復上述步驟兩次得粗蛋白。將粗蛋白與20 mL 0.1 mol/L KCl混合,均質、離心(步驟同上)。再加入40 mL 0.1 mol/L KCl均質,用兩層紗布過濾后離心,沉淀即為肌原纖維蛋白。以牛血清白蛋白作標準曲線,用雙縮脲法測定蛋白濃度,并用0.6 mol/L KCl配制成所需濃度肌原纖維蛋白溶液,置于4 ℃冰箱冷藏待用。
1.3.5 總巰基含量測定
依據di Simplicio等[16]的方法使用DTNB進行測定,取1 mL 2 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液加入9 mL 50 mmol/L的磷酸緩沖液,取4 mL混合液加入0.4 mL pH 8.0含質量分數1% DTNB的0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖液,40 ℃水浴25 min,在412 nm波長處測定吸光度A412nm。按照公式(1)計算總巰基含量。
1.3.6 Ca2+-ATPase活力測定
參考Benjakul等[17]的方法進行測定大黃魚Ca2+-ATPase活力,結果以1 mg肌原纖維蛋白每分鐘生成無機磷物質的量表示。無機磷標準曲線的繪制方法如下,分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 0.001 mol/L Na2HPO4,加蒸餾水使總體積為2.9 mL,然后加入0.1 mL質量分數15%的三氯乙酸和2 mL硫酸亞鐵-鉬酸銨溶液(10 mL 10%質量分數的鉬酸銨硫酸溶液(硫酸濃度為5 mol/L)加5 g硫酸亞鐵定容到100 mL),25 ℃水浴5 min,測定660 nm波長處的吸光度A660nm,得到無機磷標準曲線:無機磷物質的量/μmol=(A660nm-0.001 3)/0.640 9。
取3.5 mL質量濃度2 mg/mL肌原纖維蛋白溶液加入0.3 mL pH 7.0 0.5 mol/L Tris-馬來酸緩沖溶液和0.5 mL 0.1 mol/L CaCl2溶液,再加入0.25 mL 20 mmol/L ATP,25 ℃水浴10 min后加入2.5 mL質量分數15%的三氯乙酸,4 ℃、5 000 r/min離心5 min。取0.5 mL上清液加入2.5 mL蒸餾水,混勻后加2 mL硫酸亞鐵-鉬酸銨溶液(配制方法同上),25 ℃靜置1 min,在660 nm波長處測定吸光度??瞻捉M中先加三氯乙酸,再加ATP。將測得的吸光度代入無機磷標準曲線算出相應的無機磷物質的量,然后按照公式(2)計算Ca2+ATPase活力。
式中:n為生成的無機磷物質的量/μmol;t為反應時間/min;m為肌原纖維蛋白質量/mg。
1.3.7 流變學性質測定
參考鄒咪等[18]的方法進行溫度掃描,將提取出的肌原纖維蛋白用0.6 mol/L KCl配制成質量濃度10 mg/mL蛋白溶液,選用DG26.7型號探頭,設置角頻率1 rad/s,應變?yōu)?%,升溫速率為1 ℃/min,每次進樣5 mL,測定樣品從20~80 ℃的彈性模量(G’)變化。
1.3.8 水分遷移變化的低場核磁共振和核磁成像分析
參考Wang Shuo等[19]的方法,將解凍后大黃魚背部肌肉切成2 cm×2 cm×1 cm魚塊,用保鮮膜包裹進行LF-NMR分析,使用Carr-Purcell-Miniboom-Gill(CPMG)程序,核磁管寬度為60 nm,質子共振頻率21 MHz,累加次數4,采樣頻率100 kHz,迭代反演后得到弛豫時間T2圖譜,不同狀態(tài)水分相對含量以其對應峰面積比例表示,并使用磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)軟件進行成像,并將圖像進行偽彩處理。
采用Origin 8.0、Excel軟件進行圖像繪制,SPSS 23軟件進行數據分析。數據分析使用單因素方差分析中的Duncan模型,P<0.05表示數據間有顯著性差異。
感官分析是消費者對產品的直觀判斷,產品在感官上是否可接受很大程度上決定了消費者的購買意愿。感官變化通過對魚肉的色澤、氣味、彈性3 個方面進行分析,具體結果見圖1。
圖1 FVP對微凍大黃魚整魚及魚片感官得分變化的影響Fig. 1 Effect of FVP on the change in sensory evaluation scores of whole fish and fillets of Pseudosciaena crocea during superchilled storage
微凍貯藏前期,大黃魚的魚肉色澤鮮亮,肌肉堅實而有彈性,并帶有清新的海魚味。隨著貯藏時間的延長,魚肉逐漸失去光澤,腥味加重,肌肉失去彈性,這使得大黃魚整魚及魚片的感官得分均有所下降。但整魚和魚片兩者的主要感官影響因素略有不同。對魚片來說,魚肉的顏色由鮮亮變得發(fā)黃、暗淡,干耗使魚片表面水分含量減少,加速了氧化反應,這是主要的感官得分影響因素,氣味和彈性兩者的變化差異并不是很大。而整魚的主要減分項為氣味和彈性。微凍后期,未經FVP處理的大黃魚腥味較重,且?guī)в幸稽c腐敗味,FVP處理過的魚腥味較小。整魚魚肉的質地變得柔軟無彈性,沒有同時期魚片的魚肉緊實。第16天時發(fā)現,整魚對照組的部分內臟已經開始溶解,即魚已經進入腐敗階段??傮w而言,微凍末期,魚片總體仍在感官可接受范圍內,整魚對照組感官上已經難以接受,隨著FVP處理濃度增加,接受程度有所上升。
TVB-N是魚肉中蛋白質等含氮物質因酶和微生物的分解利用產生的揮發(fā)性含氮物質,TVB-N含量可用于判斷原料魚的新鮮程度。據SC/T 3101—2010《鮮大黃魚、凍大黃魚、鮮小黃魚、凍小黃魚》,TVB-N含量≤13 mg/100 g為一級鮮度,13 mg/100 g<TVB-N含量≤30 mg/100 g為二級鮮度[12]。
由圖2可知,樣品TVB-N含量前期變化較為緩慢,后期迅速上升。微凍0~4 d,魚片、整魚組TVB-N含量略有增加,但無明顯差異。微凍4 d之后各組TVB-N含量開始出現差異。魚片組微凍第16天時,對照組TVB-N含量最高,經0.09 g/L FVP處理的樣品TVB-N含量最低,經0.03、0.06 g/L FVP處理的魚片間TVB-N含量差異不明顯。微凍16 d時整魚組的TVB-N含量各組之間的差異較魚片組更大,TVB-N含量與FVP濃度呈負相關,這表明FVP能有效延長大黃魚處于一級鮮度的時間。在第12天整魚組基本到達二級鮮度,而魚片組仍全部為一級鮮度,后續(xù)兩組的鮮度差異逐漸增大。研究表明,海水魚的腐敗主要受到微生物、酶和氧化作用的影響[20]。FVP具有自由基清除能力,可能通過抑制脂肪和蛋白的氧化使得樣品TVB-N含量低于對照組。貯藏過程中魚腸道內的微生物侵入機體,不斷分解蛋白質等營養(yǎng)物質,生成組胺、醛類等不良風味物質[21]。此外,魚的內臟和肌肉中存在大量內源酶,這些酶進入肌肉后導致魚體組織軟化降解,也常伴隨產生甲醛、乳酸等不良風味物質[20]。魚片組去除了魚體內的內臟、腸道等含大量微生物、內源酶的部分,只含肌肉組織,因此腐敗程度較整魚組低。
圖2 FVP對微凍大黃魚整魚及魚片TVB-N含量變化的影響Fig. 2 Effect of FVP on the change in TVB-N content in whole fish and fillets of Pseudosciaena crocea during superchilled storage
總巰基含量是活性巰基含量與隱藏巰基含量的總和,蛋白的冷凍變性造成蛋白三維空間結構發(fā)生變化,蛋白分子內部的活性巰基被暴露從而氧化,使總巰基含量下降,總巰基含量是反映蛋白氧化程度的指標之一[22]。微凍過程中,大黃魚整魚和魚片總巰基含量的變化如圖3所示,隨著貯藏時間的延長,魚片組和整魚組總巰基含量都呈下降趨勢。微凍16 d時,魚片組對照、0.03、0.06、0.09 g/L FVP處理組總巰基含量分別為初始值的33.93%、36.19%、39.19%、40.74%,整魚組對照、0.03、0.06、0.09 g/L FVP處理組總巰基含量分別為初始含量的37.41%、39.41%、42.37%、43.83%。由此可知,FVP可以在一定程度上抑制總巰基含量的下降。巰基含量的下降是肌動球蛋白頭部結構的改變使巰基暴露而被氧化為二硫化合物造成的,因此總巰基含量的降低常伴隨著二硫鍵含量的升高[22]。此外,巰基的氧化還與樣品貯藏溫度有關,樣品貯藏溫度越低,總巰基含量下降的越慢[23]。
圖3 FVP對微凍大黃魚整魚及魚片總巰基含量變化的影響Fig. 3 Effect of FVP on the change in total sulfhydryl content in whole fish and fillets of Pseudosciaena crocea during superchilled storage
Ca2+-ATPase活性來源于肌球蛋白頭部結構,是常用來表示肌球蛋白分子完整度的指標,廣泛用于評價肌原纖維蛋白變性的程度[24]??梢愿鶕挝粫r間內ATPase催化ATP分解生成的無機磷酸含量來判斷大黃魚的Ca2+-ATPase活力。微凍期間樣品肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力的變化情況如圖4所示。可以看出,在-3 ℃條件下貯藏的黃魚肌原纖維蛋白,其Ca2+-ATPase活力呈現下降的趨勢,不同濃度FVP處理的樣品間存在明顯差異??値€基含量的下降會影響Ca2+-ATPase活力,將2.3節(jié)總巰基含量與不同貯藏時間對應的Ca2+-ATPase活力進行相關性分析,結果見表2,分析結果證實兩者存在極顯著相關性(P<0.01)。根據巰基溫度越高越容易氧化的特點,降低貯藏溫度可以有效延緩Ca2+-ATPase活力的下降。
圖4 FVP對微凍大黃魚整魚及魚片Ca2+-ATPase活力的影響Fig. 4 Effect of FVP on the Ca2+-ATPase activity in whole fish and fillets of Pseudosciaena crocea during superchilled storage
表2 微凍大黃魚整魚及魚片總巰基含量和Ca2+-APTase活力的相關性分析Table 2 Correlation analysis between total sulfhydryl content and Ca2+-ATPase activity in whole fish and fillets of Pseudosciaena crocea during superchilled storage
肌原纖維蛋白受熱生成凝膠是一個伴隨著蛋白解鏈、變性、聚集的不穩(wěn)定的過程。肌原纖維蛋白流變學特性中的G’是蛋白凝膠因彈性形變而產生的能量變化,是反映肌原纖維蛋白聚集、交聯的指標[25]。G’越高,蛋白凝膠彈性越強。本實驗研究了與溫度有關的大黃魚肌原纖維蛋白流變學性質的變化規(guī)律。
如圖5所示,整魚和魚片組G’的變化趨勢大致為先上升后下降最后再上升。在20~80 ℃的加熱過程中,大黃魚的肌原纖維蛋白的G’變化可分成3 個階段。第一階段在20~41 ℃之間,肌原纖維蛋白溶膠初步形成較弱的凝膠網絡結構,在20~36 ℃之間G’變化緩慢,36~41 ℃之間快速上升。當溫度在41~44 ℃之間時,G’急劇下降,這是由于肌原纖維蛋白發(fā)生熱變性,之前形成的弱網絡結構被破壞,為凝膠劣化階段,G’降低。而溫度在44~80 ℃為凝膠強化階段,G’再次上升,肌原纖維蛋白由于共價二硫鍵和疏水相互作用,形成了穩(wěn)定的三維網絡結構[26]。
圖5 FVP對微凍大黃魚整魚及魚片肌原纖維蛋白溶液G’的影響Fig. 5 Effect of FVP on the G’ of myofibrillar protein in whole fish and fillets of Pseudosciaena crocea during superchilled storage
肌原纖維蛋白溫度掃描測得的G’變化普遍表現為上升、下降、上升的趨勢,但不同動物來源的肌原纖維蛋白的轉變溫度差異很大[27]。李可等[28]發(fā)現雞肉的G’在第一次上升時的溫度區(qū)間為22~51 ℃,下降時的溫度區(qū)間為51~57 ℃,雞肉的轉變溫度遠高于大黃魚的轉變溫度,李長樂等[29]發(fā)現鰹魚蛋白G’的兩個轉變溫度分別為38 ℃和47 ℃。這說明肌原纖維蛋白在加熱過程中聚集和交聯形成一個有序的凝膠網絡結構,這種變化存在種特異性[30],即使同為海水魚,不同種魚的肌原纖維蛋白G’的轉變溫度也有很大差異。在本實驗中,整魚和魚片組G’最大值隨微凍時間的延長有所降低,整體曲線隨FVP處理濃度的增加而上移。但FVP的添加并未對大黃魚整魚和魚片肌原纖維蛋白的轉變溫度產生明顯影響,肌原纖維蛋白的兩個轉變溫度始終保持在41、44 ℃左右。
魚體內水分存在形式的變化對蛋白的冷凍變性有極大影響。水在魚肉中以自由水、不易流動水和結合水3 種形式存在。微凍過程中,自由水先形成冰晶,隨著溫度進一步下降,結合水也發(fā)生凍結,蛋白內部化學鍵發(fā)生斷裂,并形成新的氫鍵、二硫鍵等,這使得蛋白空間結構發(fā)生不可逆變化而變性[31]。因此對魚肉水分的研究也是控制水產品品質的重要一環(huán)。LF-NMR是一種利用氫原子核在磁場中的弛豫特性來確定原料肉中水分分布狀態(tài)的快速、無損的檢測技術。通過橫向弛豫時間T2來區(qū)分原料肉中不同狀態(tài)的水分。T2越大表示水分子的自由度越高,水分子與其他分子結合越松散。大黃魚LF-NMR的弛豫信號曲線可分為3 個部分:結合水(T2b)(0~10 ms)、肌膜與肌纖維之間的不易流動水(T21)(10~200 ms)、肌纖維之外的自由水(T22)(200~1 500 ms)。
如圖6所示,新鮮魚肉中主要為不易流動水,自由水和結合水相對含量很低。微凍過程中,整魚和魚片均顯示不易流動水相對含量逐漸減少,自由水逐漸相對含量增加的趨勢,而結合水的相對含量略有減少,這是因為魚肉在微凍過程中肌原纖維蛋白結構被破壞而變得松散,肌纖維保水能力降低,不易流動水逐漸轉化為自由水。FVP處理后的魚片和整魚較對照組水分流失現象更輕??赡苁怯捎谔穷惡写罅苛u基,可以與魚中的水分子結合,使得共晶點溫度降低,抑制水分形成冰晶,從而抑制蛋白變性[32]。與整魚相比,魚片的水分流失更嚴重,可能是由于魚片肌肉沒有像整魚那樣有魚鱗和魚皮阻隔,魚肉表面生成的冰晶在微凍過程中升華,長期冷凍使魚片因干耗而損失大量水分。FVP在魚片表面形成了一層多糖膜,可以截留更多的水分。
MRI成像如圖7所示,顏色越鮮紅表明1H質子密度越高,水分質量分數越高,藍色表明含水量低。圖片顏色的變化可以反映魚肉水分分布情況。圖7結果與圖6基本一致。魚肉從第0天的鮮紅色逐漸轉變?yōu)槌赛S色再到黃中帶藍色,不易流動水逐漸轉化為自由水流出,藍色越多,水分流失率越高。
圖6 FVP對微凍大黃魚及魚片中不同狀態(tài)水分相對含量的影響Fig. 6 Changes in the percentage of T2i in whole fish and fillets of Pseudosciaena crocea pretreated with FVP during superchilled storage
圖7 FVP對微凍大黃魚及魚片MRI變化的影響Fig. 7 Effect of FVP on the change in nuclear magnetic resonance images of whole fish and fillets of Pseudosciaena crocea during superchilled storage
本實驗研究了不同濃度FVP浸漬對微凍大黃魚及魚片感官得分、TVB-N含量、總巰基含量、Ca2+-ATPase活力、流變特性及魚肉水分分布狀態(tài)的影響。結果表明,整魚由于微生物和酶的作用,感官劣變和TVB-N含量升高較魚片變化更明顯;魚片由于貯藏過程中的干耗作用,肌肉的持水性沒有整魚好。FVP可以延緩魚肉的腐敗,微凍16 d后整魚對照組TVB-N含量約為0.09 g/L FVP處理組TVB-N含量的1.5 倍,魚片組腐敗沒有整魚組嚴重,TVB-N含量的差異不明顯。FVP還可以通過形成多糖膜來降低魚片水分流失。通過肌原纖維蛋白的總巰基含量、Ca2+-ATPase活性和溫度掃描分析得出FVP處理后魚肉蛋白穩(wěn)定性較對照組強,其中0.09 g/L處理組效果最好。本研究證明不同濃度FVP對大黃魚及其魚片均有一定保鮮作用,0.09 g/L的FVP處理可使大黃魚整魚TVB-N含量在一級鮮度范圍的時間延長2 d左右。因此,FVP可作為水產品生物抗凍保鮮劑使用。