張文圣，楊洋，盧依剛，鄧新喜，萬濱，張卓，李勛剛

(九江市第一人民醫(yī)院，江西 九江 332000)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一。近年來，全世界死于膀胱癌的人數逐年增加[1]。美國2017年報道的數據顯示大約有79 000多例新發(fā)膀胱癌病例，其中死亡人數約為16 870 例[2]。膀胱癌的治療在臨床實踐中仍然面臨許多挑戰(zhàn)，治療后患者預后不理想。當前，手術聯(lián)合放化療是膀胱癌的主要治療方式。近年來，腫瘤免疫療法的飛速發(fā)展從根本上改變了臨床抗腫瘤方式，為治療腫瘤打開了新的大門。美國癌癥研究中心在2016年年度報告中表示，免疫療法被評為既往癌癥相關研究重要進展[3]。免疫檢查點包括PD-1/PD-L1，CTLA-4，BTLA，Tim-3等，屬于免疫抑制分子的一種，通過調節(jié)免疫反應來保護正常的組織。PD-1免疫檢查點特異性強，分布廣泛，作用持久，近年來已廣泛用于腫瘤免疫治療的研究[4]，研究熱點集中于免疫學檢查點抑制劑。大量研究證實，對于卵巢癌、膀胱癌、腎細胞癌、惡性黑色素瘤、宮頸癌等惡性腫瘤的治療，PD-1免疫檢查點抑制劑均有效。Durvalumab屬人源化PD-1 IgGlk單克隆抗體，可與PD-1蛋白結合，進而影響T細胞表面CD80與PD-1的結合，從而解除對免疫應答的抑制，使腫瘤細胞逃避T細胞追殺時，不能利用PD-L1/PD-1途徑逃脫追殺[5-6]。也有報道[7]稱PD-L1蛋白單克隆抗體對缺乏PD-L1表達但沒有檢測到毒性的相鄰癌細胞具有一定的細胞殺傷作用以及旁觀者殺傷作用。

吉西他濱(GEM)是抑制DNA合成的抗癌藥物，可抑制抗脫氧胞苷核苷酸代謝過程，屬脫氧胞苷類似物[8]。GEM可在一定條件下，在人體內轉化為具有一定活性的三磷酸核苷、二磷酸核苷，發(fā)揮其殺傷腫瘤細胞的作用；并可干擾DNA聚合酶工作過程，影響DNA正常配對，進而影響DNA合成進程、抑制腫瘤細胞生長。GEM應用于人體內治療可增強自身作用強度，進一步增強其藥物活性[9-10]。GEM具有低毒性的特點，在與其他化療藥物合用時，毒性反應、藥物交叉耐藥性均無疊加作用，因此被廣泛用于膀胱癌術后灌注治療及其他惡性腫瘤治療中。本研究旨在分析PD-1免疫檢查點抑制劑Durvalumab對吉西他濱誘導膀胱癌T24細胞凋亡的作用，從而為膀胱癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

人膀胱癌T24細胞培養(yǎng)方法：常規(guī)傳代培養(yǎng)于1640細胞培養(yǎng)基(10%胎牛血清)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2；實驗正式開始時間為對數生長期。將其分為對照組、吉西他濱組和吉西他濱+Durvalumab組。

1.2.2 定量聚合酶鏈反應檢測Caspase-3基因的表達

采用定量聚合酶鏈反應(Q-PCR)檢測Caspase-3基因的表達，3組均嚴格依據試劑盒說明書操作，達到時間后對處理的細胞進行收集，按照Trizol法步驟提取總的RNA，之后取出1 μg RNA進行逆轉錄，Q-PCR法擴增cDNA片段。Q-PCR反應體系：Mix10μL，primer F0.4μL，primer R0.4μL，Rox 0.4 μL，CDNA 2 μL，ddH2O 6.8 μL。反應條件：94 ℃ 5min；94 ℃ 15s，60 ℃1min，共循環(huán)40次，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。

1.2.3 蛋白質印跡法檢測Caspase-3蛋白的表達

細胞處理完成后以胰酶消化，收集細胞于1.5 mL離心管中，1 200 r/min離心5 min，取下層細胞，行2次清洗[1 mL磷酸緩沖液(PBS)]，1 200 r/min離心5 min，取下層細胞，加裂解和提取緩沖液(RIPA)漩渦震蕩，然后行30 min冰浴(4 ℃)，離心(12 000 r/min，15 min)，轉移上清到1.5 mL離心管中，用雙辛酸(BCA)定量。加入6×Lodding buffer，混勻，煮沸(100 ℃，5 min)。準備電泳凝膠，結合最終定量，取樣量為50 μg，80 V跑至濃縮膠底部，后設置120 V直至跑至凝膠底部；轉膜(300 mA，1.5 h)，脫脂奶粉(TBST)封閉(含有5%BSA)，兔單抗Caspase-3(1∶2 000)，鼠單抗β-actin(1∶1 000)，4 ℃反應，過夜，后搖床上行3次TBST清洗(每次5 min)；行室溫孵育(羊抗兔和羊抗鼠二抗(1∶3 000)，行3次TBST清洗(每次5 min)，電化學發(fā)光(ECL)顯色；掃描分析儀以化學發(fā)光法進行。

1.2.4 細胞代謝活性比色法檢測細胞的增殖能力

正常培養(yǎng)T24細胞，使細胞密度超過80%，將濃度調整為5×104/mL，接種96孔培養(yǎng)板，每孔150 μL，等待細胞黏附好，然后開始稀釋藥物，細胞處理方法與之前相同。另外，陰性對照為未添加藥物的正常組，并且將沒有細胞的培養(yǎng)基用作為空白對照。每組有6個復合孔。用細胞代謝活性比色法(MTT)檢測藥物對細胞活性的影響，到達作用時間后，每個孔均加入10 μL 5 g/L MTT溶液，再培養(yǎng)3 h，在觀察過程中，用移液管小心吸出培養(yǎng)液，每個孔加150 μL二甲基亞砜(DMSO)；吸光度波長為490 nm，計算細胞抑制率。

1.2.5 膜聯(lián)蛋白V凋亡檢測試劑雙染法檢測細胞凋亡

用膜聯(lián)蛋白V凋亡檢測試劑(AnnexinV-FITC/PI)雙染法檢測細胞凋亡。將細胞在六孔板中分組接種，并用藥物處理，到達作用時間后收集細胞，PBS洗滌2次，取3×105個細胞，加入195 μL結合液重懸細胞，之后加入5 μL AnnexinV-FITC，混勻，在黑暗中于室溫下孵育10 min，然后離心并丟棄上清液。加入200 μL結合溶液使細胞輕柔地重懸，加入20 μL PI充分混合，將樣品包裹在錫箔中，并于1 h內在流式細胞儀上進行檢測。

2 結 果

2.1 Q-PCR法檢測Caspase-3的基因表達量

吉西他濱+Durvalumab組Caspase-3基因表達水平明顯高于吉西他濱組和對照組，且對照組為最低(P<0.001；P<0.01)，說明Durvalumab可以促進吉西他濱對T24的凋亡作用(見圖1)。

**表示吉西他濱+Durvalumab組與對照組比較，P<0.01；***表示吉西他濱組與對照組比較P<0.001

2.2 蛋白質印跡法檢測Caspase-3蛋白的表達水平

吉西他濱+Durvalumab組Caspase-3蛋白的表達水平明顯高于吉西他濱組和對照組，而對照組與吉西他濱組比較差異無統(tǒng)計學意義，說明Durvalumab可以促進吉西他濱對T24的凋亡作用(見圖2和圖3)。

圖2 各組Caspase-3蛋白表達水平

***表示吉西他濱+Durvalumab組分別與對照組和吉西他濱組比較，P均<0.001

2.3 MTT法檢測三組T24細胞的增值能力

吉西他濱組和吉西他濱+Durvalumab組與對照組相比細胞增殖水平明顯降低，且吉西他濱+Durvalumab組為最低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001；P<0.01)(見圖4)。

**表示吉西他濱+Durvalumab組與對照組比較，P<0.01，***表示吉西他濱+Durvalumab組與吉西他濱比較P<0.001

2.4 流式細胞儀檢測細胞的凋亡

吉西他濱+Durvalumab組凋亡表達水平明顯高于吉西他濱組和對照組，吉西他濱組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(見圖5和圖6)。

圖5 藥物處理后三組細胞的凋亡水平

***表示吉西他濱+Durvalumab組與對照組比較，吉西他濱組與對照組比較，P均<0.001

3 討 論

近年來，膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤，其發(fā)病率和病死率逐年升高，且具有高復發(fā)率和高進展率。多項研究證實[11-12]，膀胱癌與免疫逃逸密切相關，膀胱癌免疫逃逸的原因是多個負性共刺激分子(免疫檢查點)(例如PD-1)的異常表達，導致特異性T細胞應答下調，造成腫瘤細胞逃逸?；瘜W療法是治療膀胱癌的一種重要手段。Kilani等[13]發(fā)現(xiàn)吉西他濱有選擇地對人和小鼠膀胱移行細胞癌細胞系產生細胞毒性作用。吉西他濱是一種嘧啶核苷酸類似物，已被廣泛用于膀胱癌，尤其肌層浸潤性膀胱癌的化學療法已經將吉西他濱列為一線治療方案。但目前腫瘤化療治療中，患者耐藥性提升是影響化療效果和腫瘤控制能力的重要因素，因此如何減輕化療藥物耐藥性、提升藥物敏感性是腫瘤治療領域研究重點。免疫檢查點分子是機體調節(jié)免疫應答和建立對自身抗原免疫耐受的重要“剎車”分子，其中PD-1為研究熱點。PD-1屬免疫制劑受體，由凋亡性T細胞雜交瘤消減雜交獲得，其表達情況與T淋巴細胞免疫缺陷密切相關。當PD-1與它的配體PD-L1結合時，可以激活負調節(jié)途徑，抑制T細胞增殖，進而抑制腫瘤細胞。臨床研究發(fā)現(xiàn)，除晚期膀胱癌外，PD-1免疫檢查點抑制劑用于其他部位腫瘤也可獲得理想療效，甚至可超過晚期膀胱癌的治療效果。PD-1抗體的直接靶點是PD-1，PD-1是最直接的預測指標，具有非常好的預測效果，但是目前利用PD-1作為檢測指標，在組織中還存在一些技術性的問題。本研究表明，在對膀胱癌T24細胞凋亡干預中(吉西他濱誘導)，PD-1免疫檢查點抑制劑Durvalumab對其具有促進作用。腫瘤細胞免疫反應期間，其腫瘤抗原的呈遞過程需依靠免疫系統(tǒng)，并激活特異性T細胞，以應對免疫殺傷作用。T淋巴細胞工作過程需接受共刺激信號、抗原呈遞信號完成激活過程，而共刺激信號參與人體免疫反應需依靠向淋巴細胞提供調節(jié)信號(陰性或陽性)。人體共刺激分子中，PD-1/PD-L1是關鍵分子，其中PD-1表達于不同活化后T細胞表面，PD-L1可以在諸如造血細胞和胰島的組織和器官表面上以及各種人類實體腫瘤細胞的表面上表達，通過探索免疫檢查點PD-1對癌癥治療的相關影響，可為癌癥的早期根治及用藥方案提供理論依據。

癌癥免疫療法使我們了解了惡性腫瘤的治療方法，并為癌癥患者帶來了希望。雖然在膀胱癌免疫抑制劑研究中效果顯著，但仍有許多未知領域有待探索。我們不僅要探索其深度，而且必須擴大研究寬度。在接下來相關研究中，我們應積極探索更多免疫檢查點，以研發(fā)、探索更具特異性的腫瘤治療藥物。