楊碩，段國辰，閆江泓，王樂

河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省兒童醫(yī)院兒研所，石家莊 050031

結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）與肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是導(dǎo)致人類呼吸道感染的常見病原微生物。兒童機(jī)體免疫功能及呼吸系統(tǒng)發(fā)育尚未成熟，極易受到病原微生物的侵襲，導(dǎo)致肺結(jié)核、肺炎等疾病及各種并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重后果。因兒童發(fā)病時(shí)臨床癥狀通常不典型、病原學(xué)檢測困難且影像學(xué)特征特異性低等原因，臨床診療時(shí)極易造成誤診或漏診，嚴(yán)重影響治療效果［1］。不同病原所致疾病的治療方案不同，診療過程中對抗生素等藥物的選擇也存在差異，因而臨床應(yīng)首先確定病因。有研究［2］顯示，不同病原體可造成患者外周血相關(guān)炎性指標(biāo)的差異表達(dá)。目前關(guān)于肺結(jié)核（tuberculosis，TB）、肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）患兒外周血炎性指標(biāo)變化相關(guān)研究較少。我們觀察了TB、MPP患兒外周血白細(xì)胞（WBC）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）及淋巴細(xì)胞亞群的變化，旨在為臨床判斷TB、MPP患兒的感染情況及免疫狀態(tài)提供數(shù)據(jù)支持?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年7月—2019年12月間河北省兒童醫(yī)院因發(fā)熱、咳嗽等感染性疾病癥狀就診的肺結(jié)核患兒（TB組）156例，其中男94例、女62例，中位年齡6（3，9）歲；臨床明確診斷肺結(jié)核［3］。另選擇肺炎支原體肺炎患兒（MPP組）149例，其中男78例、女71例，中位年齡6（5，8）歲，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)于呼吸道分泌物中檢測到MP核酸，且無其他病原體感染的臨床和實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。兩組納入患兒均排除合并血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病者，如急性淋巴細(xì)胞白血病、免疫缺陷病等。TB組與MPP組患兒性別、年齡分布具有可比性。同時(shí)篩選年齡、性別匹配的健康查體兒童156例為對照組。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，納入患兒家屬均知情且同意。

1.2 TB及MPP組外周血WBC、CRP及PCT檢測 TB及MPP組患兒于入院當(dāng)天、對照組于查體時(shí)采集外周靜脈血1～2 mL，采用Sysmex XS-800i血細(xì)胞分析儀檢測TB、MPP組外周血WBC；國賽Astep特定蛋白分析儀測定TB、MPP組外周血CRP；Roche E411發(fā)光分析儀測定TB、MPP組外周血PCT；正常參 考 范 圍 為：WBC：（4～10）×109/L，CRP：0～10.0 mg/L，PCT：0～0.06μg/L，以結(jié)果大于正常參考范圍上限判定為陽性。

1.3 三組外周血淋巴細(xì)胞亞群比例檢測 采用流式細(xì)胞儀。檢測取2支上樣管，將5μL四色試劑CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5及CD45-FITC/CD56-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5分別加入50μL全血標(biāo)本中，混勻后室溫避光孵育，然后加入紅細(xì)胞裂解液，混勻后再次室溫避光孵育，經(jīng)離心、洗滌、加入血細(xì)胞分析用稀釋液后上流式細(xì)胞儀檢測。采用CXP軟件獲取和分析細(xì)胞，得到淋巴細(xì)胞各亞群細(xì)胞：CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4-CD8-T、CD4+CD8+T、CD19+B、CD56+NK占總淋巴細(xì)胞的百分比及CD4+/CD8+比值。流式細(xì)胞儀（Cytomics FC 500 MCL）、及試劑均購自美國貝克曼庫爾特公司。CD3+T細(xì)胞60%～82%，CD4+T細(xì)胞35%～58%，CD8+T細(xì) 胞20%～35%，CD4+/CD8+0.7～2.5，CD4-CD8-T細(xì)胞＜6.7%，CD4+CD8+T細(xì)胞＜2.0%，CD19+B細(xì)胞5%～18%，CD56+NK細(xì)胞4%～18%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料以%表示，TB組與MPP組間WBC、CRP及PCT陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，組間外周血WBC、CRP、PCT水平以及淋巴細(xì)胞亞群占比比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TB組與MPP組外周血WBC、CRP及PCT水平比較 TB組外周血WBC計(jì)數(shù)、CRP及PCT水平分別 為 8.90（6.98，11.23）×109/L、12.83（1.00，33.15）mg/L及0.06（0.040，0.152）μg/L；MPP組分 別 為8.80（6.70，11.50）×109/L、12.79（4.72，32.46）mg/L及0.075（0.042，0.187）μg/L，組間各指標(biāo)比較，P均＞0.05。TB組外周血WBC、CRP及PCT陽性率分別為38.50%、57.80%及48.30%；MPP組分別為32.90%、57.00%及59.10%，組間各指標(biāo)比較，P均＞0.05。

2.2 各組淋巴細(xì)胞亞群水平比較 TB組外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+、CD4-CD8-T、CD4+CD8+T、CD19+B、CD56+NK水 平 分 別 為68.70%（61.33%，74.70%）、38.70%（33.03%，43.30%）、23.30%（18.40%，29.43%）、1.60%（1.20%，2.10%）、4.80%（3.53%，6.50%）、0.10%（0.03%，0.20%）、20.45%（14.75%，26.08%）、6.80%（3.90%，10.35%），MPP組分別為70.00%（62.45%，74.95%）、35.90%（28.60%，41.35%）、25.90%（22.50%，30.95%）、1.30%（1.00%，1.70%）、6.00%（4.50%，8.05%）、0.10%（0，0.20%）、16.80%（13.00%，21.55%）、8.70%（5.90%，13.00%），對照組分別為73.40%（69.63%，75.58%）、41.30%（38.45%，44.68%）、25.55%（23.00%，28.48%）、1.60%（1.40%，1.90%）、4.80%（3.73%，5.70%）、0.10%（0.10%，0.20%）、13.75%（11.70%，16.10%）、8.05%（5.90%，10.88%）。各組淋巴細(xì)胞亞群分布情況見圖1。

圖1 TB組、MPP組及對照組淋巴細(xì)胞亞群水平分布情況

與對照組比較，TB組外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T及CD56+NK比例低（P均＜0.01），CD19+B比例高（P＜0.001）；MPP組外周血CD3+T、CD4+T、CD4+CD8+T比例及CD4+/CD8+低（P均＜0.05），CD4-CD8-T及CD19+B占比高（P均＜0.001）；與MPP組比較，TB組外周血CD8+T、CD4-CD8-T及CD56+NK低，CD4+T、CD4+/CD8+及CD19+B高（P均＜0.05）。

3 討論

肺炎每年導(dǎo)致近100萬例兒童死亡，已成為導(dǎo)致年齡＜5歲兒童死亡的最大原因。研究［4］發(fā)現(xiàn)，兒童肺炎以病毒占比最大，其次為細(xì)菌、支原體等。病原體可侵入肺部導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。兒童呼吸系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)發(fā)育不健全，病原體感染后的診斷與治療較成人更困難。Mtb引起的結(jié)核病的感染、發(fā)病及預(yù)后都與宿主免疫功能密切相關(guān)。兒童感染Mtb后更易發(fā)展為活動性結(jié)核病，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。MPP占住院兒童社區(qū)獲得性肺炎的10%～40%。兩種病原體感染后患兒臨床及影像學(xué)表現(xiàn)相似，容易引起誤診［1］，因此本研究對比了多項(xiàng)炎癥指標(biāo)在兩種病原體感染機(jī)體后的不同變化水平，為臨床診療提供初步理論基礎(chǔ)。

WBC、CRP及PCT等炎性指標(biāo)水平是評估感染狀態(tài)的常用參考依據(jù)，可用于鑒別感染性疾病與非感染性疾病，在不同病原感染時(shí)存在變化差異［5］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在疾病初期兩組患兒WBC、CRP及PCT水平較正常范圍均有升高，提示機(jī)體在受到不同病原體感染后，均表現(xiàn)出一定程度的炎性反應(yīng)。其中TB組CRP水平升高最為顯著，陽性率明顯高于WBC及PCT，而MPP組PCT陽性率最高，但未發(fā)現(xiàn)上述三種炎性指標(biāo)在Mtb及MP感染初期兒童中表達(dá)水平存在差異。傳統(tǒng)認(rèn)為CRP及PCT作為急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在鑒定病毒與細(xì)菌感染中有重要作用，其升高可作為抗生素使用的依據(jù)指標(biāo)，然而也有研究發(fā)現(xiàn)這些依據(jù)并不牢靠，CRP及PCT在非細(xì)菌性感染時(shí)也可明顯升高［6］。

Mtb及MP感染機(jī)體除引起呼吸系統(tǒng)癥狀外，也可引起其他多系統(tǒng)表現(xiàn)，包括固有免疫及適應(yīng)性免疫的多環(huán)節(jié)免疫因素在病原體感染的致病中起重要作用［7-8］。NK細(xì)胞屬于固有免疫細(xì)胞，可以選擇性殺傷被感染的靶細(xì)胞，也可以通過抗體依賴的細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性效應(yīng)從而發(fā)揮抗感染和免疫調(diào)節(jié)作用，而其水平下降會造成機(jī)體免疫功能進(jìn)一步紊亂［9］。NK細(xì)胞同樣是結(jié)核病患者外周血單核細(xì)胞Mtb特異性干擾素IFN-γ產(chǎn)生的主要來源［10］。本研究中TB組患兒CD56+NK細(xì)胞水平顯著下降，提示結(jié)核患兒體內(nèi)存在固有免疫系統(tǒng)不足以抵抗結(jié)核菌，固有免疫細(xì)胞免疫清除功能障礙的情況。

適應(yīng)性免疫包括T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和由B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體介導(dǎo)的體液免疫，不同的免疫應(yīng)答途徑會使淋巴細(xì)胞亞群水平出現(xiàn)不同變化。T淋巴細(xì)胞按表面分化抗原不同分為CD4+T和CD8+T亞群。CD4+T具有免疫應(yīng)答正調(diào)節(jié)作用，可分泌細(xì)胞因子發(fā)揮細(xì)胞免疫效應(yīng)對抗感染，并輔助B細(xì)胞活化產(chǎn)生抗體發(fā)揮體液免疫作用；CD8+T具有細(xì)胞毒性，通過脫顆粒作用釋放穿孔素及顆粒酶B從而殺傷靶細(xì)胞，同時(shí)對B細(xì)胞抗體的產(chǎn)生和T細(xì)胞的活化具有抑制作用［11］。正常情況下，CD4+T與CD8+T相互制約，產(chǎn)生適度免疫應(yīng)答，既能清除病原體，又不損傷自身組織，使機(jī)體免疫功能處于動態(tài)平衡狀態(tài)，CD4+/CD8+比值則反映了機(jī)體整體的免疫狀態(tài)。

本研究中患兒受到病原體侵襲后，CD3+T及CD4+T占比均較對照組下降明顯，提示T淋巴細(xì)胞活化功能被抑制，機(jī)體細(xì)胞免疫功能降低，患兒出現(xiàn)免疫功能紊亂現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)TB組較MPP組患兒CD4+T水平顯著升高同時(shí)CD8+T水平顯著下降，有學(xué)者認(rèn)為在結(jié)核感染初期，CD4+T細(xì)胞可因參與早期抗結(jié)核反應(yīng)而升高；疾病后期，CD4+T細(xì)胞下降，可能與機(jī)體反向調(diào)節(jié)及T淋巴細(xì)胞功能耗竭有關(guān)［12］。而抗原特異性記憶CD8+T細(xì)胞則是保護(hù)性免疫的重要組成，其受損可能是病原體持續(xù)存在宿主內(nèi)體的主要原因［13］。

有學(xué)者［14］指出，重癥腺病毒肺炎患兒外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T及CD4+/CD8+比值較非重癥時(shí)顯著下降，恢復(fù)期則有明顯回升，這些指標(biāo)可以輔助判斷肺炎的嚴(yán)重程度和治療效果。正常情況下，CD4+/CD8+T細(xì)胞維持動態(tài)平衡，機(jī)體的免疫應(yīng)答功能正常。MPP患者存在T細(xì)胞亞群紊亂現(xiàn)象，MP感染患兒外周血CD4+T數(shù)量及CD4+/CD8+比值下降而肺泡灌洗液中CD4+/CD8+增加，可能由于CD4+T參與集體局部炎癥反應(yīng)造成［15］，與本研究中結(jié)果相符。同時(shí)該組患兒CD4-CD8-T水平顯著升高，說明其在MP急性感染后可積極參與病原體清除、炎癥反應(yīng)過程，從而維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定狀態(tài)［16］。廖春信等［17］觀察到CD4+CD8+T在結(jié)核性及病毒性感染中可起到免疫保護(hù)作用，但本研究中未發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞占比的顯著升高，關(guān)于其在兒童感染中的作用有待進(jìn)一步研究。

B淋巴細(xì)胞通過產(chǎn)生免疫球蛋白介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答并同時(shí)具有細(xì)胞毒性作用，可阻止病原體的吸附與感染，而過度的體液免疫應(yīng)答可引起嚴(yán)重的臨床癥狀及病理損傷［18］。兩組患兒CD19+B均高于對照組，提示患兒體液免疫應(yīng)答活躍，但有過度應(yīng)答的可能，應(yīng)注意控制感染的同時(shí)減輕全身炎癥反應(yīng)所引起的器官損傷。

綜上所述，不同類型病原體感染后患兒體內(nèi)均會出現(xiàn)炎性反應(yīng)及淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)改變，且不同病原體感染后的改變各具特點(diǎn)。TB與MPP患兒患病初期外周血WBC、CRP及PCT水平相近。與MPP患兒比較，TB患兒外周血CD8+T、CD4-CD8-T及CD56+NK低，CD4+T、CD4+/CD8+及CD19+B高。多指標(biāo)檢測的聯(lián)合應(yīng)用可為患兒感染情況及免疫狀態(tài)的評估提供理論依據(jù)，對輔助兒童呼吸道感染的個(gè)體化診療具有一定意義。