封露露，李麗欣，馬翠霞，封紀珍，李揚

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏癥系由G6PD基因突變導致酶活性降低所致，其發(fā)病常由誤食蠶豆而誘發(fā)，故又稱蠶豆病[1]，是一種常見的遺傳性溶血性紅細胞酶缺陷病，遺傳方式為X連鎖不完全顯性遺傳。根據(jù)酶活性缺乏程度與臨床表現(xiàn)，可將G6PD缺乏癥分為Ⅰ～Ⅴ型5類，其溶血的嚴重程度與剩余酶的功能呈負相關(guān)，臨床癥狀也隨之逐步減輕[2]。我國是該病的高發(fā)區(qū)之一，并呈南高北低的分布特點，患病率一般為4%～15%，海南、廣東、廣西、云南、貴州、四川、臺灣和香港等省和地區(qū)較高[3]，個別地區(qū)可高達40%[4]。G6PD缺乏癥在臨床上表現(xiàn)為新生兒高膽紅素血癥、蠶豆病、藥物誘導性溶血、某些感染性溶血以及非球形紅細胞溶血性貧血，嚴重者可導致新生兒核黃疸，引起死亡或永久性神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[5-6]。本研究采用熒光技術(shù)對石家莊地區(qū)出生的237 312例新生兒進行篩查，進一步采用高通量測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）對疑似患兒進行基因測序，分析G6PD基因突變情況。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2018年9月—2020年11月于石家莊市內(nèi)各助產(chǎn)機構(gòu)出生的237 312例新生兒（男性123 363例，女性113 949例），采用熒光法進行G6PD活性篩查，得到篩查陽性患兒142例，確診114例。其中56例采集靜脈血進行基因測序，另外58例患兒家長拒絕基因診斷。篩查前家長均簽署知情同意書，此研究經(jīng)石家莊市婦幼保健院倫理委員會批準實施。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑儀器：Wallac VICTOR2D熒光計和Wallac DELFIAPlate Shaker微孔板震蕩儀，來源于PerkinElmer公司。試劑：G6PD測定試劑盒（熒光法），來源于Labsystems Diagnostics Oy。

1.2.2 G6PD活性篩查采用G6PD測定試劑盒（熒光法）進行G6PD活性的篩查，方法如下：首先用16 mL底物緩沖液溶解底物；在微孔板孔內(nèi)分別打入直徑3 mm的標準品、質(zhì)控品和待測樣本，每孔加入150μL底物溶液，確保血片完全浸透；微孔板覆膜，室溫下避光孵育30 min，振速1 150 r/min；加入150μL冷的銅試劑并測量熒光讀數(shù)（激發(fā)光波長355 nm，發(fā)射光波長460 nm）。結(jié)果判定：低于切值（3.5 U/g Hb）者為可疑陽性，即G6PD活性可能缺乏，需做進一步診斷。

1.2.3 質(zhì)量控制篩查實驗每塊反應(yīng)板均做單孔標準曲線和高值、低值質(zhì)控，結(jié)果均在允許誤差范圍內(nèi)方可發(fā)出檢測報告。連續(xù)2年參加國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心新生兒篩查室間質(zhì)評，成績合格。

1.2.4 G6PD基因測序可疑陽性患兒采集靜脈血，送至北京邁基諾醫(yī)學檢驗所，利用NGS按照Illumina標準化流程進行G6PD全外顯子測序。對發(fā)現(xiàn)的致病突變在其所在片段上、下游設(shè)計引物進行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增及一代驗證。對患兒父母也采用Sanger法進行目標基因突變驗證。對于未見報道的變異，應(yīng)用蛋白功能預測軟件SIFT、PolyPhen_2、MutationTaster、GERP++和REVEL進行蛋白功能預測。嚴格按照美國醫(yī)學遺傳學與基因組學會（ACMG）發(fā)布的變異解讀指南進行突變位點的致病性分析。

2 結(jié)果

2.1 石家莊地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥的患病率237 312例新生兒中，篩查陽性142例，確診114例，總患病率為0.05%。114例患兒中男性105例，篩查結(jié)果均值（范圍）為1.8（0.4～3.7）U/g Hb；女性9例，篩查結(jié)果均值（范圍）為2.9（1.8～4.0）U/g Hb，見表1。

表1 石家莊地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥男性患兒及女性患兒對比分析

2.2 G6PD基因突變類型分析114例篩查陽性患兒中58例患兒家長拒絕基因測序，56例進行了基因測序，均為G6PD基因雜合突變，共包含19種突變類型，且均為點突變，其中16種已報道，分別為c.1376G>T、c.1024C>T、c.1388G>A、c.871G>A、c.95A>G、c.487G>A、c.1478G>A、c.406C>T、c.577G>A、c.925A>T、c.185 A>G、c.961 G>A、c.482 G>T、c.653 C>T、c.392 G>T、c.1466G>T；3種未見報道，分別為c.1316G>A、c.575G>C、c.1400C>T，見圖1；突變頻率較高的分別為c.1376G>T（0.25）、c.1024C>T（0.16）、c.1388G>A（0.14），見表2。

圖1 3種未見報道的G6PD基因突變

表2 56例G6PD缺乏癥患兒基因突變類型

3 討論

3.1 G6PD缺乏癥的患病率分析G6PD缺乏癥在中國兒童總體患病率為4.03%，患病率相對較高，為我國較高的遺傳性疾病之一[7]。Chiang等[8]報道中國臺灣地區(qū)患病率為3.1%～9%；另有報道在廣東省進行的一次8 144例篩查中，患病率為3.1%～16.1%[9]；云南省患病率為7.39%[10]；四川省部分地區(qū)患病率達6.9%[11]；貴州省的患病率為3.43%[11]；香港的患病率為4.4%[12]；我國北方地區(qū)的山東青島該病患病率僅為0.02%[13]；山東聊城患病率則為1.6%[14]；陜西寶雞地區(qū)患病率為0.02%[15]。本研究初步明確G6PD缺乏癥在石家莊地區(qū)患病率為0.05%，與河北省廊坊市患病率（0.05%）[16]一致，提示G6PD缺乏癥在我國發(fā)生率存在南高北低的特點，亦表明該病具有種族及地域差異。

3.2 G6PD缺乏癥的性別差異G6PD缺乏癥是由基因突變引起，致病基因位于X染色體上，故呈現(xiàn)出X連鎖遺傳的遺傳特點。男性半合子酶活性表現(xiàn)為顯著缺乏而發(fā)??；女性雜合子酶活性呈現(xiàn)不同程度降低，多不發(fā)病或輕度發(fā)??；女性純合子會表現(xiàn)出酶活性的嚴重缺乏[17]。本研究發(fā)現(xiàn)56例患兒中除2例女性雜合子，其余均為男性半合子，未發(fā)現(xiàn)女性純合子；男性患病率為0.085%，女性患病率為0.008%。

3.3 G6PD基因突變分析G6PD缺乏癥的患病率、基因頻率及基因突變類型具有明顯的地域和群體特異性。非洲地區(qū)主要以c.376A>G、c.202G>A、c.A542T突變?yōu)橹?；地中海地區(qū)以及印度等國家主要以c.563C>T為主；東南亞地區(qū)則主要以c.871G>A為主；亞洲地區(qū)的中國人突變位點主要是c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G[18-19]；本研究表明石家莊地區(qū)突變頻率較高的位點為c.1376G>T（0.25）、c.1024C>T（0.16）、c.1388G>A（0.14），提示石家莊地區(qū)G6PD缺乏癥基因突變逐漸呈現(xiàn)地區(qū)特征。

綜上，本研究通過對石家莊地區(qū)新生兒G6PD篩查結(jié)果及基因突變分析，明確了G6PD缺乏癥在石家莊地區(qū)新生兒中的患病率，且男性高于女性；進一步分析了基因突變位點的分布情況；發(fā)現(xiàn)了3種未見報道的基因突變類型，豐富了基因突變的數(shù)據(jù)庫。