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      數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)藥源性肝損傷研究進(jìn)展

      2021-07-30 02:15:52李思澤相小強(qiáng)
      關(guān)鍵詞:肝細(xì)胞毒性化合物

      李 敏,李思澤,姚 莉,相小強(qiáng)

      (復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院,上海 201203)

      藥源性肝損傷(drug-induced liver injury,DILI)是一種常見(jiàn)的藥物不良反應(yīng),嚴(yán)重時(shí)可造成患者急性肝衰竭和死亡。DILI是近年來(lái)上市藥物被召回的重要原因之一,也是藥物標(biāo)簽更改、增加黑框警告的常見(jiàn)原因之一。目前市場(chǎng)上仍有>1000種藥物具有肝毒性風(fēng)險(xiǎn)[1]。DILI已成為藥物開(kāi)發(fā)、監(jiān)管和使用人員所關(guān)心的重要安全性問(wèn)題。

      目前,全球DILI的發(fā)生率約為19/100 000[2],我國(guó)總?cè)丝谥械陌l(fā)生率約為23.8/100 000[3],高于全球水平。主要原因在于我國(guó)人口基數(shù)大、臨床藥物種類多(包含西藥和中藥等)、不規(guī)范用藥情況普遍及醫(yī)務(wù)人員和公眾對(duì)DILI的認(rèn)知不足等[4-5]。而且我國(guó)DILI患者中有87%為急性DILI,容易發(fā)展為急性肝衰竭。但目前DILI治療方法并不多,僅能及時(shí)發(fā)現(xiàn)并停用可疑藥物,給予保肝和抗炎治療[5-6]。

      雖然大部分患者治愈及好轉(zhuǎn)率>90%[5],但DILI尚存在難以及時(shí)診斷和鑒別的問(wèn)題,且DILI的治療滯后易為患者帶來(lái)很大危害。為避免上市藥物發(fā)生肝毒性反應(yīng),藥物肝毒性已成為藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用過(guò)程中倍受關(guān)注的重要安全性問(wèn)題。在藥物研發(fā)階段,藥物是否具有肝毒性及肝毒性程度可通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)進(jìn)行判斷或預(yù)測(cè),其中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一般以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝病理變化作為判斷指標(biāo),而臨床試驗(yàn)則一般以血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-pyruvic transaminase,GPT)或谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase,GOT)≥3倍正常值上限,作為肝損傷發(fā)生的早期敏感信號(hào)和判斷標(biāo)準(zhǔn)[5-7]。

      由于動(dòng)物與人體對(duì)藥物毒性具有一定的種屬差異,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往不能反映藥物對(duì)人體的毒性。Fasiglifam(TAK-875)是一種治療糖尿病的候選藥物,嚙齒動(dòng)物的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該藥不會(huì)誘發(fā)動(dòng)物肝損傷,但在進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn),治療組出現(xiàn)GPT≥3倍正常值上限的概率比安慰劑組高,且劑量越大產(chǎn)生肝毒性的概率越高,因此該藥的研發(fā)被中斷[8]。臨床試驗(yàn)中一旦出現(xiàn)肝損傷信號(hào),該藥物的臨床試驗(yàn)即需停止,這就意味著藥物研發(fā)的前期努力付之東流。藥物即使能夠成功上市,并不代表該藥的肝毒性監(jiān)管就此結(jié)束。曲格列酮在被批準(zhǔn)用于治療2型糖尿病后不久,即因其肝毒性而退出市場(chǎng)。但在體外毒性試驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中,均未發(fā)現(xiàn)其具有肝毒性,主要原因在于此診斷肝損傷的標(biāo)準(zhǔn)仍具有局限性[9]。

      雖然生物標(biāo)志物(如GPT)已經(jīng)是DILI早期預(yù)警信號(hào),但仍不能在藥物研發(fā)過(guò)程中對(duì)DILI進(jìn)行早期預(yù)測(cè)和診斷。由于動(dòng)物研究倫理要求變高且效率低,依靠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)判斷藥物肝毒性的方法不再成為DILI研究的首選。同時(shí),不同種屬間的肝毒性差異也為DILI的準(zhǔn)確判斷帶來(lái)許多困難。因此,歐盟與美國(guó)出臺(tái)了一系列政策鼓勵(lì)以非動(dòng)物實(shí)驗(yàn)作為評(píng)價(jià)藥物安全性的方法[10]。眾多研究者將藥物肝毒性的判斷和預(yù)測(cè)從傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)向基于細(xì)胞或細(xì)胞器的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和基于數(shù)學(xué)模型的非生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的替代方法。基于數(shù)學(xué)模型的肝毒性預(yù)測(cè)方法,主要包括基于化合物結(jié)構(gòu)定量構(gòu)效關(guān)系(quantitative structure-activity relationship,QSAR)模型、基于毒理基因組學(xué)模型和基于人生理藥動(dòng)學(xué)(physiologically based pharmacokinetic,PBPK)模型的方法。不少以QSAR模型為基礎(chǔ)的計(jì)算工具和軟件已經(jīng)上市應(yīng)用,如Toxmatch?,Toxtree和ADMET predictor?等。以PBPK模型為基礎(chǔ)的肝毒性預(yù)測(cè)工具如DILIsym?,也已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用。

      本文介紹目前3類基于數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)藥物肝毒性的方法——基于QSAR模型、毒理基因組學(xué)模型和PBPK模型的方法,以期為DILI的早期預(yù)測(cè)和肝毒性藥物臨床合理應(yīng)用提供參考。

      1 基于定量構(gòu)效關(guān)系模型的方法

      QSAR模型使用數(shù)學(xué)模型描述化合物結(jié)構(gòu)與其性質(zhì)之間的關(guān)系[11],根據(jù)已知化合物的結(jié)構(gòu)信息推測(cè)化合物的特定理化或生物學(xué)性質(zhì),可以對(duì)未知化合物性質(zhì)進(jìn)行定性或定量預(yù)測(cè)[12]。目前,使用QSAR模型預(yù)測(cè)肝毒性仍屬于定性預(yù)測(cè)[13],主要分為4個(gè)步驟:①篩選肝毒性和非肝毒性化合物;②依據(jù)化合物結(jié)構(gòu)計(jì)算并篩選分子描述符或指紋,構(gòu)建學(xué)習(xí)集;③利用數(shù)學(xué)工具探尋定量-構(gòu)效關(guān)系;④驗(yàn)證結(jié)果并優(yōu)化模型[14-15]。

      以Huang等[16]研究為例,他們選擇了136種肝毒性和65種非肝毒性藥物,根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)計(jì)算并篩選出1064個(gè)合適的分子描述符或指紋,使用隨機(jī)森林(random forest,RF)算法構(gòu)建模型,并使用10倍嵌套-交叉驗(yàn)證方法優(yōu)化模型。預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),最佳模型的準(zhǔn)確度最高為79.1%,驗(yàn)證集測(cè)試準(zhǔn)確度為87.0%。也有研究者根據(jù)化合物肝毒性程度分別建立二分類模型(2-class model,包括DILI和no-DILI藥物,即肝毒性藥物和非肝毒性藥物)和三分類模型(3-class model,包括 most-DILI、less-DILI和no-DILI藥物,即強(qiáng)肝毒性藥物、弱肝毒性藥物和非肝毒性藥物),并對(duì)比2種分類模型預(yù)測(cè)肝毒性結(jié)果的準(zhǔn)確度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),三分類模型不僅預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度較高,而且具有更高的肝毒性分辨率,可以更好的區(qū)分非肝毒性和肝毒性藥物[17]。為了提高肝毒性分類預(yù)測(cè)的分辨率,Liu等[18]也根據(jù)多種不良肝反應(yīng)(adverse hepatic effects,AHE)與機(jī)器學(xué)習(xí)相結(jié)合,構(gòu)建了1個(gè)三級(jí)肝毒性預(yù)測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)使用化合物結(jié)構(gòu)作為基礎(chǔ)數(shù)據(jù),化合物肝毒性作為預(yù)測(cè)終點(diǎn)指標(biāo),4個(gè)肝毒性嚴(yán)重度和特定AHE作為分類指標(biāo)。在收集2017種化合物和403種AHE相關(guān)的化合物信息后,使用RF算法構(gòu)建了27個(gè)模型,獲得了67.0%~78.2%的準(zhǔn)確度。這類肝毒性分層預(yù)測(cè)系統(tǒng)為多角度分析候選藥物性質(zhì)提供了幫助。

      目前,這類只使用單個(gè)機(jī)器學(xué)習(xí)算法的QSAR模型研究比較廣泛,但由于所選數(shù)據(jù)的來(lái)源不同、內(nèi)容不均衡和訓(xùn)練集化合物數(shù)量的差異,這類方法的精確度和穩(wěn)定性變化較大,準(zhǔn)確度在60%~90%不等[11],而且每一種建模算法的優(yōu)缺點(diǎn)不同,在建模過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)欠擬合和過(guò)擬合等問(wèn)題,影響預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。

      為揚(yáng)長(zhǎng)避短,也有研究者嘗試使用多種機(jī)器學(xué)習(xí)算法,構(gòu)建集成且預(yù)測(cè)效果更好的QSAR模型。集成模型預(yù)測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確,且可避免單一模型的缺點(diǎn)[19]。集成模型的構(gòu)建步驟與單個(gè)模型相似,但研究者會(huì)根據(jù)單一算法建模結(jié)果,構(gòu)建含有不同模型的多個(gè)集成模型,并比較不同集成模型的預(yù)測(cè)結(jié)果,以獲得一個(gè)最優(yōu)的集成模型[20]。如Ai等[20]設(shè)計(jì)了一種集成模型預(yù)測(cè)DILI的方法,從文獻(xiàn)中篩選并建立了1個(gè)含1241種化合物的分子描述符數(shù)據(jù)庫(kù)后,同時(shí)使用3種算法:支持向量機(jī)(support vector machine,SVM)、RF和極端梯度增強(qiáng)(extreme gradient boosting,XGBoost)算法及 12 個(gè)分子指紋,建立了36個(gè)基礎(chǔ)算法模型和35個(gè)集成模型,并使用5倍-交叉驗(yàn)證方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,集成模型的預(yù)測(cè)效果普遍比傳統(tǒng)單一模型更好,最佳集成模型是由5個(gè)分類器組成的,稱為集成Top-5的模型,準(zhǔn)確度為(71.1±2.6)%,驗(yàn)證集準(zhǔn)確度為84.3%。而36個(gè)基礎(chǔ)算法模型預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度高低不齊,范圍在62.7%~70.2%。

      總體而言,基于QSAR模型預(yù)測(cè)肝毒性的方法的優(yōu)勢(shì)在于快速且高效,適用于藥物研發(fā)前期對(duì)化合物進(jìn)行高通量篩選,這有助于降低藥物研發(fā)成本,縮短研發(fā)周期。目前也已有相關(guān)軟件上市應(yīng)用,如美國(guó)Simulation Plus公司所研發(fā)的ADMET Predictor軟件和歐洲化學(xué)局聯(lián)合中心(Joint Research Centre of European Chemicals Bureau)開(kāi)發(fā)的免費(fèi)毒性預(yù)測(cè)平臺(tái)Toxtree。但基于QSAR模型預(yù)測(cè)肝毒性的方法的缺點(diǎn)也在于只依賴化學(xué)結(jié)構(gòu),且預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性很大程度上取決于建模所選化合物的數(shù)量和種類,與各種建模算法無(wú)顯著關(guān)系?;衔锝Y(jié)構(gòu)能反映化合物的一些理化性質(zhì)和藥效,但并不能完全表明化合物是否具有肝毒性。藥物在人體是否引起DILI,不僅取決于化合物的結(jié)構(gòu),也與其在體內(nèi)的暴露量有密切關(guān)系。而基于QSAR模型的方法忽略了藥物在人體內(nèi)的暴露量。如托卡朋(tolcapone)和恩他卡朋(entacapone)2種藥物的結(jié)構(gòu)類似,使用QSAR模型分析發(fā)現(xiàn)兩者結(jié)構(gòu)并無(wú)明顯差異,但是前者由于具有肝毒性且可造成急性肝衰竭而退市,而后者卻無(wú)肝毒性[21]。

      2 基于毒理基因組學(xué)模型的方法

      藥物的毒性效應(yīng)與基因表達(dá)之間存在著密切的聯(lián)系,通過(guò)測(cè)試藥物肝毒性所誘導(dǎo)的基因變化,即可探究某基因與藥物肝毒性之間的關(guān)系。目前已有公開(kāi)2個(gè)大規(guī)模毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)集:日本毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(Toxicogenomics Project-Genomics Assisted Toxicity Evaluation System,TG-GATEs)[22]和 DrugMatrix 數(shù)據(jù)庫(kù)[23],這 2 個(gè)數(shù)據(jù)集可能為開(kāi)發(fā)DILI預(yù)測(cè)模型帶來(lái)新的進(jìn)展[24]。

      目前有研究者開(kāi)始利用毒性基因組學(xué)數(shù)據(jù),構(gòu)建數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)藥物肝毒性的方法,根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)和生物學(xué)分析確定肝毒性相關(guān)基因,并構(gòu)建數(shù)學(xué)模型模擬該基因表達(dá)水平與藥物肝毒性之間的定量關(guān)系,相關(guān)性越高證明肝毒性可能性越大。Zidek等[25]已預(yù)測(cè)出64個(gè)肝毒性的關(guān)鍵基因。為提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度,Su等[26]依據(jù)SVM遞歸特征消除(SVM-recursive feature elimination)、最小冗余最大相關(guān)性(min-redundancy max-relevance)和交叉驗(yàn)證創(chuàng)建了一種模型,并命名為MEMO,用于構(gòu)建數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)肝毒性。他們首先進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),并獲得多劑量下藥物濃度信息,建立藥物多劑量-反應(yīng)曲線;隨后根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用MEMO方法篩選相關(guān)基因,并進(jìn)行生物學(xué)分析,確定了10個(gè)肝毒性相關(guān)基因;最后使用TG-GATEs數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,使用該預(yù)測(cè)模型可以準(zhǔn)確高效地預(yù)測(cè)藥物引起的肝毒性,準(zhǔn)確度達(dá)到97%。與其類似,Cha等[27]選取了8種肝毒性藥物和8種非肝毒性藥物,使用藥物的HepG2細(xì)胞毒性基因組學(xué)數(shù)據(jù),建立了模型預(yù)測(cè)非甾體類抗炎藥引起DILI的風(fēng)險(xiǎn),模型確定了77個(gè)毒性相關(guān)基因,并成功對(duì)訓(xùn)練集外的4種藥物(酮洛芬、萘丁美酮、吲哚美辛和尼氟酸)肝毒性進(jìn)行了預(yù)測(cè)。同時(shí)有研究者發(fā)現(xiàn),基于毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)肝毒性的結(jié)果要明顯優(yōu)于QSAR模型,前者正確分類率為76%,而后者只有61%[28]。但也有研究表明,毒性基因作為生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)肝毒性的效果,可能不如臨床研究中所使用的生物標(biāo)志物敏感[10]?;诙疚锘蚪M學(xué)的預(yù)測(cè)模型并無(wú)預(yù)想的有效,部分原因是開(kāi)發(fā)成本高,且缺乏先進(jìn)的數(shù)據(jù)挖掘工具。另外,也可能在于基因表達(dá)改變并不足以誘發(fā)藥物產(chǎn)生肝毒性變化,具體原因仍需進(jìn)一步研究。

      因此,預(yù)測(cè)肝毒性時(shí),除考慮藥物理化性質(zhì)、肝毒性敏感性和毒性基因的變化,更需要考慮藥物在體內(nèi)濃度變化,尤其是在肝部位的暴露量,而這往往需要用到更先進(jìn)的數(shù)學(xué)模型,如PBPK模型。

      3 基于生理藥動(dòng)學(xué)模型的方法

      DILI的發(fā)生一方面取決于肝細(xì)胞對(duì)藥物或其代謝產(chǎn)物的敏感性,另一方面也取決于藥物在肝的暴露濃度和持續(xù)時(shí)間。前者可通過(guò)肝細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)合數(shù)學(xué)模型得到,而后者則需要借助PBPK模型。

      PBPK模型是一種基于機(jī)體生理學(xué)知識(shí),利用數(shù)學(xué)模型,對(duì)人體或動(dòng)物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征——吸收、分布、代謝和排泄進(jìn)行定量模擬和預(yù)測(cè)的方法[29-30]。PBPK模型根據(jù)解剖結(jié)構(gòu),將機(jī)體分為一系列的房室,每個(gè)房室代表某個(gè)器官組織或其一部分,并相應(yīng)整合了這些器官的生理生化參數(shù),包括器官體積、血流量、組織成分、細(xì)胞內(nèi)外液比例、代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)量等。藥物在各個(gè)房室之間的轉(zhuǎn)移按照機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)的流向進(jìn)行,并遵循物料平衡原理。PBPK技術(shù)的一大優(yōu)點(diǎn)是其強(qiáng)大的外推功能。例如,動(dòng)物PBPK模型可以外推到人[31-33]?;赑BPK模型的方法可推廣預(yù)測(cè)候選藥物的肝毒性、藥物肝毒性濃度和臨床安全劑量范圍[34],既可應(yīng)用于藥物非臨床研究階段,也可應(yīng)用于臨床試驗(yàn)階段,甚至可以替代部分臨床試驗(yàn)。而且,隨著數(shù)學(xué)模型的發(fā)展,越來(lái)越多的模型被應(yīng)用到肝毒性的預(yù)測(cè)中。根據(jù)數(shù)學(xué)模型的不同,基于PBPK模型預(yù)測(cè)肝毒性的方法可以分為以下幾類。

      3.1 PBPK模型結(jié)合毒理基因組學(xué)的方法

      Thiel等[35]將毒理基因組學(xué)與PBPK模型結(jié)合預(yù)測(cè)藥物肝毒性和毒性閾劑量,提出了具有代表性的方法即基于PBPK模型的體外毒性數(shù)據(jù)體內(nèi)轉(zhuǎn)化(PBPK-based in vivo contextualization of in vitro toxicity data,PICD)法。PICD法利用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)和功能富集分析方法,將人和大鼠的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所獲的毒性數(shù)據(jù),轉(zhuǎn)化為定量化的體內(nèi)毒性基因表達(dá)數(shù)據(jù)和關(guān)鍵生物學(xué)通路數(shù)據(jù),并整合到人或大鼠的全身PBPK模型中,模擬藥物產(chǎn)生毒性的基本分子機(jī)制,定量預(yù)測(cè)不同藥物劑量或體內(nèi)濃度下產(chǎn)生的藥物體內(nèi)毒性反應(yīng)隨時(shí)間變化的情況。他們使用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)硫唑嘌呤對(duì)細(xì)胞分裂周期25B蛋白、Wee1蛋白激酶和CHK1細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶(CHK1 checkpoint homolog),特別是對(duì)polo樣激酶1(polo-like kinase 1)和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白B1/B2均產(chǎn)生了顯著的影響,然后使用基因芯片陣列測(cè)定不同藥物濃度下肝細(xì)胞基因的變化,建立了硫唑嘌呤肝細(xì)胞濃度-基因變化模型;隨后他們將該模型與人或大鼠的PBPK模型整合從而建立PICD方法,并構(gòu)建硫唑嘌呤劑量-肝濃度-基因變化之間的關(guān)系。因此,可以依據(jù)硫唑嘌呤口服劑量的變化,得到硫唑嘌呤致肝毒性的基因和細(xì)胞變化,達(dá)到預(yù)測(cè)藥物肝毒性的效果。此次研究預(yù)測(cè)結(jié)果,硫唑嘌呤在20.7 mg·kg-1劑量下會(huì)使細(xì)胞DNA復(fù)制和細(xì)胞循環(huán)受到抑制,進(jìn)而引發(fā)藥物肝毒性[36]。

      這種研究思路可推廣至其他藥物的肝毒性預(yù)測(cè)中,有助于臨床應(yīng)用中藥物不良事件的早期診斷;通過(guò)鏈接PBPK模型,PICD法還可以預(yù)測(cè)藥物閾劑量,提供新的臨床用藥思路。通過(guò)選擇合適的體外實(shí)驗(yàn)方法和建立PBPK模型,PICD法也可用于預(yù)測(cè)藥物的腎毒性、心血管毒性和發(fā)育毒性等,應(yīng)用范圍廣泛,發(fā)展空間大。

      3.2 PBPK模型結(jié)合細(xì)胞分析的方法

      在藥物的安全性評(píng)估中,替代動(dòng)物試驗(yàn)的方法正變得越來(lái)越重要,各種細(xì)胞模型已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái),如人類肝細(xì)胞系、新鮮分離的肝細(xì)胞、3D模型和器官芯片模型等細(xì)胞分析模型[37]。但細(xì)胞模型只考慮藥物肝毒性的敏感性,可描述和預(yù)測(cè)肝毒性在體外系統(tǒng)的情況,尤其是考慮藥物與細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和基因的結(jié)合和分布,但忽視了體內(nèi)暴露量和持續(xù)時(shí)間。而PBPK模型則可以模擬和預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程[38]。因此,研究者開(kāi)始考慮將細(xì)胞模型和PBPK模型進(jìn)行結(jié)合并預(yù)測(cè)肝毒性。

      Paini等[38]構(gòu)建了一種結(jié)合虛擬細(xì)胞分析(virtual cell based assay)和PBPK模型預(yù)測(cè)雌二醇肝毒性的方法。此方法使用HepaRG細(xì)胞作為人體肝細(xì)胞的替代品,細(xì)胞活性作為體外毒理學(xué)終點(diǎn)指標(biāo),并使用虛擬肝細(xì)胞作為肝毒性研究模型,虛擬肝細(xì)胞模型所需要的相關(guān)參數(shù)可從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和PBPK模型中獲得,包括無(wú)影響濃度(no effect concentration)和殺傷率。他們將虛擬肝細(xì)胞的模擬結(jié)果和PBPK模型整合到KNIME數(shù)據(jù)工作平臺(tái),開(kāi)發(fā)了一個(gè)用戶友好的工具,用于預(yù)測(cè)肝毒性。這種方法強(qiáng)化了體內(nèi)外藥物暴露量與肝毒性之間的聯(lián)系,可用于藥物肝毒性劑量預(yù)測(cè),以支持藥物肝毒性的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

      根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)獲得不同濃度下肝細(xì)胞毒性變化數(shù)據(jù),建立藥物濃度與肝毒性關(guān)系的數(shù)學(xué)模型,而PBPK模型可以模擬藥物體內(nèi)濃度動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,獲得藥物劑量和肝濃度的變化曲線[32],這2個(gè)模型融合計(jì)算,獲得“藥物劑量-體內(nèi)肝濃度-肝毒性”之間的定量關(guān)系,即可對(duì)肝毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)。Yamazaki等[39]對(duì)肝毒性的預(yù)測(cè)方法就是采用了上述策略。他們?cè)陬A(yù)測(cè)了53種不同化學(xué)物質(zhì)的口服生物利用度(基于Caco-2細(xì)胞滲透性實(shí)驗(yàn))后,利用日本Hazard Evaluation Support System(HESS)平臺(tái),擬合了口服生物利用度與未產(chǎn)生肝毒性藥物閾濃度之間的定量關(guān)系。之后使用簡(jiǎn)化的大鼠PBPK模型估算藥物的肝與血漿濃度比與藥物口服劑量之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)部分藥物的PBPK模型預(yù)測(cè)的最大血漿濃度和血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(area under curve,AUC)與已報(bào)道的大鼠體內(nèi)的無(wú)明顯肝毒性的濃度一致,并且發(fā)現(xiàn)2-巰基苯并咪唑等幾種化合物的最大血藥濃度超過(guò)了引起肝毒性的閾值濃度,可能引發(fā)肝毒性反應(yīng)。該方法證實(shí)了大鼠PBPK模型預(yù)測(cè)肝毒性的可能性,未來(lái)可推廣至人體PBPK模型。

      3.3 PBPK模型結(jié)合深度學(xué)習(xí)的方法

      隨著人工智能、深度學(xué)習(xí)方法研究的推進(jìn),相關(guān)研究方法也被應(yīng)用到肝毒性的預(yù)測(cè)中,并取得不錯(cuò)的效果。如Alarecht等[40]提出了一種利用SVM分類器與PBPK模型預(yù)測(cè)肝毒性的新方法。他們選取了28種典型的肝毒性或非肝毒性化合物作為訓(xùn)練集,利用人類原代肝細(xì)胞和HepG2細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),獲得相關(guān)細(xì)胞毒性數(shù)據(jù),包括不同孵育時(shí)間(24,48和72 h)的EC10(引起10%毒性效應(yīng)的濃度)、EC50(引起50%毒性效應(yīng)的濃度)和EC90(引起90%毒性效應(yīng)的濃度);然后根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的訓(xùn)練集化合物的安全劑量和肝毒性劑量,利用PBPK模型預(yù)測(cè)得到相對(duì)應(yīng)的體內(nèi)暴露量(最大血藥濃度Cmax、全血中Cmax和AUC等);然后將訓(xùn)練集化合物對(duì)應(yīng)的體外毒性數(shù)據(jù),體內(nèi)暴露量以及該暴露量對(duì)應(yīng)的臨床結(jié)果(肝毒性/非肝毒性)輸入SVM分類器,通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)肝毒性和非肝毒性訓(xùn)練集化合物的分離,而且通過(guò)計(jì)算藥物在SVM向量空間的坐標(biāo),可以計(jì)算其肝毒性概率。因此,對(duì)于信息有限的化合物,該法可以直接根據(jù)化合物的體外細(xì)胞毒性數(shù)據(jù),推測(cè)化合物肝毒性的特定概率所對(duì)應(yīng)的血液濃度。最后,通過(guò)PBPK建模,血液濃度可以反推為相應(yīng)的口服劑量,從而將口服劑量與一定的肝毒性風(fēng)險(xiǎn)聯(lián)系起來(lái),預(yù)測(cè)該化合物在特定概率下不產(chǎn)生肝毒性的可接受日攝取劑量。該研究也發(fā)現(xiàn),將藥物的全血Cmax以及48 h的EC10作為SVM分類器的輸入?yún)?shù)時(shí),該法能達(dá)到最佳的分離性能和準(zhǔn)確度,其敏感性、特異性和準(zhǔn)確性分別為100%,87.5%和93.3%,顯示出較傳統(tǒng)毒理學(xué)研究更優(yōu)越的性能。未來(lái)該法可廣泛應(yīng)用于預(yù)測(cè)西藥和中藥成分的肝毒性,為藥物的肝毒性研究提供新的思路。

      3.4 PBPK模型結(jié)合DILIsym模型的方法

      藥物產(chǎn)生肝毒性的本質(zhì)原因是引起肝細(xì)胞死亡[41],但肝細(xì)胞死亡與細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器或蛋白質(zhì)的變化有著密切的關(guān)系[42]。為提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性,Simulations Plus公司聯(lián)合19家較大的制藥公司、美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)和學(xué)術(shù)界共同支持研發(fā)的一個(gè)DILI評(píng)估系統(tǒng),PBPK模型結(jié)合DILIsym模型的方法(以下簡(jiǎn)稱“DILIsym模型”)[43],這也是以PBPK模型為核心技術(shù),基于藥物對(duì)細(xì)胞器或某蛋白的干擾以預(yù)測(cè)藥物肝毒性最為成功的應(yīng)用。

      DILIsym模型利用定量系統(tǒng)毒理學(xué)的原理,集PBPK模型、DILI機(jī)制數(shù)據(jù)與患者的個(gè)體差異為一體,預(yù)測(cè)待測(cè)藥物的肝毒性和肝毒性生物標(biāo)志物濃度隨時(shí)間變化的情況[43-44]。目前,DILIsym模型整合了當(dāng)今最為前沿的肝毒性機(jī)制數(shù)學(xué)模型,包括線粒體損傷、活性氧的產(chǎn)生(氧化應(yīng)激)、膽汁酸瘀積、活性代謝物的產(chǎn)生、脂毒性和先天免疫反應(yīng)的激活等,這些機(jī)制均會(huì)引起肝細(xì)胞凋亡或壞死,最終會(huì)引起傳統(tǒng)生物標(biāo)志物如GPT和非傳統(tǒng)生物標(biāo)志物如谷氨酸脫氫酶和miR-122等釋放并進(jìn)入體循環(huán)[45-46]。

      DILIsym模型結(jié)合模擬體內(nèi)藥物動(dòng)態(tài)濃度變化的PBPK模型,根據(jù)體外獲取的肝毒性機(jī)制的特征參數(shù),使用所配套的SimPops?軟件構(gòu)建虛擬人群,用來(lái)預(yù)測(cè)人群中的肝毒性反應(yīng),并得到肝毒性反應(yīng)的個(gè)體差異,表現(xiàn)為肝損傷生物標(biāo)志物的體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化[47-48]。DILIsym型的概念如圖1,可以呈現(xiàn)多維度肝生理變化學(xué),包括藥物和細(xì)胞相互作用、藥物對(duì)肝整體的影響作用、藥物的全身分布和代謝的變化,以及藥物引起肝毒性反應(yīng)后人體生物標(biāo)志物的變化[49]。

      圖1 DILIsym模型概念[49].左側(cè)內(nèi)容代表藥物在不同生理維度的變化(即細(xì)胞、組織、器官到人體層面);右側(cè)分別代表相應(yīng)維度下藥物對(duì)肝細(xì)胞、肝和人體產(chǎn)生的影響。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)體現(xiàn)藥物對(duì)肝細(xì)胞功能的影響,PBPK模型體現(xiàn)藥物在體內(nèi)的濃度變化,SimPop?軟件體現(xiàn)人體肝功能生物標(biāo)志物的變異性。DILIsym模型可以達(dá)到直接預(yù)測(cè)藥物肝毒性的功能(即肝損傷生物標(biāo)志物的濃度變化).

      目前,DILIsym模型主要應(yīng)用于回顧性研究,以驗(yàn)證該模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度。為驗(yàn)證DILIsym模型預(yù)測(cè)肝毒性的前瞻性能力,目前有幾項(xiàng)臨床研究正在開(kāi)展中。DILIsym模型對(duì)藥物TAK-875是否產(chǎn)生DILI進(jìn)行了回顧性預(yù)測(cè)研究。TAK-875的體外細(xì)胞毒性機(jī)制數(shù)據(jù)(抑制膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和線粒體電子傳遞鏈酶)結(jié)合PBPK模型和245個(gè)虛擬2型糖尿病患者,經(jīng)過(guò)DILIsym模型預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)不同藥物劑量下PBPK模擬結(jié)果與實(shí)際結(jié)果擬合較好(血漿中AUC和Cmax的觀察值與模擬值比值<1.5)。而且也發(fā)現(xiàn)虛擬患者的GPT濃度具有差異,尤其是200 mg·d-1的劑量下,虛擬患者的GPT濃度>上限3倍的概率為16/245(6.5%),與實(shí)際臨床試驗(yàn)的結(jié)果(4.0%)接近,說(shuō)明DILIsym模型可以預(yù)測(cè)藥物是否導(dǎo)致人肝毒性,而且也可模擬臨床試驗(yàn)的結(jié)果[50]。

      而且,DILIsym模型也可有效避免預(yù)測(cè)結(jié)果出現(xiàn)種屬差異。曲格列酮的臨床研究表明其具有肝毒性,但是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中卻未被發(fā)現(xiàn)。DILIsym模型根據(jù)體外肝細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)定量預(yù)測(cè)曲格列酮肝毒性時(shí),發(fā)現(xiàn)臨床劑量在20~60 mg·d-1時(shí),虛擬受試者出現(xiàn)GPT超過(guò)正常值上限3倍以上的比例是0.3%~5.1%,接近于臨床上觀察到的比例(1.9%)。同時(shí)預(yù)測(cè)結(jié)果也發(fā)現(xiàn),膽汁酸在人體內(nèi)的升高幅度遠(yuǎn)高于大鼠,這與大鼠的膽汁酸具有親水性強(qiáng)和毒性小有關(guān),所以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果才會(huì)與臨床試驗(yàn)結(jié)果相反[9]。從曲格列酮也可看出,雖然動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是進(jìn)行非臨床肝毒性研究的重要方法,但種屬差異會(huì)影響最終結(jié)果。而DILIsym模型的預(yù)測(cè)結(jié)果不僅可有效避免種屬差異問(wèn)題,有效提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性,而且可為解決待測(cè)藥物待解決的肝毒性機(jī)制問(wèn)題提供參考,具有一舉多得的優(yōu)點(diǎn)。

      在藥物肝毒性的預(yù)測(cè)中,許多同類藥物由于結(jié)構(gòu)類似,常被認(rèn)為具有類似的肝毒性,但事實(shí)并非如此,如托卡朋和恩他卡朋。DILIsym模型預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),托卡朋使用推薦劑量時(shí),2.2%虛擬受試者會(huì)出現(xiàn)GPT顯著升高,與臨床觀察到1.3%~5.0%的頻率相符;而恩他卡朋未發(fā)現(xiàn)引起GPT顯著升高。且DILIsym模型也發(fā)現(xiàn)恩他卡朋的肝清除速率快于托卡朋,托卡朋的線粒體解偶聯(lián)作用強(qiáng)于恩他卡朋,且托卡朋的肝濃度比恩他卡朋高出3倍,因此才會(huì)出現(xiàn)兩者結(jié)構(gòu)類似但肝毒性相差較大的結(jié)果[51]。

      另一方面,DILIsym模型由于能夠很好地描述肝細(xì)胞的生理過(guò)程,如肝的再生過(guò)程和細(xì)胞凋亡或壞死后生物標(biāo)志物的釋放等,因而也能解釋臨床上發(fā)現(xiàn)的肝損傷生物標(biāo)志物變化時(shí)肝損傷的具體情況。恩托利莫(entolimod)作為一種抗腫瘤藥物,在健康志愿者的早期安全性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),該藥可引起受試者的GPT和GOT顯著升高,甚至>1000 U·L-1,所以該藥的研發(fā)一度中止。但通過(guò)DILIsym模擬預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),該藥造成的肝細(xì)胞壞死數(shù)量≤整個(gè)肝細(xì)胞數(shù)量的5%,<肝移植時(shí)捐贈(zèng)者的肝切除比例,不會(huì)帶來(lái)很大的健康風(fēng)險(xiǎn)。因此,該藥的開(kāi)發(fā)得以繼續(xù)進(jìn)行[52]。這也證實(shí)了DILIsym模型可以有效的避免藥物研發(fā)中的“濫殺無(wú)辜”現(xiàn)象的出現(xiàn)。

      DILIsym模型所使用的數(shù)據(jù)是細(xì)胞器水平的毒性數(shù)據(jù),依據(jù)藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響,提前預(yù)知藥物致肝損傷的前期變化,達(dá)到早期預(yù)測(cè)的效果。同時(shí),DILIsym模型也可為未知藥物致DILI的機(jī)制提供參考。而且DILIsym模型可以預(yù)測(cè)肝細(xì)胞再生過(guò)程、生物標(biāo)志物釋放和細(xì)胞凋亡或壞死程度,因此能有效預(yù)測(cè)一過(guò)性肝損傷,避免出現(xiàn)過(guò)度預(yù)測(cè)。隨著模型的不斷優(yōu)化,未來(lái)DILIsym模型也許可以替代部分臨床試驗(yàn),減少藥物研發(fā)對(duì)臨床試驗(yàn)的依賴,簡(jiǎn)化藥物研發(fā)流程,加快藥物上市流程。但DILIsym模型也有缺陷,如缺乏特殊人群模型,如兒童和老年人模型;缺乏其他肝損傷機(jī)制的參數(shù)。

      基于PBPK模型的預(yù)測(cè)方法可以有效預(yù)測(cè)藥物是否產(chǎn)生DILI和毒性口服閾劑量,而且在預(yù)測(cè)化合物的肝毒性方面具有很大優(yōu)勢(shì):不依賴化合物結(jié)構(gòu),可以避免出現(xiàn)結(jié)構(gòu)相似的化合物預(yù)測(cè)結(jié)果也相似的問(wèn)題;有效避免預(yù)測(cè)結(jié)果出現(xiàn)種屬差異的情況,提高藥物研發(fā)效率;也可以確定藥物的可接受日攝取劑量,有效提高藥物臨床試驗(yàn)的成功率和使用安全性。但是由于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和建模過(guò)程的復(fù)雜性,這類方法失去了QSAR模型簡(jiǎn)單易行的優(yōu)點(diǎn),不適用于快速篩選藥物。

      4 結(jié)語(yǔ)

      DILI是一種廣受關(guān)注的嚴(yán)重藥物不良反應(yīng),其預(yù)測(cè)方法的研究可以更早獲知藥物的肝毒性,代替動(dòng)物實(shí)驗(yàn),提高臨床試驗(yàn)和臨床用藥安全性。因此,數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)DILI方法的快速發(fā)展為全球藥物研發(fā)和臨床使用提供巨大的幫助。目前正在研究中的3類數(shù)學(xué)模型DILI預(yù)測(cè)方法:基于QSAR模型的方法、基于毒理基因組學(xué)模型的方法和基于PBPK模型的方法,從不同的角度提出了可替代傳統(tǒng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法,促進(jìn)藥物研發(fā)和使用的進(jìn)步。因此,藥物研究者可以在不同階段根據(jù)需求選擇合適的方法。

      目前,DILI預(yù)測(cè)方法的發(fā)展仍面臨許多挑戰(zhàn)。QSAR方法和其他需要使用計(jì)算機(jī)算法的方法在使用中既需依靠所選化合物的性質(zhì)和數(shù)量,也需依靠算法的普適性和準(zhǔn)確性,所以無(wú)法判別哪種化合物和算法更適合DILI預(yù)測(cè),預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性也無(wú)法保證;毒理基因組學(xué)所依賴的基因組學(xué)測(cè)序技術(shù)面臨升級(jí)困境,且缺乏數(shù)據(jù)信息挖掘的新技術(shù);而PBPK模型的建立依靠大量體內(nèi)外數(shù)據(jù),如果藥物體內(nèi)變化過(guò)程無(wú)法明確,或缺乏特殊人群的體內(nèi)數(shù)據(jù),則無(wú)法建立合適的PBPK模型,從而降低預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。未來(lái)數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)DILI方法的發(fā)展有賴于肝毒性機(jī)制和基礎(chǔ)計(jì)算機(jī)算法研究的進(jìn)步,也需要依靠技術(shù)和實(shí)驗(yàn)設(shè)備的發(fā)展。

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