牛延菲 王鵬 張曉南 徐怡 曹紅云 蘇鈦

摘要：目的 對雪上一枝蒿中多糖的含量測定方法進行研究，建立紫外分光光度法測定雪上一枝蒿多糖的含量測定方法，并考察不同產(chǎn)地、不同炮制方式對多糖含量的影響。方法 用80%乙醇回流去除還原性糖等雜質(zhì)，后熱水提取多糖，采用苯酚-硫酸比色法于488 nm波長處用紫外-分光光度法測得吸光度值，從而得出其多糖的含量。結(jié)果 雪上一枝蒿多糖以無水葡萄糖計，在0.003～0.015 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R=0.9999），回收率為99.35%～99.85%（n=6），RSD值為0.18%。結(jié)論 本法準確、可靠，重現(xiàn)性好，適用于測定雪上一枝蒿中多糖含量;不同產(chǎn)地不同批次藥材中的多糖含量存在一定差異;炮制方式對雪上一枝蒿多糖含量無顯著影響。

關(guān)鍵詞：雪上一枝蒿;多糖;紫外分光光度法;產(chǎn)地;炮制

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2021）05-0064-06

【Abstract】Objective： To observe the expression of HSP60 and Caspase-3 of acupuncture in rats with cerebral infarction and to preliminarily explore the protective mechanism of acupuncture on neuronal apoptosis in rats with ischemic stroke. Methods： The cerebral ischemia rats were induced by middle cerebral artery suture to make reperfusion injury models and randomly divided into sham operation group， model group， electroacupuncture point group， electroacupuncture non-meridian non-acupoint group and moxibustion acupoint group. After the intervention of electroacupuncture or moxibustion， the neurological deficit score and postural reflex score of the rats were evaluated at 0 and 12 hours after the operation. The expression levels of HSP60 and Caspase-3 mRNA were detected by fluorescence quantitative PCR. Results： The nerve function of the rats in the electro-acupuncture acupoint group and moxibustion acupoint group was better than that of the model group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Compared with that of the model group， the HSP60 mRNA of the electro-acupuncture acupoint group increased significantly， and the difference was significant（P<0.05） while the expression of Caspase-3 mRNA did not change significantly. Conclusion： Electroacupuncture can improve the neurological function of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury. The mechanism may be related to the up-regulation of the expression of HSP60 in brain tissue and mediating anti-neuronal cell apoptosis.

【Key words】Ischemic Stroke; HSP60; Caspase-3; Nerve Cell Apoptosis

雪上一枝蒿為毛茛科植物短柄烏頭Aconitum brachypodum Diels.的干燥塊根[1]。其味苦、辛，性溫，有大毒，主產(chǎn)于云南北部的東川、會澤等地，具有祛風(fēng)鎮(zhèn)痛的功效，用于治療風(fēng)濕疼痛、跌打損傷等癥。雪上一枝蒿含有烏頭堿、次烏頭堿、雪上一枝蒿甲素等多種生物堿和β-谷甾醇、胡蘿卜苷等非生物堿成分，其中生物堿主要是二萜生物堿，目前認為是其主要成分，雪上一枝蒿具有鎮(zhèn)痛、局部麻醉、抗炎和抗腫瘤等藥理作用[2]。以雪上一枝蒿為原料，開發(fā)了包括雪上一枝蒿注射劑、骨痛靈酊、云南白藥氣霧劑、云南白藥膏、腫痛氣霧劑等多種制劑，是云藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展中一個很具特色的品種。

多糖是一種廣泛存在于生物體中含有很多生物活性的天然大分子物質(zhì)，一些動物、植物及微生物都含有多糖，如肝素、鐵皮石斛及真菌[3]，多數(shù)藥用藥材用中，菌類、藻類和根莖類中藥材一般都含具有活性的多糖[4]，許多中藥具有調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)、抗衰老、抗病毒、保護血管、抗炎、抗腫瘤等生物活性，這些生物活性都與多糖存在有關(guān)，多糖還具有毒副性小和無耐藥性的特點，隨著研究的發(fā)展，多糖也越來越被廣泛應(yīng)用于食品保健和醫(yī)藥等領(lǐng)域。

隨著科學(xué)技術(shù)與知識的發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者對雪上一枝蒿中的一些化學(xué)成分如一枝蒿甲素、乙素、烏頭堿等生物堿類成分進行了系統(tǒng)的研究。其藥用有效成分如一支蒿甲素[5]和二萜類生物堿類廣泛被臨床開發(fā)和應(yīng)用。然而有關(guān)于其多糖的研究卻很少，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于雪上一枝蒿多糖含量測定的報道，有文獻顯示，烏頭屬中植物多糖具有強化免疫功能、降血糖、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降膽固醇等生物活性[6]。因此擬參考《中國藥典》[7]對鐵皮石斛、玉竹、枸杞等一些藥用植物多糖含量的測定方法以及文獻報道的附子等烏頭屬植物中多糖的研究方法，對雪上一枝蒿中多糖的提取、顯色及測定方法進行試驗和研究，建立雪上一枝蒿多糖含量測定方法。由于雪上一枝蒿中多糖可能會受到地理因素和炮制方法的影響，因此利用建立的方法對不同產(chǎn)地和不同炮制方式的雪上一枝蒿多糖含量進行測定和分析，為雪上一枝蒿的進一步發(fā)展和在臨床中的應(yīng)用提供更加有利的依據(jù)和參考價值。

1 儀器與材料

數(shù)顯恒溫水浴鍋（型號：HH-6，常州智博瑞儀器制造有限公司），電子天平（梅特勒-托利多，型號：AB204-N），電子天平（梅特勒-托利多，型號：AG285），低速離心機（上海盧湘儀，規(guī)格型號：TD4），紫外可見分光光度計（賽默飛世爾公司，規(guī)格型號：Evolution 300）。

苯酚（AR，批號F1601060，阿拉丁），硫酸（AR，批號20190701，重慶川東化工有限公司），蒽酮（AR，批號20130426，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），3，5-二硝基水楊酸（AR，批號20150921，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），酒石酸鉀鈉（AR，批號20140617，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鈉（AR，批號20170412，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），亞硫酸氫鈉（AR，批號120713，西隴化工股份有限公司），D-無水葡萄糖（含量以99.9%計，批號110833-201707，購自中國食品藥品檢定研究院）。

雪上一枝蒿藥材采自云南東川、會澤、麗江，由云南省研究所正高級工程師高麗鑒定為毛茛科植物短柄烏頭的干燥塊根。研究用樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 前處理方法選擇

2.1.1 提取方式考察 《中國藥典》2015年版一部，其中鐵皮石斛、玉竹、靈芝多糖測定前處理采用熱水提取后乙醇醇沉，黃精、枸杞多糖測定前處理采用80%乙醇回流去除雜質(zhì)后再熱水提取。參考藥典及文獻[8-16]，本文設(shè)計了以下兩種前處理方法。

方法一：精密稱取樣品粉末（過4號篩）1 g，加水100 mL進行回流提取，取回流液10 mL于離心管中加無水乙醇40 mL，離心20 min（4000r·min-1），棄上層清液，將底部沉淀用熱水轉(zhuǎn)移并定容至25 mL容量瓶中，此為正提法，所得溶液即雪上一枝蒿多糖溶液。取1 mL多糖溶液加苯酚（5%）溶液1 mL，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，迅速搖勻，置水浴鍋中沸水浴20 min，后冰水浴5 min，進行測定。

方法二：精密稱取雪上一枝蒿粉末（過4號篩）0.1 g，加乙醇50 mL，體積分數(shù)為80%，80℃水浴回流1.5h，趁熱過濾，過濾后再用80%熱乙醇10 mL進行清洗，洗3次，將濾紙和所得殘渣繼續(xù)加200 mL水，沸水浴回流2h。取出放冷后，移回流液10 mL于塑料離心管中離心20 min（4000r·min-1），所得的上層清液為雪上一枝蒿多糖溶液。精密移取所得的多糖溶液1 mL于10 mL的塑料離心管中。以下操作同方法一，根據(jù)標準曲線計算含量。

根據(jù)檢測結(jié)果，方法一得到的多糖含量是方法二的2倍，采用碘化鉀試液對其進行淀粉鑒別，提示方法一含有較多的淀粉，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高，且平行樣重復(fù)性較方法二差，因此選擇先用80%乙醇回流去除還原性糖等雜質(zhì)，后使用熱水提取雪上一枝蒿多糖。

2.1.2 80%乙醇加入量考察結(jié)果 取本品粉末（過4號篩）約0.2 g，精密稱定，共3份，分別加80%乙醇50、100、150 mL加熱回流1.5 h，趁熱濾過，以下操作同“2.1.1”第二法。根據(jù)檢測結(jié)果，80%乙醇50、100、150 mL時，對多糖含量影響較小，50 mL已經(jīng)可以去除雜質(zhì)，因此選擇80%乙醇用量為50 mL。

2.1.3 熱水用量考察 取本品粉末（過4號篩）約0.2 g，精密稱定，共3份，分別加80%乙醇50 mL加熱回流1.5 h，趁熱濾過，濾渣與濾器用熱80%乙醇30 mL分次洗滌，濾渣連同濾紙置燒瓶中，加水100、200、300 mL，稱定重量，加熱回流2 h，以下操作同“2.1.1”第二法。根據(jù)檢測結(jié)果，熱水加入量為100、200、300 mL時，對多糖含量影響較小，加入量200 mL時，吸光度較合適（吸光度宜在0.3～0.7），因此選擇熱水加入量為200 mL。

2.2 顯色方法選擇 《中國藥典》2015年版一部收載鐵皮石斛、玉竹、靈芝、黃精、枸杞多糖的檢測方法主要包括苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、DNS法。查閱相關(guān)文獻，苯酚和蒽酮顯色法實驗操作簡單，準確性與穩(wěn)定性更好，在測定多糖的含量時使用率較高。為篩選準確的雪上一枝蒿多糖檢測方法，本文對3種顯色方法進行了對比研究。

2.2.1 苯酚-硫酸法 在濃硫酸的條件下，因加入苯酚使多糖水解產(chǎn)生糠醛衍生產(chǎn)物從而使溶液呈現(xiàn)出橙黃色，一般情況下所產(chǎn)生的顏色深則說明糖的濃度比較大，若顏色淺則說明所含的糖的濃度小。然后用紫外-分光光度計進行掃描，可得在488nm波長處多糖有最大吸收對應(yīng)的吸光度值從而可以得知多糖含量，本文使用苯酚硫酸法顯色雪上一枝蒿多糖，根據(jù)全波長掃描可知，該法在488nm處有最大吸收。

2.2.2 DNS法 利用二硝基水楊酸在一定條件下和還原糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)的方法稱為DNS法，反應(yīng)發(fā)生時在煮沸條件顯棕紅色的3-氨基-5硝基水楊酸產(chǎn)物。本文使用DNS法顯色雪上一枝蒿多糖，根據(jù)全波長掃描可知，該法無最大吸收，不適用于雪上一枝蒿多糖的檢測。

2.2.3 蒽酮-硫酸法 在高溫條件下時糖類被濃硫酸作用而脫水縮合生成呈藍綠色的糠醛衍生物的方法為蒽酮-硫酸法，此法的最大吸收峰一般在620nm處出現(xiàn)。本文使用蒽酮硫酸法顯色雪上一枝蒿多糖，該法在625nm處有最大吸收，但吸光度較低，靈敏度低。

2.2.4 結(jié)論 根據(jù)苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、DNS法3種顯色方法的全波長掃描圖可知，當(dāng)采用苯酚-硫酸法進行測定時，無水葡萄糖對照品和雪上一枝蒿多糖在488nm處均最大吸收，峰型單一且吸光度合適，因此最終選則苯酚-硫酸法進行顯色。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 對照品溶液的制備 取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.3.2 標準曲線的制備 精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置20 mL具塞試管中，各加水補至1.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL（臨用配置），搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在488nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過四號篩）約0.2 g，精密稱定，加80%乙醇50 mL，加熱回流1.5 h，趁熱濾過，濾渣與濾器用熱80%乙醇30 mL分次洗滌，濾渣連同濾紙置燒瓶中，加水200 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，取10 mL，置10 mL離心管中，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)）20 min，精密吸取供試品溶液0.5 mL，置具塞試管中，加水補至1.0 mL，照標準曲線的制備項下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中含葡萄糖的重量（mg），計算，即得。

2.3.4 專屬性與系統(tǒng)適用性 取本品粉末（過四號篩）約0.2 g，精密稱定，按“2.3.3”供試品制備方法制備，對空白溶液、標曲中間濃度，依法進行全波長掃描，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，488nm處空白溶液無明顯吸收，對照品與供試品溶液均有最大吸收，表明本方法專屬性良好。

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密稱取D-無水葡萄糖對照品10.21 mg，用水配制成0.102 mg/mL的對照品溶液。吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按“2.3.2”標準曲線制備方法制備，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結(jié)果見表2。線性試驗表明：無水葡萄糖在0.003～0.015 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸方程Y=74.913x-0.0085，R=0.999。

2.3.6 精密度試驗 取0.6 mL對照品顯色后的反應(yīng)液，連續(xù)測定6次，重復(fù)性試驗的RSD值≤2%，表明該方法儀器精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗 精密稱取雪上一枝蒿樣品0.2 g，共6份，按“2.3.3”項下方法制備多糖溶液，上機進行重復(fù)性測定，RSD值≤2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 準確度試驗 對照品溶液制備：精密稱取無水葡萄糖30.00 mg加水定容到10 mL的容量瓶中，即得濃度為3 mg/mL的對照品溶液。

取已知含量（含量為6.145%）的本品粉末（過四號篩）約0.2 g，各6份，精密稱定，分別加80%乙醇50 mL，加熱回流1.5 h，趁熱濾過，濾渣與濾器用熱80%乙醇30 mL分次洗滌，濾渣連同濾紙置燒瓶中，加入上述對照品溶液2 mL，加水198 mL，其余按“2.3.3”項測定法，依法測定結(jié)果見表3。從結(jié)果可知，平均加樣回收率為99.35%～99.85%，該方法準確度符合《中國藥典》2015年版四部通則“9101藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導(dǎo)原則”的規(guī)定（待測成分含量1%回收率限度為92%～105%）。

2.3.9 溶液穩(wěn)定性 取本品粉末（過四號篩）約0.2 g，精密稱定，按“2.3.3”制備供試品溶液，測定0、20、40、60、80、100、130 min的吸光度值，RSD值≤2%，表明供試品溶液在130 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 樣品測定

2.4.1 不同產(chǎn)地藥材含量測定 取不同產(chǎn)地的15批藥材，按“2.3.3”項測定，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，云南東川、會澤、麗江產(chǎn)區(qū)的雪上一枝蒿多糖含量在1.2%～5.8%之間，不同產(chǎn)地不同批次藥材多糖含量存在一定差異。

2.4.2 不同炮制方式含量測定 雪上一枝蒿為大毒藥材，在使用時，本品須經(jīng)過炮制方可入藥。為考察炮制對多糖的含量影響，對民間習(xí)用炮制方法進行了調(diào)研，考察了蒸、煮、高壓（121℃、15 min）炮制后不同溫度（50、60、75、100、130、150℃）干燥的雪上一枝蒿飲片的多糖含量。結(jié)果見表5，根據(jù)檢測結(jié)果，高壓（121℃、15 min）炮制后的多糖含量出現(xiàn)升高，推測可能是由于高壓條件下出現(xiàn)淀粉或其他物質(zhì)的糊化引起的，有待于進一步研究，而蒸和煮炮制后多糖含量無明顯變化。

3 討論

多糖具有抗腫瘤、抗炎等多種藥理作用、生物活性多樣且毒性小。烏頭屬植物的臨床應(yīng)用和一些藥理作用不能完全被二萜類生物堿成分解釋，故有學(xué)者推測另一類生物活性成分多糖很可能也在烏頭屬植物的臨床治療及藥物應(yīng)用中發(fā)揮了重要作用。本論文首次建立紫外分光光度法測定雪上一枝蒿中多糖含量的檢測方法，并按照《中國藥典》2015版進行了方法學(xué)驗證，驗證結(jié)果表明該方法簡便易行、準確度高。

為考察雪上一枝蒿多糖會受到地理因素和炮制方法的影響程度，利用建立的方法對不同產(chǎn)地和不同炮制方式的雪上一枝蒿多糖含量進行測定和分析。研究結(jié)果表明：不同產(chǎn)地不同批次藥材多糖含量存在一定差異，云南東川、會澤、麗江3個產(chǎn)區(qū)的雪上一枝蒿多糖含量在1.2%～5.8%之間;蒸、煮透心后不同溫度（50、60、75、100、130、150℃）干燥的雪上一枝蒿飲片的多糖含量無明顯差異，高壓（121℃、15 min）炮制后的多糖含量出現(xiàn)略微升高，推測可能是由于高壓條件下出現(xiàn)淀粉或其他物質(zhì)的糊化引起的，有待于進一步研究。

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