張青杰，鄭天歌，程 濤，賈靖儀，梁建輝

（北京大學藥學院分子與細胞藥理學系，北京 100083）

腦電圖（electroencephalogram，EEG）是一種利用電生理信號記錄儀檢測得的表征大腦活動情況的圖形［1］，可觀察和分析腦細胞群自發(fā)性和節(jié)律性電活動的規(guī)律和特征。EEG不僅在臨床神經(jīng)精神疾病的診斷和治療中得到廣泛應用，而且是相關基礎研究有效的實驗方法和手段，在篩選和評價神經(jīng)精神疾病治療藥物、研究其藥理學作用機制等方面發(fā)揮重要作用［2-3］。目前清醒動物EEG采集方法分為有線和無線2種，前者通過電線連接動物頭部植入的顱內電極采集動物腦電信號，后者則采用無線遙感技術［4-5］。無線采集法具有不干擾動物自由活動、可避免電線晃動對腦電信號的影響等優(yōu)點，但成本高、植入頭部的傳輸器大而重、技術要求高而難及操作復雜等缺點限制了其推廣和應用，尤其不適合小鼠相關實驗研究［4-5］。因此，在相關實驗研究中，許多實驗室仍然選擇和使用有線法。

無論是有線還是無線采集法，顱內電極的埋置和電極連接裝置或腦電信號傳輸器的安裝都是必要的實驗步驟。傳統(tǒng)經(jīng)典的電極埋置和安裝屬于裸露式，即顱內電極連接裝置或腦電信號傳輸器直接埋置在大鼠或小鼠頭頂部，裸露在頭皮外。實際操作發(fā)現(xiàn)，裸露式顱內電極安裝法在術后實驗過程中，易出現(xiàn)電極連接裝置脫落且不可修復，給后續(xù)實驗帶來難以克服的困難和損失。經(jīng)過反復摸索和預實驗，本課題組建立一種大鼠和小鼠顱內電極“頭皮包埋式”埋置法，系統(tǒng)考察該方法采集腦電信號的可行性和有效性，以期在大鼠和小鼠腦電測定相關實驗中推廣應用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性 SD（Sprague-Dawley）大鼠，體重 220～270 g；雄性ICR小鼠，體重22～25 g；均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，SPF級，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006，合格證號：11001-11911054401；飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～23℃，濕度30%～50%，12/12 h明暗光照循環(huán)，自由進食進水。大鼠和小鼠分籠飼養(yǎng)，術前大鼠每籠5只（大籠），小鼠每籠5只（中籠），術后均單籠飼養(yǎng)。實驗開始前，大鼠和小鼠須在動物房適應4 d以上，定時抓摸以消除應激反應。實驗流程遵循美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物維護和使用指南（No.80-23，1996）。

1.2 實驗裝置和相關材料

選用杜邦線（型號/規(guī)格為1007-24AWG，欽源盛電子）作為大鼠電極，PVC鍍錫銅線（型號/規(guī)格為1571-28AWG，宏觀盛電纜）為小鼠電極。電極插座：JST連接插座（型號/規(guī)格為1.25-6A），深圳市新融躍電子。顱釘〔平頭螺絲，型號/規(guī)格為M1.4 mm×L2.5 mm（大鼠），型號/規(guī)格為M1.2 mm×L2.0 mm（小鼠）〕，深圳瑞沃德公司。義齒基托樹脂（Ⅱ型）和樹脂液劑（Ⅱ型），上海新世紀齒科材料有限公司；組織膠水（3M Vetbond Tissue），上海玉研科學儀器有限公司；大鼠和小鼠腦立體定位儀和顱骨鉆，深圳瑞沃德公司。腦電信號采集系統(tǒng)：MP150多導生理信號記錄儀和AcqKnowledge4.2采集軟件，美國Biopac公司；SleepSign軟件（版本：3.2.6.1404），日本Kissei Comtec公司。

1.3 大鼠和小鼠顱內電極埋置

1.3.1 顱內電極連接裝置制作

“頭皮包埋式”埋置法使用的顱內電極連接裝置為自行設計制作，由電極連接導線和連接插座組成（圖1A和1B）。6P JST1.25連接插座焊接3根直徑1.0 mm（大鼠）或0.6 mm（小鼠）帶絕緣漆皮的導線，線長2.5 cm（大鼠）或2.0 cm（小鼠），末端0.5 cm處剝落漆皮，使金屬絲裸露可纏繞于顱釘上導電。焊接處用熱熔膠涂抹做絕緣處理，最外部包裹一層熱縮管，起加固和絕緣作用。

Fig.1 Electroencephalogram（EEG）electrode connection device used for collecting rat and mouse EEG signals.A：the self-designed electrode connection device for rats；B：the self-designed electrode connection device for mice；C：the electrode connection device used in the traditional uncovered method.

傳統(tǒng)裸露式安裝法所用EEG電極連接裝置如圖1C，3根裸露金屬絲分別焊接在連接插座針腳上，金屬絲長2～3 cm，直徑約0.3 mm，外部無任何絕緣措施。

1.3.2 顱骨暴露手術

使用0.3%戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1，ip）麻醉大鼠和小鼠。翻正反射消失后，頭頸部剃毛。按常規(guī)，腦立體定位儀固定大鼠或小鼠頭部（手術臺鋪保溫墊，避免體溫下降）和消毒，并暴露頭部骨窗。操作如下：①“頭皮包埋式”埋置法：頭部中線位置做縱行線性切口，大鼠切口長約1.2 cm，小鼠切口長約0.8 cm。3%H2O2溶液處理切口內的頭皮下組織，暴露出前后囟。②傳統(tǒng)裸露式電極安裝法：頭部剪去面積大小適當?shù)钠つw組織（直徑不低于前后囟位置長度的圓形），3%H2O2溶液處理裸露出來的頭皮下組織。

1.3.3 顱內電極植入

安裝坐標。大鼠：左側枕葉（AP-4.80，ML-3.0），右側枕葉（AP-4.80，ML+3.0），左側皮質前額葉區(qū)（AP+2.0，ML-2.0）；小鼠：左側枕葉（AP-2.5，ML-2.0），右側枕葉（AP-2.5，ML+2.0），左側皮質前額葉區(qū)（AP+1.0，ML-1.0）。

采用腦立體定位儀，按上述坐標在顱骨表面定位，標記，鉆孔（直徑約1.0 mm），垂直擰入顱釘（顱內電極），至大腦組織表面即可。隨后安裝EEG電極連接裝置。①“頭皮包埋式”埋置法：在頸背部距前囟位置3.0 cm（大鼠）或2.0 cm（小鼠）處作橫向切口0.5 cm，分離皮下組織至頭部切口。顱內電極連接裝置經(jīng)頸背部切口皮下插入，分別將3根電極連接導線與3枚顱釘相連，并將顱內電極連接裝置的插座部分裸露在頸背部切口之外。碘伏消毒后，用適量牙托水泥包封顱釘和電極導線。牙托水泥固化后，切口消毒，涂抹組織膠水黏合頭部切口和頸背部切口，即將顱釘和電極連接導線埋置皮下。②傳統(tǒng)裸露式電極安裝法：使用傳統(tǒng)方法用電極連接裝置，在大鼠或小鼠頭部暴露的骨窗處，分別將裸露金屬絲與顱釘纏繞連接。隨后使用適量牙托水泥包封頭部顱釘、電極連接裝置的金屬絲和插座針腳，頭部其他創(chuàng)面亦需用牙托水泥覆蓋。術后ip給予青霉素，預防切口感染?；謴? d后進行EEG相關實驗。

1.4 腦電圖數(shù)據(jù)采集

動物適應實驗環(huán)境1 h后，將MP150多導生理信號記錄儀上的信號采集傳輸線與顱內電極連接裝置的插座相連接，持續(xù)采集15 min。實驗數(shù)據(jù)的采樣頻率設置為50 Hz，EEG100C腦電放大器的輸入頻帶范圍為0.1～1000 Hz。

1.5 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計學分析

使用SleepSign軟件（版本：3.2.6.1404）分析腦電信號的頻率和功率。相對功率可消除不同個體腦電信號功率自身的差異對實驗結果的影響［6］。相對功率（%）=（不同頻率的功率/總功率）×100%。

2 結果

2.1 頭皮組織切口愈合和顱內電極保持

采用“頭皮包埋式”埋置法安裝大鼠和小鼠頭部腦電電極，術后7 d，大鼠和小鼠頭部和頸背部切口基本愈合，未見感染，進食進水及一般行為活動未受明顯影響，可進行腦電采集相關實驗。圖2A和2B顯示，術后21 d，雖仍可見頭部和頸背部切口裸露的皮膚，但整體恢復良好，未見組織壞死。術后42 d，切口完全修復，包埋顱內電極的頭皮組織生長良好，新生毛發(fā)完全覆蓋切口。尤其是顱內電極及其連接裝置保持完好。而傳統(tǒng)裸露式顱內電極安裝法手術21和42 d后，切口仍然裸露，并出現(xiàn)不同程度的炎癥和潰爛（圖2C）。

Fig.2 Recoveries of incisions in rats and mice.A：rats treated with sub-scalp EEG electrode installation method；B：mice treated with sub-scalp EEG electrode installation method；C：rats treated with traditional uncovered method.

針對顱內電極和連接裝置脫落的情況，本研究選取相同周齡的大鼠20只，隨機分為2組，每組10只。分別采用“頭皮包埋式”埋置法和傳統(tǒng)裸露式安裝法安裝EEG電極連接裝置，術后連續(xù)觀察100 d。前者未見電極裝置脫落，后者大鼠頭部電極裝置脫落3/10。同樣方法檢驗小鼠EEG電極裝置的脫落情況，連續(xù)觀察100 d，前者無電極裝置脫落，后者電極裝置脫落2/10。

2.2 “頭皮包埋式”埋置法可行性驗證

為驗證所建立的顱內電極“頭皮包埋式”埋置法和傳統(tǒng)裸露法腦電信號檢測結果的一致性，比較和分析大鼠和小鼠在清醒和麻醉狀態(tài)下的EEG相對功率。圖3結果顯示，無論是大鼠還是小鼠，2種方法所得大鼠和小鼠EEG的相對功率值在各頻段的分布均無顯著性差異。

Fig.3 Frequency and relative power of EEG in conscious and anesthetized mice(A,B)and rats(C,D)with uncovered and sub-scalp EEG electrode installation method.Relative power（%）=（power at different frequencies/total power）×100%.A and C：the relative power values of EEG obtained by mice and rats in conscious state；B and D：the relative power values of EEG obtained by mice and rats under anesthesia（0.3% pentobarbital，30 mg·kg-1，ip）.±s，n=5-7.

2.3 “頭皮包埋式”埋置法分析清醒和麻醉大鼠和小鼠腦電信號

用“頭皮包埋式”埋置法分析和比較了戊巴比妥鈉麻醉作用對小鼠腦電信號的影響。圖4A為麻醉和清醒狀態(tài)下小鼠EEG實測圖。結果顯示，麻醉狀態(tài)下EEG振幅較大，波形高且寬。圖4B為2種狀態(tài)下相對功率曲線圖，可見低頻段（0～5 Hz）處存在一峰值，高頻段處EEG相對功率值曲線較為平緩，整體表現(xiàn)為麻醉狀態(tài)高于清醒狀態(tài)。將不同頻段相對功率進行進一步比較和分析，結果顯示（圖4C），在δ波（0.5～3 Hz）中，麻醉狀態(tài)相對功率較清醒狀態(tài)低15.6%，θ，α和β波則呈現(xiàn)麻醉狀態(tài)相對功率高于清醒狀態(tài)的趨勢，分別高出30.5%，416.6%和499.3%，但均無統(tǒng)計學差異?？傮w而言，在各個頻段范圍內，小鼠麻醉和清醒狀態(tài)EEG相對功率無顯著性差異。

Fig.4 Frequency and relative power of EEG in conscious and anesthetized mice with sub-scalp EEG electrode installation method.A：EEG in anesthetized and conscious mice；B：frequency distribution curves of the EEG relative power；C：comparison of relative power between consciousness and anesthesia（pentobarbital，0.3%，30 mg·kg-1，ip）groups.±s，n=4.

用“頭皮包埋式”埋置法分析和比較了戊巴比妥鈉麻醉作用對大鼠腦電信號的影響。圖5A為麻醉和清醒狀態(tài)下大鼠EEG的實測圖。結果顯示，麻醉狀態(tài)振幅較高，波型較寬。圖5B為2種狀態(tài)下相對功率曲線圖，可見低頻段（0～5 Hz）處存在一峰值，高頻段處EEG相對功率值曲線較為平緩，整體表現(xiàn)為麻醉狀態(tài)相對功率曲線位于清醒狀態(tài)上方。進一步作不同頻段相對功率的比較和分析，結果顯示（圖5C），在各個頻段范圍內，大鼠清醒和麻醉狀態(tài)相對功率無顯著性差別，但在頻率較高范圍（3～30 Hz）內，麻醉狀態(tài)則表現(xiàn)出高于清醒狀態(tài)的趨勢，大鼠θ，α和β波麻醉狀態(tài)相對功率比清醒狀態(tài)分別高出10.4%，114.9%和351.9%。

Fig.5 Frequency and relative power of EEG in conscious and anesthetized rats with sub-scalp EEG electrode installation method.A：EEG in anesthetized and conscious rats；B：frequency distribution curves of the EEG relative power；C：comparison of relative power between consciousness and anesthesia（0.3% pentobarbital，30 mg·kg-1，ip）groups.±s，n=3.

2.4 “頭皮包埋式”埋置法分析不同周齡大鼠腦電信號

選用7周齡大鼠用“頭皮包埋式”埋置法安裝電極，分別在第8，10和12周齡時采集大鼠腦電信號，觀察大鼠不同周齡腦電信號的變化。結果顯示（圖6），各周齡段δ波的相對功率不存在統(tǒng)計學差異；θ，α和β波段處，第12周的大鼠EEG相對功率較第8周顯著增加（P＜0.05）。

Fig.6 Relative EEG power of different weeks of age in rats with sub-scalp EEG electrode installation method.The method of embedding EEG electrodes under the scalp was adopted to install EEG signal acquisition devices，and EEG signals were collected at 8，10，and 12 weeks of age.±s，n=4-6.＊P＜0.05，compared with corresponding 8-week group.

針對大鼠的周齡和各頻段相對功率進行Pearson相關性分析。統(tǒng)計結果（圖7）顯示，δ，θ，α和β波相對功率與大鼠周齡相關系數(shù)（r）分別為-0.874（P=0.161），0.992（P=0.041），0.985（P=0.055）和0.998（P=0.018），表明θ和β波相對功率與大鼠周齡呈顯著正相關，隨大鼠周齡的增加，θ和β波的相對功率隨之增加。

Fig.7 Correlation between relative EEG power and weeks of age in rats with sub-scalp EEG electrode installation method.See Fig.6 for the rat treatment.±s，n=4-6.

3 討論

傳統(tǒng)裸露式顱內電極安裝完成后，手術切口裸露的面積大，愈合時間長，損傷的肌肉、骨膜、皮膚等組織讓動物產(chǎn)生明顯的不適感，尤其是頭部大塊牙科水泥和顱內電極連接裝置妨礙動物的自由活動以及進食進水行為，可增加和促使動物抓撓和剮蹭頭部裝置，導致顱內電極及連接裝置脫落，無法修復，造成人力、時間、科研經(jīng)費的浪費和損失。有鑒于此，本課題組對傳統(tǒng)裸露式顱內電極安裝方法改進為“頭皮包埋式”埋置法。該法改進如下：①將顱內電極包埋于大鼠或小鼠頭皮下，使之能夠得到頭皮的保護。此方法中分離和縫合頭皮組織是否壞死最為關鍵。本實驗結果表明，該法術后頭皮組織和新生毛發(fā)生長良好，切口完全修復，未觀察到頭皮組織炎癥和潰爛，癥狀明顯輕于傳統(tǒng)裸露式安裝法。②采用組織膠水黏合頭皮切口，術后不存在裸露的手術創(chuàng)面，可明顯減輕動物的不適感，減輕抓撓和剮蹭行為，有利于保護顱內電極及其連接裝置，防止脫落。由于組織膠水費用較高，在部分預實驗中選用了價格低廉的502膠水黏合皮膚切口，收到了同樣的效果，即切口愈合良好，可完全修復，但具有一定刺激作用。③盡可能減少牙托水泥的用量，以恰好密封顱釘和裸露導線接頭為宜，可避免頭部大塊牙科水泥對動物自由活動和進食進水行為的妨礙。預實驗時，曾經(jīng)嘗試使用熱熔膠替代牙托水泥，雖然在包埋顱內電極和絕緣方面可取得相同的效果，但熱熔膠的穩(wěn)定性不如牙托水泥。此外，術中可見熱刺激作用。④傳統(tǒng)裸露式安裝法是顱內電極直接與連接插座硬性連接，動物頭頂部包塊大，易剮蹭，致使連接裝置和顱內電極易脫落，且無法修復。“頭皮包埋式”埋置法通過連接導線，實現(xiàn)顱內電極與連接插座間的間接柔性連接，并將連接裝置置于動物頸背部，避免其與飼養(yǎng)環(huán)境直接碰擦，有利于長久保持。此外，“頭皮包埋式”埋置法在插座脫落后，顱內電極和連接導線仍然存在，提供了重新焊接插座、修復連接裝置的可能性。本實驗結果顯示，采用“頭皮包埋式”埋置法埋置顱內電極，安裝連接裝置，大鼠和小鼠頭部和頸背部切口可自行愈合，機體功能表現(xiàn)正常，體重增長處于合理范圍，進食進水未受明顯影響。由此表明，“頭皮包埋式”埋置法具有明顯的優(yōu)勢和很好的實用性。

鼠籠籠蓋的改造可以有效地避免剮蹭行為所造成的顱內電極和連接裝置的脫落?！邦^皮包埋式”埋置法選用厚度為0.1 mm延展性較好的銅片包裹籠蓋底部凸起處，并將食物直接放入籠內。此外，單籠飼養(yǎng)可以防止打斗造成的連接裝置脫落。安裝顱釘時，應注意把握深度，位置過深易損傷腦組織，過淺則影響腦電信號的傳導。

除改進手術方法外，完善信號采集環(huán)境亦十分重要。在EEG信號的采集過程中，出現(xiàn)信號不穩(wěn)定、信噪比差等情況，主要是由于信號采集過程中動物活動造成了腦電采集電纜移動、導線張力增加或頭部電極裝置松動，致使信號接收斷開所致。頭部電極和測量籠的轉輪是腦電記錄系統(tǒng)中最關鍵的部分。安裝可靠而穩(wěn)固的頭部電極可極大地避免裝置松動，合理的平衡與導線旋轉系統(tǒng)可防止其身體扭轉或起伏對測量的干擾，并減少電纜在箱內下墜對動物頭部造成的拖拽感，還可預防動物啃咬導線［7］。此外，牢固的導線接口、絕緣的測量箱和完全的電磁屏蔽環(huán)境也是獲得長期穩(wěn)定的腦電信號的重要條件。

分別采用傳統(tǒng)裸露式顱內電極安裝法和“頭皮包埋式”埋置法對大鼠和小鼠進行了信號采集。實驗結果顯示，不論是在清醒還是麻醉狀態(tài)下，這2種方法得到的EEG相對功率均呈現(xiàn)隨頻率增加而下降的狀態(tài)，且在同一測定條件下，兩者EEG相對功率在各頻段的分布狀態(tài)一致，無顯著性差異。以上結果表明，本研究所建立的“頭皮包埋式”埋置法與傳統(tǒng)裸露式安裝法的檢測結果具有良好的一致性。

采用“頭皮包埋式”埋置法檢測得到的大鼠和小鼠麻醉和清醒狀態(tài)EEG，波形穩(wěn)定，背景干擾小。信號采集腦區(qū)為左右枕葉部位，δ波有較高響應。麻醉狀態(tài)下，EEG波型變寬，振幅升高，表明麻醉作用使大鼠腦電信號向低頻位置轉移，相對功率增高。據(jù)報道，異氟烷、安氟醚、氟烷和巴比妥酸鹽等多種麻醉藥品對腦電信號有影響，在深度麻醉狀態(tài)下均會導致EEG振幅增加［8-9］。本檢測結果與上述報道相符。

麻醉無意識狀態(tài)下腦電活動與睡眠狀態(tài)相近［10］，大腦EEG會向較慢頻率轉變，α波逐漸消失，θ和δ波大范圍出現(xiàn)［11-12］。本法選用戊巴比妥麻醉，實驗結果顯示，麻醉狀態(tài)下大鼠和小鼠θ波相對功率均呈現(xiàn)大于其清醒狀態(tài)的趨勢，增加幅度分別為10.4%和30.5%；α和β波相對功率也出現(xiàn)不同程度的增加，與報道相符［13］。此改變可能是由于進入麻醉狀態(tài)時，外周神經(jīng)沖動被阻斷，丘腦-皮質神經(jīng)元環(huán)路自發(fā)振蕩增強，造成大腦皮質高幅慢波比重增加［14］，腦電信號趨于同步化。

大鼠在第8，10和12周時的腦電信號顯示，周齡越大，EEG中高頻段占比越高，且呈隨周齡增加而增加的趨勢。與第8周相比較，第12周θ，α和β波相對功率明顯增加，第10周也分別增長137.6%，323.6%和493.0%。θ和β頻段的相對功率與周齡增長成顯著正相關。上述結果表明，大鼠隨周齡增長其枕葉部神經(jīng)元放電趨于去同步化，低幅快波的比重逐漸增大，δ波相對功率隨大鼠周齡增加而降低，θ，α和β波相對功率隨周齡增加而增大，與文獻［15］報道一致。對人腦電研究發(fā)現(xiàn)，隨年齡增長，β波的相對功率同樣會出現(xiàn)顯著增加［16］，δ波相對功率表現(xiàn)為下降趨勢［17］。據(jù)報道，老年大鼠（15～17月齡）α和β波相對功率較年輕大鼠（2～3月齡）更高，而δ和θ波相對功率則分別呈增加和降低的趨勢［13］，本實驗結果與此不完全一致，可能與實驗動物的年齡差異、腦電采集腦區(qū)不同等實驗條件有關。

綜上所述，電極“頭皮包埋式”埋置法不僅可實現(xiàn)大鼠和小鼠腦電信號的采集分析，還具有更加穩(wěn)固、創(chuàng)傷小、感染率低、成本低廉和檢測線拆卸靈活等特點，且具有更加可靠、穩(wěn)定和持久的優(yōu)點，可用于測定大鼠和小鼠EEG信號。