鐵細菌培養(yǎng)過程中低分子有機酸鈉鹽對含硫酸根鐵礦物形成的影響

花 敏，張 笛，姜艾伶，熊慧欣

(揚州大學 環(huán)境科學與工程學院， 江蘇 揚州 225127)

嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans， 簡稱A.ferrooxidans)是一種典型的化能自養(yǎng)菌，主要通過氧化Fe2+、單質S及還原態(tài)硫化物來獲取生命活動所需能量(Xiongetal., 2008)。在富含A.ferrooxidans的酸性礦山廢水等自然環(huán)境中普遍存在的生物成因鐵的氫氧化合物等礦物可以降解環(huán)境介質中的重金屬等污染物(Bighametal., 1994)。如施氏礦Fe8O8(OH)6SO4和黃鉀鐵礬KFe3(SO4)2(OH)6等生物誘導而形成的鐵沉淀礦物可以清除酸性礦山廢水環(huán)境中的銅、鉻等重金屬(Songetal., 2015； Lietal., 2016)。故A.ferrooxidans等鐵細菌作用下生物成因鐵礦物的形成及其相互作用日益被人們所重視(Xiongetal., 2008； 徐軼群等， 2013)，并具有良好的環(huán)境應用前景(Burtonetal., 2012； Zhuetal., 2013)。

眾所周知，土壤中普遍存在植物根系分泌物和微生物分解的腐殖質，腐殖質的分泌過程中常伴隨著溶解性低分子量有機酸(最常見的有檸檬酸、草酸、酒石酸和蘋果酸)的生成，這些低分子量有機酸的濃度一般不高，為微摩爾至毫摩爾數量級(王永壯等， 2018)。低分子量有機酸可以通過配位絡合的方式參與土壤重金屬遷移轉化以提高重金屬的生物有效性(Sullivanetal., 2012)。如Chiang等(2011)利用檸檬酸、草酸、酒石酸、乙酸等低分子量有機酸處理放射性物質137Cs污染土壤時發(fā)現(xiàn)，有機酸釋放的H+和酸根離子易與土壤礦物表面發(fā)生反應；有機配體在酸性環(huán)境條件下與土壤礦物相互作用可形成相關復合物，從而緩慢釋放土壤中的137Cs。同時，低分子量有機酸可被土壤膠體和礦物質吸附，有機酸離子的存在可使土壤ζ電位降低，從而導致土壤組分的表面性質發(fā)生變化(Xuetal., 2004； Gaoetal., 2010)?？梢娺@些低分子量有機酸與土壤礦物間的相互作用，對土壤重金屬的凈化和治理有著非常重要的意義。低分子量有機酸常與鐵的氧化物共存(Wangetal., 2007； Moradietal., 2012)，如二元羧酸草酸容易與礦物表面Fe(Ⅲ)結合形成 Fe(Ⅲ)-草酸鹽絡合物吸附在黃鉀鐵礬表面，形成穩(wěn)定絡合物(Wangetal., 2017)。低分子量有機酸不僅對鐵的地球生物循環(huán)有較大影響，而且對環(huán)境中重金屬的遷移轉化起著極為重要的作用(Xieetal., 2017)。草酸鹽會影響含As(V)黃鉀鐵礬的穩(wěn)定性和共沉淀As(V)的遷移，如草酸鹽于pH=2.5條件下結合礦物表面的Fe(Ⅲ)形成絡合物，從而促進含As(Ⅴ)黃鉀鐵礬的溶解(唐苑君等， 2020)；有研究證實在草酸鹽存在下，反應溶液pH=3.0時會促進As(V)從礦物相遷移至溶液相(Renetal., 2018)。此外Li等(2014)研究亦發(fā)現(xiàn)，pH=1.6～2.2時，添加檸檬酸可減少表觀基質飽和常數，從而降低鐵離子的競爭性，減少產物的抑制作用。

環(huán)境介質中的重金屬和鐵礦物間的相互作用，常與鐵細菌的生物礦化作用密不可分(黨政等， 2018)。低分子量有機酸的存在會影響鐵細菌的代謝和生物礦化(Tuetal., 2019)，如低分子量有機酸的濃度過高會抑制A.ferrooxidans的活性及其Fe2+氧化和溶液(初始pH=2.0～3.0)的酸化程度，從而導致生物酸化速度減慢和重金屬去除效率降低(宋永偉等， 2016)?；诘头肿恿坑袡C酸在鐵細菌的代謝過程和生物礦化環(huán)境意義中的重要作用與影響，本文主要探討了低分子有機酸鈉鹽對A.ferrooxidans培養(yǎng)液體中鐵礦物產物形成的影響，并對主要鐵礦物產物進行表征與觀察。其獲得結果可為A.ferrooxidans存在的相關污染環(huán)境和工程環(huán)境介質中鐵礦物的形成及其物相轉化機理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 鐵細菌和培養(yǎng)介質

實驗用鐵細菌為A.ferrooxidansHX3(其基因數據庫登入號為HQ009292)。細菌培養(yǎng)介質為改進型9 K培養(yǎng)液，即由(NH4)2SO43.5 g、K2HPO40.058 g、KCl 0.116 g、MgSO4·7 H2O 0.58 g和Ca(NO3)2·4 H2O 0.016 8 g 溶解于1 L去離子水中配置而成，并用1∶1 的H2SO4調節(jié)pH值為3.0±0.2，于121℃下濕熱滅菌15 min，待用；鐵細菌所需能量由FeSO4·7 H2O 44.2 g鐵鹽提供。

1.2 細菌培養(yǎng)過程中鐵礦物的形成實驗

3組鐵礦物形成實驗a、b和c， 分別于500 mL錐形瓶中加入300 mL改進型9 K培養(yǎng)液，外源加入系列摩爾濃度(表1)的低分子有機酸鈉鹽草酸鈉(sodium oxalate： 簡寫為SO，Na2C2O4)、檸檬酸鈉(sodium citrate： 簡寫為SC， C6H5Na3O7·2 H2O)和蘋果酸鈉(sodium malate： 簡寫為SM， C4H4Na2O5)； 然后接種5%的A.ferrooxidansHX3菌液，用1∶1的H2SO4調節(jié)初始pH值至2.8±0.1，置于28℃ 和180 r/min轉速的搖床中振動。另外，一致反應條件下，設置對照處理(即未加低分子有機酸鈉鹽的A.ferrooxidansHX3培養(yǎng)液，簡稱CK)，其初始pH值約為2.8。上述處理均設置3個平行樣。

表 1 低分子有機酸鈉鹽的濃度及形成的鐵沉淀物Table 1 Concentrations of low molecular organic sodium salts and the formed iron precipitates

0～168 h反應期間，每隔12 h拍照記錄A.ferrooxidans培養(yǎng)液的顏色和濁度變化情況；測試溶液pH值(采用pHS-3C型數字pH計測定)； 取2 mL溶液在10 000 r/min離心去沉淀后的上清液酸化后于4℃保存，待測Fe2+濃度(采用鄰菲羅啉比色法測定； APHA)。每次取樣前，用稱重法補充因蒸發(fā)等損失的水分。另將分別培養(yǎng)至2、4 和7 d的含A.ferrooxidans菌液中形成的鐵沉淀物離心取出，并用去離子水反復洗滌以去雜質離子，40℃烘干后保存于干燥器皿，待表征分析。

1.3 礦物樣品的表征測試方法

晶型在揚州大學測試中心由德國Bruker公司的D8 Advance型多晶X-ray衍射儀測定(工作條件為CuKα線、40 kV、200 mA，掃描速度4°/min，掃描范圍10°～80°)；對照JCPDS卡片確定測試樣品衍射特征峰對應d值。在揚州大學化學與化工學院采用德國Bruker公司的Tensor 27傅立葉變換紅外光譜儀測定顆粒的表面結構組成及鍵合情況；該儀器配有一個帶有KBr分光鏡的DTGS檢波器，測試背景值400 mg KBr，分辨率為4 cm-1。形貌結構與能譜元素分析在揚州大學測試中心由日本日立公司Hitachi S-4800和Zeiss Supra55場發(fā)射掃描電子顯微鏡測定。

2 結果與討論

2.1 細菌培養(yǎng)過程中溶液顏色變化

A.ferrooxidans培養(yǎng)過程中溶液的顏色隨時間的變化如圖1所示。未加低分子有機酸鈉鹽對照處理(CK)和含有草酸鈉(a組)的所有處理SO4～SO40的溶液顏色在初始48 h內由淡黃色轉變?yōu)榧t棕色，并伴隨有鐵沉淀物形成。含有檸檬酸鈉(b組)的SC40處理中未觀察到有鐵沉淀形成，溶液顏色在初始36 h內由黃綠色轉變成黃棕色，而后逐漸轉變?yōu)樽丶t色；其余處理SC4～SC20在初始48 h內溶液顏色由黃綠色轉變成橘色或紅棕色，且伴隨有鐵沉淀物形成。含有蘋果酸鈉(c組)的SM20處理中無沉淀形成；其余處理SM4～SM10在初始24 h內溶液的顏色由深黃色轉變成紅棕色，且伴隨有鐵沉淀物形成。

2.2 溶液pH值及Fe2+濃度的變化

細菌培養(yǎng)處理的溶液pH值和Fe2+溶度變化情況見圖2。溶液pH值隨著培養(yǎng)時間的延遲整體呈下降趨勢，于132 h后均趨于平穩(wěn)(圖2)；其中含有草酸鈉鹽處理中溶液pH值(除SO40于120 h后)均于60 h后由初始值2.8下降至平穩(wěn)值1.8～2.1范圍內；含有檸檬酸鈉和蘋果酸鈉處理(除SM20外)與對照處理(CK)變化一致，于初始60 h內快速下降，然后波動緩慢下降至平穩(wěn)值1.6～1.9范圍內(SM20處理的溶液pH值為2.2)。

圖 1 含不同濃度低分子有機酸鈉鹽的細菌培養(yǎng)液顏色隨時間的變化Fig. 1 Color changes of bacterial cultures containing the low molecular organic acid salts at their different concentrations with time

培養(yǎng)液pH值下降主要是由于Fe2+被生物催化氧化成的Fe3+水解形成鐵沉淀過程中伴隨有H+釋放至溶液中(Xiong and Guo， 2011； 宋永偉等， 2018)。pH值波動趨于平穩(wěn)過程中略有上升可能是因為在鐵礦物沉淀動態(tài)形成過程中礦物沉淀的溶解速度比其生成速度快，導致反應溶液中OH-略升高；亦可能是隨著反應時間的延續(xù)，形成的礦物逐漸穩(wěn)定，吸附在礦物表面不穩(wěn)定的Fe3+水合物逐步解吸并釋放到液相，使Fe3+和OH-略升高(梁劍茹等， 2011)。所加外源低分子有機酸鈉鹽種類不同，溶液pH值變化呈現(xiàn)一定差異，這可能與不同結構酸根離子對鐵細菌活性的影響和鐵礦物沉淀形成的存在差異有關(Renetal., 2009； 宋永偉等， 2016)。

溶液中Fe2+濃度隨著細菌培養(yǎng)時間的延遲變化趨勢如圖2所示。對照處理(CK)和含低濃度有機酸鈉鹽處理在48 h內Fe2+均被完全氧化成Fe3+。而含高濃度低分子有機酸鈉鹽SO40處理中Fe2+完全被生物催化氧化所需時間延遲了72 h； 含SC40和SM20的處理中7 d后溶液中Fe2+氧化率仍低于30%。顯然，高濃度低分子有機酸鈉鹽對細菌氧化Fe2+的能力有明顯的抑制。3種低分子有機酸鈉鹽對細菌氧化Fe2+能力的抑制影響從大到小的順序為：蘋果酸鈉>檸檬酸鈉>草酸鈉。

2.3 鐵沉淀產物的表征與分析

2.3.1 EDS元素分析與XRD、FTIR圖譜

圖 2 溶液 pH值和 Fe2+濃度隨細菌培養(yǎng)時間的變化Fig. 2 Changes of solution pH values and Fe2+ concentrations with bacterial cultivation time

依據細菌培養(yǎng)溶液中的Fe2+氧化情況，分別對培養(yǎng)至2、4和7 d后形成的鐵沉淀產物進行了表征和分析。低分子有機酸鈉鹽的加入使細菌培養(yǎng)液中外源引進了大量的Na+。故進一步檢測了部分處理SO10、SC20和SM10中細菌培養(yǎng)至4 d時的鐵沉淀產物的元素組成，其EDS分析見表2。結果證實這些鐵礦物產物主要由Fe、O、S和K元素組成，并未檢測到Na元素。在含有500 mmol/L Na+的A.ferrooxidans培養(yǎng)液中， 11周后的鐵礦物沉淀產物中幾乎未檢測到黃鈉鐵礬(Grampetal., 2008)。這一致表明在A.ferrooxidans培養(yǎng)液中，即使Na+含量遠大于K+的含量，但初始礦物相施氏礦依舊優(yōu)先轉化形成黃鉀鐵礬，而不是黃鈉鐵礬。

表 2 4 d后獲得鐵礦物的元素分析 wB/% Table 2 Elemental analysis for iron minerals obtained after 4 d

XRD和FTIR結果分別見圖3和圖4。參照文獻(Liaoetal., 2009； Xuetal., 2014； 張笛等， 2018)中報道的施氏礦(PDF47-1775)和黃鉀鐵礬(PDF36-0427)的XRD譜線，相關處理中沉淀產物對應的XRD譜線結果見圖3。其中，2 d后形成鐵沉淀產物的XRD譜線只呈現(xiàn)了施氏礦的主要特征峰， 對應d值為5.09、 3.39、2.55、2.28、1.95、1.66、1.51、1.48。4 d含蘋果酸鈉的沉淀產物和7 d所有產物的XRD譜線(主要特征峰d值為5.80、5.08、3.63、3.12、2.56、2.27、1.98、1.83)均顯示，它們主要為黃鉀鐵礬礦相；其他XRD譜線存在施氏礦和黃鉀鐵礬礦的主要特征峰，這表明4 d后其他處理中鐵沉淀產物為施氏礦和黃鉀鐵礬的混合相。

此外，細菌培養(yǎng)介質中形成的2、4和7 d的鐵礦物產物的FTIR譜線見圖4。細菌培養(yǎng)至2 d時獲得鐵沉淀的FTIR譜線于693 cm-1處出現(xiàn)O—H…SO4的振動峰，1 122、981和605 cm-1處出現(xiàn)了典型的SO4基團振動峰的吸收峰。與文獻(Xieetal., 2017)報道的施氏礦的紅外光譜線基本一致。細菌繼續(xù)培養(yǎng)至第4 d時，除了SO20和SO40處理中鐵礦物產物的FTIR譜線與純施氏礦基本一致外，其余處理產物的FTIR譜線中均存在黃鉀鐵礬的結構基團對應的吸收峰。7 d鐵沉淀的FTIR譜線于1 195和630 cm-1處出現(xiàn)了SO4伸縮振動峰，1 087和1 005 cm-1處出現(xiàn)了黃鉀鐵礬的SO4吸收峰，在508 cm-1處出現(xiàn)了FeO6正八面體的振動峰，這證實7 d鐵礦物產物的主要礦相為黃鉀鐵礬。

圖 3 鐵沉淀產物的X射線衍射圖Fig. 3 XRD patterns of the iron precipitate products

圖 4 鐵沉淀產物的紅外光譜圖Fig. 4 FTIR spectra of the iron precipitate products

2.3.2 FESEM形貌分析

含有機酸鈉鹽各處理組(即含有草酸鈉、檸檬酸鈉和蘋果酸鈉的a、b和c 3組處理)中部分鐵礦物的FESEM形貌結構如圖5所示。Fe2+氧化趨勢與對照處理一致的含有機酸鈉鹽處理(SO10、SO20、SC20和SM10)形成鐵礦物產物的形貌結果顯示，除SO20的產物中只有少量黃鉀鐵礬塊狀顆粒(直徑約0.4～2 μm)，主要為施氏礦(呈現(xiàn)為針墊-聚集球顆粒，直徑約2.5～5 μm)；其余3個處理的鐵沉淀產物在第4 d時已觀察到大量黃鉀鐵礬顆粒。SC20處理中形成的施氏礦(直徑約0.5～0.8 μm)和黃鉀鐵礬的顆粒尺寸(約0.4～1.5 μm)明顯小于SO10和SM10中形成的鐵沉淀物(施氏礦的顆粒直徑約1～2 μm；黃鉀鐵礬顆粒尺寸約1～2.5 μm)。SO10和SM10處理中形成施氏礦的顆粒形貌極為相似，但它們轉化形成的黃鉀鐵礬的顆粒形貌存在明顯差異(前者顆粒尺寸不如后者均一，且大量顆粒為不規(guī)則菱形狀)。

圖 5 鐵礦物沉淀的動態(tài)形貌Fig. 5 Dynamic morphologies for the iron mineral precipitates

此外，觀察含草酸鈉(a組)細菌培養(yǎng)液SO10、SO20和SO40這3個處理中2、4和7 d產物的形貌變化情況時發(fā)現(xiàn)，隨著草酸鈉濃度的升高，初始鐵沉淀產物針墊球狀施氏礦(圖A2、B2和C2； 圖C4)向菱形塊狀黃鉀鐵礬(圖A4和 B4； 圖A7、B7和C7)的轉化抑制會明顯增強。綜合XRD、FTIR和FESEM結果，可證實SO40處理中鐵礦物產物的礦相轉化明顯被抑制，其主要原因可能是Fe2+被完全氧化的時間較該組其他處理延遲了72 h所致。進一步觀察了細菌培養(yǎng)至第4 d時含草酸鈉組SO4～SO40(插圖、A4、B4和C4)和含蘋果酸鈉處理SM4(插圖)和SM10(圖E4)形成鐵礦物的形貌，也發(fā)現(xiàn)菱形塊狀黃鉀鐵礬顆粒的轉化形成隨著外加有機酸鈉鹽濃度的升高受到抑制。

綜上，在含有A.ferrooxidans的反應溶液中，當Fe2+被完全氧化成Fe3+后(48 h后)，利于施氏礦向黃鉀鐵礬相的轉化(Nazarietal., 2014)。蘋果酸鈉較草酸鈉(或檸檬酸鈉)更能顯著促進施氏礦向黃鉀鐵礬轉化。此外，高濃度的有機酸鈉鹽(SO40和SC20處理)會抑制這兩種礦相的轉化(Renetal., 2009)或不利于鐵礦物的形成(SC40和SM20處理中無鐵沉淀產生)。故含細菌培養(yǎng)液中形成的鐵礦物產物礦相和形貌結構均會受到外加低分子有機酸鈉鹽的種類和濃度的影響。

3 結論

(1) 加入低分子有機酸鈉鹽的濃度較低時對細菌氧化Fe2+的能力作用不明顯；其濃度較高時(蘋果酸鈉、檸檬酸鈉和草酸鈉依次為20、40和40 mmol/L)則會產生明顯的抑制(從大到小的順序為蘋果酸鈉>檸檬酸鈉>草酸鈉)。

(2) 有機酸鈉鹽濃度較低時，利于針墊類球狀施氏礦向菱形黃鉀鐵礬轉化。其中鐵沉淀產物在細菌培養(yǎng)初始階段(2 d內)主要為施氏礦，在細菌培養(yǎng)結束(7 d)后主要為黃鉀鐵礬；在Fe2+完全被氧化后(2～7 d)，鐵沉淀產物初始相施氏礦易向黃鉀鐵礬轉化。

(3) 有機酸鈉鹽濃度較高時，鐵沉淀產物主要為施氏礦；此外施氏礦的形成與黃鉀鐵礬的轉化形成均會受到抑制。

(4) 蘋果酸鈉的加入比草酸鈉和檸檬酸鈉的加入更易促進黃鉀鐵礬的轉化。