馮玉婷，羅姝紅，李蘭，蘇琴，程驚秋，葉紅霞

自然流產(chǎn)（spontaneousabortion，SA）是指妊娠不 足28周、胎兒體質(zhì)量不足1 000 g而發(fā)生的妊娠失敗，而復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指與同一性伴侶發(fā)生連續(xù)2次或2次以上的自然流產(chǎn)，其發(fā)病率約1%～5%，臨床上處理相對困難[1-3]。RSA病因復(fù)雜，除了目前已明確提出的染色體異常、自身免疫性疾病、生殖道解剖異?；蚋腥?、內(nèi)分泌功能異常和血栓形成傾向等病因外，仍有約50%的病例病因不明，即不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[4-5]。正常妊娠類似于成功的同種異體移植，母胎界面通過復(fù)雜而精細的調(diào)控機制維持局部微環(huán)境平衡；當各種因素導(dǎo)致母胎界面微環(huán)境失衡時，母體對胎兒產(chǎn)生攻擊并觸發(fā)分娩啟動，如不及時阻止和修復(fù)，將增加流產(chǎn)風險[6]。因此，母胎界面微環(huán)境是探索URSA發(fā)病機制和治療靶點的重要切入點。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類高度保守、長約22個核苷酸、能在胞質(zhì)內(nèi)以完全或部分互補形式與靶基因（mRNA）結(jié)合引起mRNA降解或翻譯抑制、在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的非編碼小RNA，調(diào)控人類基因組約1/3的基因，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[7]。近年有研究報道，miR-146a-5p在樹突狀細胞（DC）、自然殺傷（NK）細胞、巨噬細胞等多種細胞中均有表達，參與多種生理病理過程[8-9]。母胎界面主要由蛻膜、絨毛等結(jié)構(gòu)組成，富含豐富的滋養(yǎng)層細胞、蛻膜細胞及免疫細胞（包括NK細胞、巨噬細胞、DC等），但目前很少有研究報道m(xù)iR-146a-5p在URSA母胎界面的作用及機制。因此，本研究旨在探索miR-146a-5p在URSA蛻膜組織中的表達并分析和驗證其潛在作用機制，以期為后續(xù)探索基于miRNA的URSA防治策略研究提供新的思路和干預(yù)靶點。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2019年1—12月在成都西囡婦科醫(yī)院（我院）因URSA行清宮術(shù)患者（URSA組）及因無生育計劃行人工流產(chǎn)術(shù)的正常妊娠者（正常妊娠組）各10例。URSA組納入標準：①年齡＜35歲，與同一性伴侶發(fā)生連續(xù)≥2次的自然流產(chǎn)，本次流產(chǎn)孕周6～12周；②無足月分娩史，本次妊娠期間未接受免疫調(diào)節(jié)劑、抗凝藥物等保胎治療；③排除夫妻雙方外周血染色體異常，清宮術(shù)后絨毛染色體檢查無異常；④女方無生殖道發(fā)育異?；蚋腥?、無高凝傾向、無內(nèi)分泌檢查異常、自身免疫抗體陰性、TORCH檢查陰性；⑤男方精液檢查無異常。正常妊娠組納入標準：①年齡＜35歲，妊娠孕周6～12周，B超提示宮內(nèi)胚胎發(fā)育正常；②既往無自然流產(chǎn)、早產(chǎn)、妊娠期高血壓疾病、胎盤早剝、生育異常胎兒等不良孕產(chǎn)史；③無內(nèi)分泌疾病、心血管疾病等病史；④本次妊娠無生育計劃，自愿行人工流產(chǎn)術(shù)終止妊娠。本研究已通過我院倫理委員會審核[批件號：（2019）生殖倫審（016）號]，所有研究對象均知情并簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 蛻膜組織收集及處理利用無菌負壓吸引瓶收集流產(chǎn)組織并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去表面血污，分離出蛻膜組織。將蛻膜組織一部分迅速放入液氮中速凍并保存在-80℃用于后續(xù)基因和蛋白檢測；剩余部分浸泡于10%中性福爾馬林固定液中固定4～6 h，然后常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟和包埋，用于后續(xù)免疫組織化學分析。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）取人正常妊娠及URSA組蛻膜組織，Trizol法提取RNA，取0.2μL RNA溶液加入核酸蛋白定量儀中檢測濃度及純度，取1μg RNA使用Vazyme HiScriptⅡQRTSuperMix for qPCR試劑盒按說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成（見表1），用25μL體系在RT-PCR儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃、5min，40個循環(huán)（95℃10s，60℃30s，72℃30s），95℃15 s，使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進行檢測，以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct相對定量法計算基因相對表達量。檢測miR-146a-5p表達時，使用MicroRNA純化試劑盒（Norgen）按照說明書提取總miRNA，逆轉(zhuǎn)錄后取10 ng（5μL）進行qRT-PCR反應(yīng)，以小核RNA（snRNA）U6為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct相對定量法計算miR-146a-5p相對表達量。

表1 PCR引物序列

1.2.3 miR-146a-5p靶基因及分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

1.2.3.1 同源性分析利用USCS（http://genome.ucsc.edu/index.html）和NCB（Ihttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）基因組在線瀏覽工具檢索miR-146a-5p在人類基因組中的位置并進行同源性分析。

1.2.3.2 潛在靶基因預(yù)測利用miRDB（Cut-off值設(shè)定為90）、miRmap（Cut-off值 設(shè) 定 為90）、PicTar、TargetScan和DIANA microT-CDS（閾值設(shè)定為0.9）5個在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-146a-5p的潛在靶基因。為保證結(jié)果的可靠性，僅取在至少3個數(shù)據(jù)庫中同時預(yù)測到的靶基因進入后續(xù)分析。

1.2.3.3 Gene Ontology（GO）基因功能富集分析以上一步得到的靶基因為研究對象，通過物種和基因信息，利用GO數(shù)據(jù)庫查找靶基因的GO注釋信息，并據(jù)此選擇智人種（Homo sapiens）所在基因作為背景基因，以P＜0.05為顯著性閾值得到相對于背景具有統(tǒng)計學意義的GO高頻率注釋，包括細胞組件（cellularcomponent，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過程（biological process，BP）3個部分。

1.2.3.4 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）基因通路富集分析利用生物學通路數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.jp/kegg）在線預(yù)測這些靶基因所富集的信號通路，利用DAVID數(shù)據(jù)庫中Fisher Exact Test計算KEGG通路的P值，以P＜0.05為顯著性閾值得到相對于背景具有統(tǒng)計學意義的基因富集信號通路。

1.2.3.5 基因編碼功能蛋白之間相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析利用STRING在線數(shù)據(jù)庫分析并繪制miR-146a-5p預(yù)測靶基因編碼蛋白質(zhì)之間的PPI，選取設(shè)定物種為智人種（Homo sapiens），組合得分（combined score）＞0.9（highest confidence）的相互作用被認為是顯著的。

1.2.4 免疫組織化學染色將石蠟包埋的蛻膜組織做6μm切片，常規(guī)脫蠟，3%過氧化氫溶液封閉15 min、5%胎牛血清封閉20 min。EDTA抗原修復(fù)液微波加熱處理后，一抗工作液IRAK1（Abcam，1∶50）、CD80（Abcam，1∶50）37℃孵育1 h。滴加二抗工作液37℃孵育30 min，滴加DAB工作液顯色，待顯色至棕黃色終止。蘇木素復(fù)染，氨水返藍，梯度乙醇脫水，樹膠封片。使用Zeiss正置顯微鏡觀察并拍照，計算每200×視野下陽性染色細胞百分比（DAB染色陽性細胞數(shù)/每視野下細胞總數(shù)×100%），每張切片選取5個200×隨機顯微視野計算平均值。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）將各組蛻膜組織剪碎，RIPA細胞裂解液（碧云天）提取總蛋白，BCA蛋白含量檢測試劑盒（Pierce）測定總蛋白濃度。各組取等量蛋白樣品，SDS-PAGE電泳對蛋白進行分離，然后轉(zhuǎn)膜、封閉，加對應(yīng)的TRAF6（Abcam，稀釋比例為1∶1 000）、SORT1（Bimake，稀釋比例1∶500）和β-actin（ABclonal，稀釋比例為1∶2 000）一抗溶液，4℃孵育過夜。洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（北京康為世紀生物科技有限公司），37℃孵育1 h。充分洗滌后，采用高敏化學發(fā)光試劑盒進行顯影后膠片曝光。利用ImageJ軟件對條帶進行灰度值分析并以β-actin為內(nèi)參計算蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法利用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，定量資料以均數(shù)±標準差或M（P25，P75）表示，采用Kolmogorov-Smirnov和Shapiro-Wilk檢驗其正態(tài)性，2組間比較采用兩獨立樣本均數(shù)的t檢驗或Mann-Whitney U檢驗；定性資料以例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組一般情況及蛻膜組織miR-146a-5p表達水平比較除流產(chǎn)次數(shù)外，2組一般情況差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。URSA組蛻膜組織中miR-146a-5p表達水平低于正常妊娠組（P＜0.001），見表2。

表2 2組基本情況及蛻膜組織miR-146a-5p表達水平比較

2.2 miR-146a-5p靶基因預(yù)測結(jié)果人miR-146a-5p的基因ID為MIMAT0000449，成熟鏈序列為UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU，在各物種中高度保守（見表3）。在miRDB、miRmap、PicTar、TargetScan和DIANA microT-CDS數(shù)據(jù)庫中預(yù)測的miR-146a-5p靶基因數(shù)分別為122、705、130、283和415個，見圖1。為保證靶基因的可靠性，篩選出至少3個數(shù)據(jù)庫均預(yù)測的靶基因共35個（見表4），用于后續(xù)分析。

圖1 各數(shù)據(jù)庫預(yù)測到的miR-146a-5p靶基因數(shù)量及交集示意圖

表3 不同物種miR-146a-5p基因ID及成熟序列

表4 至少3個數(shù)據(jù)庫均預(yù)測到的miR-146a-5p靶基因

2.3 miR-146a-5p預(yù)測靶基因功能富集分析結(jié)果GO基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)，miR-146a-5p預(yù)測靶基因主要位于細胞質(zhì)、基底外側(cè)質(zhì)膜、內(nèi)體膜等細胞結(jié)構(gòu)中，發(fā)揮泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、鎂離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、連接酶活性等分子功能，參與軸突導(dǎo)向、凋亡過程負調(diào)控、白細胞介素1（IL-1）介導(dǎo)的信號通路等生物過程，見圖2。KEGG通路富集分析結(jié)果見表5，miR-146a-5p預(yù)測靶基因主要富集于Toll樣受體（toll-like receptor，TLR） 和神經(jīng)營養(yǎng)素（neurotrophin，NT）信號通路。富集于TLR信號通路的預(yù)測靶基因包括IRAK1、CD80和TRAF6，富集于NT信號通路的預(yù)測靶基因包括IRAK1、SORT1和TRAF6，相關(guān)信號通路分子網(wǎng)絡(luò)見圖3和圖4。利用STRING數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，miR-146a-5p預(yù)測靶基因編碼的功能蛋白之間存在3對PPI關(guān)系（見圖5）。

表5 miR-146a-5p預(yù)測靶基因KEGG通路富集分析結(jié)果

圖2 miR-146a-5p預(yù)測靶基因GO功能富集分析結(jié)果

圖3 TLR信號通路示意圖

圖4 NT信號通路示意圖

圖5 miR-146a-5p預(yù)測靶基因編碼蛋白之間相互作用關(guān)系

2.4 miR-146a-5p預(yù)測靶基因在2組蛻膜組織中的表達水平及相關(guān)性URSA組蛻膜組織中IRAK1、CD80、TRAF6和SORT1基因表達水平均高于正常妊娠組（P＜0.05），見表6；URSA組蛻膜組織IRAK1和CD80免疫組織化學染色陽性率、TRAF6和SORT1蛋白相對表達量也高于正常妊娠組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表7、圖6A和6B。進一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，蛻膜組織中miR-146a-5p水平與IRAK1、CD80、TRAF6和SORT1的基因和蛋白水平均呈負相關(guān)（P＜0.05），見圖6C。

表6 2組蛻膜組織IRAK1、CD80、TRAF6和SORT1基因表達水平比較

表7 2組蛻膜組織IRAK1、CD80、TRAF6和SORT1蛋白表達水平比較 （±s）

表7 2組蛻膜組織IRAK1、CD80、TRAF6和SORT1蛋白表達水平比較 （±s）

SORT1蛋白相對表達量正常妊娠組 10 5.61±2.06 5.93±1.62 0.10±0.04 0.11±0.03 URSA組 10 61.88±11.44 47.38±6.36 0.48±0.08 0.39±0.07 t 15.314 19.962 13.981 12.550 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001組別 n IRAK1陽性率CD80陽性率TRAF6蛋白相對表達量

圖6 miR-146a-5p預(yù)測靶基因在正常妊娠及URSA蛻膜組織中的表達水平比較及相關(guān)性分析

3 討論

URSA的病因和發(fā)病機制目前仍無法解釋，現(xiàn)有治療策略存在爭議且療效不滿意，近年來miRNA在母胎界面的表觀遺傳調(diào)控作用受到越來越多的關(guān)注[10-11]。表觀遺傳（epigenetics）是不涉及DNA序列改變的可遺傳基因表達變化，其三大機制包括DNA甲基化修飾、組蛋白修飾及miRNA調(diào)控[12]。據(jù)估計，人類基因組約1/3的基因受miRNA調(diào)控，而miRNA表達及功能異常參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，近年研究報道多種miRNA參與異常妊娠的病理過程[13]，如miR-184在RSA患者蛻膜中高表達并通過促進滋養(yǎng)層細胞凋亡誘導(dǎo)流產(chǎn)[14]；miR-103通過抑制M1巨噬細胞極化阻止RSA發(fā)生[15]；miR-30e有助于構(gòu)建母胎界面免疫耐受微環(huán)境等[16]。miR-146a-5p是第一個被發(fā)現(xiàn)具有免疫調(diào)節(jié)作用的miRNA，作為一種炎癥抑制因子參與多種生理和病理免疫調(diào)節(jié)過程，與風濕性關(guān)節(jié)炎/心臟病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、微生物感染等多種疾病相關(guān)，同時還在細胞增殖、分化、遷移和凋亡過程中起重要作用[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p在URSA蛻膜組織中的表達低于正常妊娠蛻膜組織，這與Zhao等[10]研究結(jié)果一致，表明miR-146a-5p降低與URSA發(fā)病密切相關(guān)。然而，蛻膜組織中miR-146a-5p在URSA發(fā)病機制中的作用及分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)目前很少有研究報道。

先天免疫細胞表達各種模式識別受體，其中TLR家族是最具代表性的類型，并且高度保守[19]。既往研究報道TLR在母胎界面的蛻膜免疫細胞中也有表達，從而參與胎兒著床和分娩過程中的免疫和炎癥活動，比如TLR4可通過調(diào)節(jié)性T細胞引起URSA；TLR1～9可誘導(dǎo)先天免疫應(yīng)答和細胞因子產(chǎn)生[20]；巨噬細胞分泌的細胞因子（如IL-12、IL-18）可通過TLR信號通路激活NK細胞；Th1細胞可被TLR2信號激活并釋放γ干擾素（IFN-γ）[21]；激活DC中TLR1、TLR2、TLR6等活性可促進促炎性細胞因子[如IL-6、IL-10、IL-12和腫瘤壞死因子α（TNF-α）]分泌[22]。據(jù)報道，TLR信號通路的異常激活可通過多個下游分子調(diào)控多種疾病發(fā)生發(fā)展，而該通路中多個關(guān)鍵分子均受miRNA調(diào)節(jié)[10]。既往研究報道，miR-146-5p可通過調(diào)節(jié)TLR信號通路對基于單核細胞的內(nèi)毒素誘導(dǎo)的交叉耐受發(fā)揮重要的調(diào)控作用[23]。然而，目前很少有研究報道URSA發(fā)病機制中miR-146a-5p與TLR信號通路調(diào)控的關(guān)系。

IRAK和TRAF是TLR的下游調(diào)節(jié)分子，在TLR信號通路中發(fā)揮重要作用，而既往研究在口腔癌中發(fā)現(xiàn)IRAK1和TRAF6均為miR-146a-5p的靶基因，過表達miR-146a-5p可下調(diào)兩者的蛋白表達[24]。同時，miR-146a可以通過靶向TRAF6和IRAK1來調(diào)節(jié)DC凋亡和細胞因子合成[25]。本研究利用生物信息學方法篩選出35個miR-146a-5p的潛在靶基因，其中IRAK1、CD80和TRAF6富集于TLR信號通路，調(diào)控下游多種炎性因子（如IL-1β、IL-6、IL-12、IFN-α等）介導(dǎo)的促炎、趨化和T細胞刺激等作用。本研究結(jié)果表明，URSA蛻膜組織中IRAK1、CD80和TRAF6的基因和蛋白水平均低于正常妊娠組，并且與miR-146a-5p的水平呈負相關(guān)（P＜0.05），這表明蛻膜組織存在miR-146a-5p和TLR信號通路之間的表觀調(diào)控機制。由于蛻膜組織中含滋養(yǎng)層細胞、蛻膜細胞及免疫細胞等多種細胞，本課題組目前正在進行miR-146a-5p在蛻膜組織中各類細胞中的表達及作用相關(guān)實驗研究，期待后續(xù)能提供更詳細的分子機制。

NT是脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育必不可少的蛋白質(zhì)家族，主要包括神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derivedneurotrophic factor，BDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3（neurotrophin 3，NT3）和NT4等。近年有研究報道NGF通過黏附分子依賴性途徑介導(dǎo)小鼠流產(chǎn)[26]、體外受精-胚胎移植后BDNF循環(huán)濃度降低與胚胎植入失敗相關(guān)[27]、妊娠應(yīng)急會對母鼠海馬的NT系統(tǒng)產(chǎn)生負面影響從而降低海馬的可塑性等[28]，但少有研究報道m(xù)iR-146a通過NT信號通路對URSA發(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用及機制。本研究發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p預(yù)測靶基因中，IRAK1、SORT1和TRAF6富集于NT信號通路并參與細胞凋亡和細胞生存調(diào)控，這3個基因編碼蛋白之間也存在相互作用。同時，URSA蛻膜組織中IRAK1、SORT1和TRAF6的基因和蛋白水平均低于正常妊娠組，并且與miR-146a-5p的水平呈負相關(guān)（P＜0.05）。這些結(jié)果初步提示了miR-146a-5p介導(dǎo)的NT信號通路參與URSA發(fā)生發(fā)展，本課題組后續(xù)研究中將進一步在體外和體內(nèi)通過功能獲得（gain of function）和功能缺失（lossof function）相關(guān)實驗來驗證miR-146a-5p通過NT信號通路調(diào)控URSA發(fā)生發(fā)展的具體分子機制。

綜上，本研究通過體外實驗初步證實了蛻膜組織中miR-146a-5p可能通過其下游TLR信號通路和NT信號通路調(diào)控URSA發(fā)生發(fā)展，進一步豐富了URSA發(fā)病機制，并為后續(xù)URSA防治策略研究提供了新的思路和靶點。后續(xù)研究中本課題組將在體外體內(nèi)更深入地研究miR-146a-5p對URSA母胎界面微環(huán)境的調(diào)控作用及其在URSA防治策略中的應(yīng)用。