張辛寧，劉楊佳，吳 悅，葉田田，牟良玉，劉東春*，王淑君*

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

近年來(lái)，腫瘤分子靶向技術(shù)已成為腫瘤治療的熱點(diǎn)，因其特異性強(qiáng)、耐受性好、療效高、毒性及不良反應(yīng)低等特點(diǎn)而備受矚目[1]。紫杉醇是從紫衫屬短葉紫衫莖皮中提取出的具有四環(huán)二萜結(jié)構(gòu)的類紫杉烷天然藥物組分，在多種癌癥，如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌等的臨床治療中已經(jīng)得到了應(yīng)用。紫杉醇水溶性差、口服生物利用度低[2]，所以國(guó)內(nèi)外上市的紫杉醇注射液在制備時(shí)，需加入聚氧乙烯蓖麻油和無(wú)水乙醇作為增溶劑才能供臨床使用。由于溶解度和選擇性較差等特點(diǎn)，紫杉醇存在著很多缺陷，例如毒副作用大、使用不便、易產(chǎn)生耐藥性，且無(wú)法透過(guò)血腦屏障[3]。

藥物科學(xué)家們?cè)噲D通過(guò)改變紫杉醇的結(jié)構(gòu)和劑型以解決上述問(wèn)題[4-6]，因其分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，通過(guò)改變 PH 值、成鹽法、助溶劑都不能很好地解決其溶解度問(wèn)題[7]。研究者們從提高藥物的溶解性和改造藥物化學(xué)合成途徑兩方面入手，試圖通過(guò)改造官能團(tuán)或結(jié)構(gòu)來(lái)合成全新的化合物[8-9]。紫杉醇衍生物（TAH）是一種新型紫杉醇衍生物，是通過(guò)改造紫杉醇的官能團(tuán)和結(jié)構(gòu)合成的新化合物，結(jié)構(gòu)如圖1 所示，目前正在處于開發(fā)研究階段。本試驗(yàn)旨在對(duì)紫杉醇衍生物 TAH 進(jìn)行制劑學(xué)性質(zhì)研究，篩選出最佳處方及工藝，對(duì) TAH 脂質(zhì)體（TAH-Lip）的理化性質(zhì)等進(jìn)行系統(tǒng)考察。

Fig.1 The chemical structure of TAH圖1 TAH的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

EX125DZH 十萬(wàn)分之一天平（奧豪斯儀器有限公司）；超聲波清洗器（上海聲彥超聲波儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；RE52CS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海生化亞榮儀器廠）；DF-101S 集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器）；UV-9100 紫外分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器有限公司）；TBL80-2B 低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Zetasizer Nano 納米粒度和 Zeta 電位儀（馬爾文儀器有限公司）；Waters2695/2996 高效液相色譜儀（Waters 公司）；高壓均質(zhì)機(jī)（安拓思納米技術(shù)有限公司）；101-3 電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

TAH 原料藥（沈陽(yáng)鑫泰格爾醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，純度 ≥ 98%）；蛋黃卵磷脂（PL100M、PC98T，上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司）；大豆卵磷脂（S100，德國(guó)利寶益公司）；大豆卵磷脂（SPC，上海太偉藥業(yè)有限公司）；膽固醇（艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）；維生素 E（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；維生素 C（陜西圣瑞醫(yī)藥科技有限公司）；BHT、BHA（西安悅來(lái)醫(yī)藥科技有限公司）；賴氨酸（廣州仁信生物科技有限公司）；甲醇（色譜純，天津富宇精細(xì)化工有限公司）、無(wú)水乙醇（分析純，天津康科德公司）；甲酸（色譜純，迪馬科技有限公司）；乙酸銨（色譜純，上海創(chuàng)賽科技有限公司）；葡聚糖凝膠 G-50（上海源葉生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 制備方法的篩選

TAH 適用于被動(dòng)載藥法制備脂質(zhì)體。薄膜分散法和乙醇注入法是實(shí)驗(yàn)室常用的被動(dòng)載藥法。本實(shí)驗(yàn)分別考察了這兩種制備方法，對(duì)所得脂質(zhì)體外觀和包封率進(jìn)行比較。

2.1.1 薄膜分散法

稱取 TAH 20 mg、膽固醇（Chol）50 mg、磷脂（PC）400 mg 溶于 5 mL 無(wú)水乙醇中，超聲溶解，于 60 ℃ 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)水乙醇揮干，形成干燥薄膜，向燒瓶中加入 10.0 mL 注射用水，在 40 ℃ 水浴水化 30 min，用超聲細(xì)胞粉碎機(jī) 400 W 探頭超聲 10 min（工作3 s，間歇3 s），依次過(guò) 0.45、0.22μm 的微孔濾膜整粒，測(cè)定脂質(zhì)體包封率。

Fig.2 Flow diagram for TAH liposomes prepared by thin film dispersion method圖2 薄膜分散法制備TAH 脂質(zhì)體的工藝流程圖

2.1.2 乙醇注入法

按處方量稱取 TAH 20 mg、Chol 50 mg、PC 200 mg 溶于 3 mL 無(wú)水乙醇中，超聲溶解，用注射器吸取乙醇液，緩慢注入 10.0 mL 注射用水中。在 60 ℃ 下恒溫磁力攪拌至無(wú)醇味，約 1 h，冷卻至室溫，用超聲細(xì)胞粉碎機(jī) 400 W 探頭超聲 10 min（工作3 s，間歇3 s），依次過(guò) 0.45、0.22μm 的微孔濾膜整粒，測(cè)定脂質(zhì)體包封率。

Fig.3 Flow diagram for TAH liposomes prepared by ethanol injection method圖3 乙醇注入法制備 TAH 脂質(zhì)體的工藝流程圖

2.1.3 制備方法的確定

結(jié)果見表1。該結(jié)果表明，在制備過(guò)程中發(fā)現(xiàn)乙醇注入法有時(shí)會(huì)有結(jié)晶析出，出現(xiàn)絮凝、分層現(xiàn)象，且脂質(zhì)體不成形。薄膜分散法工藝穩(wěn)定，制備脂質(zhì)體的包封率高于乙醇注入法，薄膜分散法在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過(guò)程中，圓底燒瓶?jī)?nèi)壁上形成一層脂質(zhì)薄膜，在此過(guò)程中可能發(fā)生了一定的相互作用，增加了相互間親和力，經(jīng)水化后得到的脂質(zhì)體混懸液均勻、穩(wěn)定，獲得了較高的包封率。因此，最終選用薄膜分散法制備 TAH 脂質(zhì)體。

Table 1 The entrapment efficiencies of liposomes prepared by different methods (n = 3)表1 不同制備方法制得脂質(zhì)體包封率結(jié)果（n = 3）

2.2 制備工藝考察

脂質(zhì)體的成膜溫度及時(shí)間、水化溫度及時(shí)間、均質(zhì)次數(shù)及壓力對(duì)脂質(zhì)體性狀和穩(wěn)定性影響較大。因此，對(duì)這些工藝條件進(jìn)行單因素考察，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定脂質(zhì)體的工藝條件。

2.2.1 成膜溫度考察

固定其它因素不變，考察成膜溫度分別為 40、50、60 ℃ 制備的脂質(zhì)體對(duì)其包封率的影響，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，成膜溫度在 40～60 ℃ 之間對(duì)其包封率無(wú)影響，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性較好，但制備脂質(zhì)體時(shí)溫度應(yīng)在相轉(zhuǎn)變溫度以上，此時(shí)脂質(zhì)體雙分子層排列將更為緊密，脂質(zhì)體穩(wěn)定性增強(qiáng)[10]，溫度的升高會(huì)加快不飽和磷脂的氧化，故成膜溫度選擇 40 ℃。

Table 2 Effects of film-forming temperature on the quality of liposomes表2 成膜溫度對(duì)脂質(zhì)體質(zhì)量的影響

2.2.2 水化條件考察

固定其它因素不變，考察水化溫度分別為 40、50、60 ℃，水化時(shí)間分別為 20、30、40 min制備的脂質(zhì)體對(duì)包封率和粒徑的影響，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，水化溫度為在 40～60 ℃ 之間對(duì)其包封率無(wú)影響，結(jié)合磷脂的相變溫度，考慮制劑穩(wěn)定性，最終選擇水化溫度為 40 ℃。水化 20 min 時(shí)，不能水化完全。水化 30、40、50 min 結(jié)果無(wú)明顯差別，因此，最終選擇水化時(shí)間為 30 min。

Table 3 Effects of hydration conditions on the quality of liposomes表3 水化條件對(duì)脂質(zhì)體質(zhì)量的影響

2.2.3 高壓均質(zhì)法考察

固定其它因素不變，考察均質(zhì)次數(shù)分別為 4、7、10 次和均質(zhì)壓力 600、700、800 bar 對(duì)制備的脂質(zhì)體粒徑的影響，結(jié)果見表4。結(jié)果表明平均粒徑和均質(zhì)次數(shù)成反比，均質(zhì)超過(guò) 7 次后繼續(xù)增加均質(zhì)次數(shù)所得脂質(zhì)體的平均粒徑變化不大，當(dāng)均質(zhì) 10 次時(shí)，PDI ＜ 0.3，因此，將均質(zhì)次數(shù)定為 10 次。當(dāng)均質(zhì)壓力為 700～800 bar 時(shí)，PDI ＜ 0.3，800 bar 可獲得更理想的粒徑。因此，將均質(zhì)壓力定為 800 bar。

Table 4 The effects of times and pressures of homogenizing on the particle sizes of TAH liposomes (n = 3)表4 均質(zhì)次數(shù)和壓力對(duì) TAH 脂質(zhì)體粒徑的影響（n = 3）

2.3 處方篩選

根據(jù)脂質(zhì)體常用的輔料及種類，以包封率為重點(diǎn)考察指標(biāo)，對(duì)輔料的種類及用量進(jìn)行篩選，根據(jù)處方單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定脂質(zhì)體的處方組成。

2.3.1 磷脂種類的考察

固定其它因素不變，分別使用不同廠家的磷脂制備脂質(zhì)體，測(cè)定其包封率。結(jié)果見表5。結(jié)果表明，兩種蛋黃卵磷脂制備的脂質(zhì)體外觀渾濁，包封率低，而大豆卵磷脂制備的脂質(zhì)體均勻、穩(wěn)定，且大豆卵磷脂 S100 制得的脂質(zhì)體包封率最高。因此，選用德國(guó)利寶益公司生產(chǎn)的 S100大豆卵磷脂。

Table 5 The effects of phospholipid species on the quality of liposomes (n = 3)表5 磷脂種類對(duì)脂質(zhì)體質(zhì)量的影響（n = 3）

2.3.2 藥脂比的考察

固定其它因素不變，分別以 TAH : PC（w / w）為 1 : 10、1 : 15、1 : 20、1 : 25、1 : 30，按“2.1.1項(xiàng)”方法制備脂質(zhì)體，測(cè)定脂質(zhì)體包封率，結(jié)果見表6。結(jié)果表明，隨著脂質(zhì)量的增加，包封率隨之上升，當(dāng)藥脂比為 1 : 20（w / w）時(shí)，包封率達(dá)到最大值。當(dāng)藥脂比為 1 : 30 時(shí)，水化后的脂質(zhì)體較為渾濁，放置一段時(shí)間后出現(xiàn)藥物沉淀，穩(wěn)定性不好。

Table 6 The effects of drug to lipids mass ratio on the quality of liposomes (n = 3)表6 藥脂比對(duì)脂質(zhì)體質(zhì)量的影響（n = 3）

2.3.3 PC 與 Chol 比例的考察

固定其它因素不變，分別以PC : Chol（w/w）為3 : 1、5 : 1、8 : 1、10 : 1：12 : 1，按“2.1.1項(xiàng)”方法制備脂質(zhì)體，測(cè)定脂質(zhì)體包封率，結(jié)果見表7。結(jié)果表明，當(dāng)PC : Chol（w/w）為3 : 1時(shí)，有絮狀沉淀，脂質(zhì)體未能能成型。后隨著PC比例的增加，包封率隨之上升，當(dāng)PC : Chol為10 : 1（w/w）時(shí)，包封率達(dá)到最大值，繼續(xù)提高PC比例，包封率反而降低。

Table 7 The effects of phospholipid to cholesterol ratio on the quality of liposomes (n = 3)表7 磷脂與膽固醇比例對(duì)脂質(zhì)體質(zhì)量的影響（n = 3）

2.3.4 抗氧劑的考察

磷脂是制備脂質(zhì)體使用的主要膜材，但其不穩(wěn)定，容易氧化，導(dǎo)致脂質(zhì)體的穩(wěn)定性下降。因此在脂質(zhì)體制備過(guò)程中，常常會(huì)添加抗氧劑，抑制磷脂的游離基反應(yīng)從而防控氧化，常用的抗氧劑有維生素 E（VE）、維生素 C（VC）、賴氨酸等。TAH 脂質(zhì)體氧化程度采用氧化指數(shù)，即A233與A215的比值作為檢測(cè)磷脂氧化的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.3.4.1 不同抗氧劑的抗氧化效果考察

磷脂是制備脂質(zhì)體使用的主要膜材，但其不穩(wěn)定，容易氧化，導(dǎo)致脂質(zhì)體的穩(wěn)定性下降。因此在脂質(zhì)體制備過(guò)程中，常常會(huì)添加抗氧劑，抑制磷脂的游離基反應(yīng)從而防控氧化，常用的抗氧劑有維生素 E（VE）、維生素 C（VC）、丁基羥基茴香醚（butyl hydroxyanisole，BHA）、二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、賴氨酸。氧化程度擬采用氧化指數(shù)，即A233與A215的比值作為檢測(cè)磷脂氧化的評(píng)價(jià)指標(biāo)。將含有 0.02% 不同抗氧化劑的空白脂質(zhì)體于 40 ℃ 加熱 15 h后，用氧化指數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示。結(jié)果表明，空白組的氧化程度較大，吸光度由剛制備時(shí)的 0.202 增加至 0.634，而添加不同抗氧劑實(shí)驗(yàn)組的氧化指數(shù)都小于空白組?？寡鮿┳饔眯Ч樞?yàn)椋築HT ＞ VE＞ BHA ＞ VC＞ 賴氨酸，添加 BHT 的實(shí)驗(yàn)組抗氧化效果最好。

Fig.4 Antioxidant effects of different antioxidants on liposomes圖4 不同抗氧化劑對(duì)脂質(zhì)體的抗氧化效果

2.3.4.2 抗氧劑用量考察

分別配制不同濃度的 BHT 乙醇溶液（0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.15%、0.20%）替代無(wú)水乙醇制備空白脂質(zhì)體。于 40 ℃ 加熱 15 h 后，分別于 3、6、9、12、18 h 測(cè)定氧化指數(shù)，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，加入 BHT 后可以有效防控脂質(zhì)體氧化。3 h 內(nèi)各氧化指數(shù)相差不大，隨著 BHT 加入量的增加，氧化指數(shù)隨之減小，在 BHT 濃度為 0.10% 及 0.15% 時(shí)，BHT 抗氧化效果基本一致，因此選用濃度為 0.10% 的 BHT 作抗氧劑。

Fig.5 Effects of different BHT dosages on the antioxidant effect of liposomes圖5 不同BHT用量對(duì)脂質(zhì)體抗氧化效果的影響

2.4 脂質(zhì)體含量、有關(guān)檢測(cè)

2.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

精密稱取 TAH 適量，加甲醇溶解并稀釋，配制成濃度為 0.02 g·L-1的溶液，選取甲醇溶液作為空白對(duì)照，測(cè)定結(jié)果表明，TAH 在波長(zhǎng) 283 nm 有最大吸收峰，而輔料在此處無(wú)吸收，故確定測(cè)定波長(zhǎng)為 283 nm。

2.4.2 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate?Plus C18（150 mm × 4.6 mm，3.5μm）；流動(dòng)相：5 mmol·L-1乙酸銨為水相，以水相 : 乙腈（V/V）= 60 : 30為流動(dòng)相A相，以水相 : 乙腈（V/V）= 20 : 80為流動(dòng)相B 相；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20μL；進(jìn)樣盤溫度：10 ℃。按表8進(jìn)行梯度洗脫。

Table 8 Mobile phase gradient elution program表8 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取 TAH 適量，配成質(zhì)量濃度為 0.5 g·L-1的儲(chǔ)備液。分別精密移取該儲(chǔ)備液 0.5、0.8、1.0、1.2 和 1.5 mL 于 10 mL 量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為 25、40、50、60 和 75 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“2.4.2色譜條件”進(jìn)樣測(cè)定。以濃度（ρ，mg·L-1）與峰面積（A）進(jìn)行線性回歸處理，求得線性回歸方程為A= 2.476 9 × 104ρ- 1.065 × 103（r= 0.999 9）。

2.4.4 回收率與精密度試驗(yàn)

按處方配比制備空白脂質(zhì)體，加入到含處方量藥物溶液的量瓶中，用甲醇破乳，并稀釋定容，使藥物質(zhì)量濃度分別為 25、50、75 mg·L-1，離心，取上清液進(jìn)行含量測(cè)定，并計(jì)算回收率。同法制備上述溶液，于日內(nèi)及日間測(cè)定吸光度并計(jì)算藥物含量，考察方法的精密度。低、中、高質(zhì)量濃度（25、50、75 mg·L-1）藥物的方法回收率為（100.11 ± 0.76）%；低、中、高質(zhì)量濃度藥物的日內(nèi) RSD 分別為 0.85、0.79、0.62；日間 RSD 分別為 0.95、0.89、0.70。

2.4.5 樣品測(cè)定

精密吸取脂質(zhì)體供試品 5.0 mL 于 20 mL 量瓶中，加甲醇破乳，并定容至刻度，超聲 3 min，于 4 000 r·min-1離心 10 min，取上清液得有關(guān)物質(zhì)待測(cè)樣品；精密吸取有關(guān)物質(zhì)待測(cè)樣品 1 mL至 10 mL 量瓶中，稀釋并定容至刻度，得含量待測(cè)樣品。按“2.4.2項(xiàng)”方法檢測(cè)，計(jì)算脂質(zhì)體中藥物的含量及有關(guān)物質(zhì)。測(cè)定脂質(zhì)體中 TAH 含量為（1.90 ± 0.22）g·L-1，總雜為（0.24 ± 0.17）%。

2.5 脂質(zhì)體包封率與載藥量的測(cè)定

按照最優(yōu)處方及工藝制備 TAH 脂質(zhì)體，將樣品加于微型凝膠柱的頂端，3 000 r·min-1離心3 min，繼續(xù)加入 0.2 mL 蒸餾水于凝膠柱的頂端，按上述條件離心洗脫，重復(fù)操作 4 次，合并洗脫液至 20 mL 容量瓶中，加少許甲醇超聲 2 min，使其破乳，靜置至室溫，甲醇定容至刻度，在紫外 283 nm 測(cè)定吸光度，代入線性方程計(jì)算吸光度C1；另精密量取 0.2 mL 脂質(zhì)體至 20 mL容量瓶中，加少許甲醇超聲 2 min，使其破乳，靜置至室溫，甲醇定容至刻度，在紫外 283 nm 處測(cè)定吸光度，代入線性方程計(jì)算濃度C2。計(jì)算 TAH 脂質(zhì)體包封率（entrapment efficiency，EE），包封率的計(jì)算公式為：包封率 EE% =C1/C2× 100%。載藥量指脂質(zhì)體中藥量與載體材料的重量之比。載藥量的計(jì)算公式為：載藥量 LC% =mTAH× EE% /m脂質(zhì)× 100%。測(cè)定三批樣品，結(jié)果表明凍干制劑包封率為（92.89 ± 1.32）%，載藥量為（4.03 ± 1.00）%。

2.6 高溫加速試驗(yàn)

分別制備含抗氧劑及不含抗氧劑的 TAH 脂質(zhì)體混懸液，避光，置于高溫 60 ℃ 條件下貯存 15 天，分別于試驗(yàn)期間的第 0、5、10、15 天時(shí)取樣，對(duì)其各項(xiàng)外觀、粒徑、包封率、含量、有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行考察，結(jié)果見表9和表10。

Table 9 Accelerated test results (containing antioxidants)表9 加速試驗(yàn)結(jié)果（含抗氧劑）

Table 10 Accelerated test results (without antioxidants)表10 加速試驗(yàn)結(jié)果（不含抗氧劑）

結(jié)果顯示，兩批 TAH 脂質(zhì)體加速 10 天內(nèi)，外觀性狀均未發(fā)生顯著變化，包封率、粒徑、PDI、含量、有關(guān)物質(zhì)均無(wú)明顯差異。當(dāng)加速第 15 天時(shí)，不含抗氧劑的 TAH 脂質(zhì)體產(chǎn)生少量降解產(chǎn)物及雜質(zhì)，而含抗氧劑的 TAH 脂質(zhì)體，降解產(chǎn)物較少，相對(duì)較穩(wěn)定。從高溫加速試驗(yàn)可以看出，含抗氧劑，用最佳處方及工藝制備的 TAH 脂質(zhì)體安全穩(wěn)定，質(zhì)量可控。

2.7 形態(tài)觀察

用透射電鏡（TEM）進(jìn)行形態(tài)觀察。脂質(zhì)體樣品經(jīng)適量去離子水稀釋后，滴在噴碳銅網(wǎng)上，用 2% 磷鎢酸染色，用濾紙轉(zhuǎn)移多余的液體后風(fēng)干，于透射電子顯微鏡下觀察其形態(tài)，并拍攝照片，結(jié)果見圖6。由圖6 可見所制備的脂質(zhì)體樣品多為圓形或類圓形，粒徑大約在 70 nm 左右。

Fig.6 The transmission electron microscope (TEM) image of liposomes圖6 脂質(zhì)體透射電鏡圖

2.8 脂質(zhì)體的粒徑和 Zeta 電位測(cè)定

將最優(yōu)處方及工藝制備的脂質(zhì)體經(jīng)適當(dāng)稀釋，測(cè)定平均粒徑和 Zeta 電位，見圖7 和 8。測(cè)得供試品的平均粒徑為 78.24 nm 左右，PDI 為 0.240，平均 Zeta 電位為 -0.150 mV，接近電中性。

Fig.7 The size distribution of TAH liposomes圖7 TAH 脂質(zhì)體的粒徑分布

Fig.8 The Zeta potential of TAH liposomes圖8 TAH 脂質(zhì)體的 Zeta 電位

2.9 體外釋放試驗(yàn)

按照釋放度測(cè)定方法籃法（通則 0931 第一法）進(jìn)行體外釋放的測(cè)定。剪取 6 份同樣長(zhǎng)度（約6 cm）的透析袋，用注射用水將里外均清洗干凈，用魚線捆綁一端，復(fù)溶后的凍干成品混懸液 4 mL，置于透析袋中，再用魚線將另一端扎緊放入裝有 1 000 mL 釋放介質(zhì)的溶出杯中，盡量保證有效釋放的透析袋長(zhǎng)度一致，將透析袋置于轉(zhuǎn)籃中，本文模擬體內(nèi)環(huán)境，（37 ± 0.5）℃、100 r·min-1，由于 TAH 為脂溶性藥物，因此添加吐溫 80 增溶，提供了漏槽條件，釋放介質(zhì)為 0.5% Tween-80水溶液。在轉(zhuǎn)籃接觸液面的一刻開始計(jì)時(shí)，于 0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h 取樣 10 mL釋放介質(zhì)，同時(shí)補(bǔ)充 10 mL 新鮮釋放介質(zhì)，取出的釋放介質(zhì)經(jīng) 0.45μm 有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，棄去 5 mL 初濾液，取續(xù)濾液 1 mL 于液相小瓶中，進(jìn)行液相檢測(cè)，計(jì)算累積釋放量，繪制體外釋放曲線，結(jié)果見圖9。結(jié)果表明，TAH 脂質(zhì)體有一定的緩釋效果，釋放速率顯著低于對(duì)照組。脂質(zhì)體累積 24 h 釋放藥物量為 48% 左右，可能部分藥物包裹在脂質(zhì)體中未被釋放出來(lái)，進(jìn)一步說(shuō)明了脂質(zhì)體具有一定的緩釋性和穩(wěn)定性，在溶出介質(zhì)中具有一定的穩(wěn)定性。

Fig.9 In vitro release of TAH and TAH liposomes (n = 3)圖9 TAH 及其脂質(zhì)體的體外釋放

3 討論

a.本文考察了乙醇注入法和薄膜分散法兩種脂質(zhì)體的制備方法。乙醇注入法是將脂質(zhì)和藥物溶解在少量的乙醇中，再注入水化介質(zhì)，并揮去乙醇。在此過(guò)程中，脂質(zhì)和藥物遇水溶解度降低從而析出，脂質(zhì)自發(fā)形成親水端朝向水相的脂質(zhì)雙層膜形成脂質(zhì)體囊泡，而藥物由于其疏水性而進(jìn)入雙層膜中間的疏水層，藥物析出晶體的幾率較大。因此，乙醇注入法對(duì)于很多脂溶性藥物包封率較低，在制備過(guò)程中容易析出晶體，且在制備脂質(zhì)體時(shí)，有機(jī)溶劑比較難去除，要求制備溫度高，耗時(shí)長(zhǎng)，與此同時(shí)對(duì)藥物及脂質(zhì)的穩(wěn)定性有很大影響。而薄膜分散法是在水化之前，將藥物以分子狀態(tài)均勻分散在脂質(zhì)體膜中，不以晶體狀態(tài)析出。加入水化介質(zhì)振搖時(shí)，在機(jī)械力和水化力的作用下將脂質(zhì)膜水化下來(lái)，藥物保留在脂質(zhì)中，脂質(zhì)直接成為雙分子囊泡，對(duì)脂溶性藥物來(lái)說(shuō)有利于得到較高的包封率。本文采用薄膜分散法制得的脂質(zhì)體，外觀均勻，為伴有淡藍(lán)色乳光的混懸液。

b.膽固醇屬于兩親性物質(zhì)，對(duì)脂質(zhì)體膜流動(dòng)性起調(diào)節(jié)作用。在相變溫度以上時(shí),它能抑制脂質(zhì)分子的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)，降低膜的流動(dòng)性；在相變溫度以下時(shí)，它又能增加脂質(zhì)雙分子膜的不對(duì)稱性，增加膜的流動(dòng)性[11]。且膽固醇能夠提高脂質(zhì)體雙分子層薄膜的有序排列，因而在脂質(zhì)體的制備過(guò)程中，較高的膽固醇含量能夠降低膜的流動(dòng)性，從而可能會(huì)降低脂溶性藥物對(duì)脂質(zhì)雙分子層的插入[12]。TAH 為脂溶性藥物，藥物大部分嵌入磷脂雙分子層膜之間。因此，膽固醇的量對(duì)脂質(zhì)體的包封率影響很大。膜面積越大，藥物包封量就越多。沒有膽固醇，脂質(zhì)雙層膜硬度差，不夠穩(wěn)定。膽固醇的適當(dāng)加入，能使脂質(zhì)體膜的剛性增強(qiáng)，提高穩(wěn)定性。但當(dāng)膽固醇量較大時(shí)，脂質(zhì)體膜的剛性過(guò)強(qiáng)，容易破裂，藥物易滲漏。

c.在工業(yè)化生產(chǎn)中，脂質(zhì)體在放置過(guò)程中極易發(fā)生氧化，導(dǎo)致脂質(zhì)體貯存一直是難以解決的問(wèn)題。一般在制備過(guò)程中添加抗氧化劑從而防止氧化。制備脂質(zhì)體的 PC 主要來(lái)源于成本低、來(lái)源廣的大豆卵磷脂，因?yàn)橹苽渲|(zhì)體效果好而被廣泛應(yīng)用。但大豆卵磷脂含有大量不飽和脂肪酸，尤其是亞油酸的含量大于 50%，極其容易氧化，從而影響了脂質(zhì)體的保存及應(yīng)用?？寡鮿┑倪x擇及用量直接影響制劑質(zhì)量?？寡鮿┬杈哂械投拘?、安全性好、用量小、適合靜脈給藥等特點(diǎn)，分析利弊，進(jìn)行處方篩選實(shí)驗(yàn)，再優(yōu)化確定最佳抗氧劑及用量。維生素 E、維生素 C、丁羥茴醚、氨基酸等作為抗氧劑被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域[13-15]。WHO 規(guī)定生育酚作為抗氧劑用時(shí)的日允許攝取量為 0.15～2.0 mg/kg[16]。FDA《非活性成分指南》中標(biāo)注注射用維生素E最大使用劑量為0.064%，抗壞血酸的最大使用劑量為 0.2%，賴氨酸的最大使用劑量為 0.22%。藥用輔料手冊(cè)中記載抗壞血酸以 0.001%～0.1% 的濃度用作水性液體藥物制劑的抗氧劑[17]。BHA 常用濃度為0.005%～0.02%，其用量為 0.02% 時(shí)比 0.01% 的抗氧效果提高 10%，當(dāng)用量超過(guò) 0.02% 時(shí)抗氧化效果反而下降?？寡鮿?BHT 的添加量為 0.01%～2%。曾有文獻(xiàn)記載 BHT 對(duì)菜籽油有一定的抗氧化性，單獨(dú)使用 BH T的最佳使用濃度為 0.2‰[18]。Riisom 等[19]測(cè)定了氨基酸在在紅花油乳液體系種的氧吸收率，發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸、蘇氨酸、賴氨酸和組氨酸均體現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。且在南京綠葉制藥有限公司的發(fā)明專利“一種注射用紫杉醇脂質(zhì)體組合物的凍干工藝”中用到了賴氨酸[20]。因此，本文選用合適劑量，即 0.02% 的 VE、VC、BHA、BHT 及賴氨酸作為抗氧劑進(jìn)行考察，確定 BHT 效果最好。對(duì)抗氧劑 BHT 用量做進(jìn)一步考察，確定了 BHT 濃度在0.10%時(shí)抗磷脂氧化作用較好。接下來(lái)，做兩批脂質(zhì)體（加入抗氧劑及不加入抗氧劑）的高溫加速試驗(yàn)，以包封率、粒徑、含量及有關(guān)物質(zhì)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，能快速預(yù)測(cè)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。綜合考量，其中含BHT 濃度為 0.10% 的 TAH-Lip 穩(wěn)定性較好，質(zhì)量可靠，工藝穩(wěn)定，提高制劑穩(wěn)定性，且不影響含量、有關(guān)檢測(cè)結(jié)果，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

d.TAH 脂質(zhì)體 Zeta 電位 -0.150 mV，接近電中性?？赡芤?yàn)楸疚乃玫牧字瑸橹行粤字?，?TAH 的藥物性質(zhì)導(dǎo)致電位較小。理論上脂質(zhì)體屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定系統(tǒng)，負(fù)電荷越大越穩(wěn)定，但抗氧劑 BHT 的加入，大大改善磷脂氧化程度，起到增強(qiáng)制劑穩(wěn)定性的作用。

4 結(jié)論

本文作者應(yīng)用薄膜分散法制備了紫杉醇衍生物（TAH）脂質(zhì)體，其制備工藝簡(jiǎn)單，以包封率和粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)各處方及工藝進(jìn)行單因素考察，確定最優(yōu)處方及工藝的質(zhì)量比為m（藥）:m（大豆卵磷脂）:m（膽固醇）= 1 : 20 : 2，抗氧劑 BHT 質(zhì)量濃度為1 g·L-1，成膜溫度為 40 ℃，水化溫度為 40 ℃，水化時(shí)間為 30 min，均質(zhì)次數(shù)為 10 次，均質(zhì)壓力為 800 bar。按照上述條件制備的脂質(zhì)體包封率和載藥量較好，粒徑較小且分布均勻。