阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱對(duì)Lewis肺癌的實(shí)驗(yàn)研究

李 源,秦蓉聲,范 娟

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，四川 瀘州 646000)

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)又稱血管通透因子，是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等作用，因此VEGF信號(hào)通路在血管生成過程中發(fā)揮重要作用[1]。多項(xiàng)研究顯示[1-2]，血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的必要條件，抑制腫瘤血管形成，阻斷腫瘤營(yíng)養(yǎng)的供給，即可達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的，因此抑制腫瘤新生血管生成已成為目前治療腫瘤相關(guān)疾病的重要手段之一。阿帕替尼，一種口服的新型的小分子酪氨酸激酶抑制劑，主要與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)結(jié)合，從而抑制VEGFR-2磷酸化，以達(dá)到抑制血管生成的目的[3-4]。阿帕替尼主要用于晚期胃癌的治療，但相關(guān)研究已證明其對(duì)肺癌具有明顯的抑制作用[5]。肺癌作為一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率長(zhǎng)期居第1位[6]。肺癌的常見治療手段包括手術(shù)、放療、化療及靶向治療，其中化療是大多數(shù)晚期肺癌的主要治療手段，吉西他濱、紫杉醇、順鉑等均是肺癌常用的化療藥物，盡管可選擇的化療方案多樣，但由于患者不耐受以及耐藥問題的出現(xiàn)，單純化療療效仍欠佳。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)阿帕替尼聯(lián)合化療治療肺癌的研究較少，本實(shí)驗(yàn)旨在阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱作用于Lewis肺癌的抑制作用及可能機(jī)制，為臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 Lewis細(xì)胞由西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。C57/BL6小鼠28只，雌性，6～8周齡，體重18～22 g，購(gòu)自重慶騰鑫生物生物技術(shù)有限公司，在無特定病原體級(jí)條件下統(tǒng)一飼養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)：SYXK(渝)2015-0002]。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，甲磺酸阿帕替尼片由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供，VEGFR-2抗體購(gòu)自德國(guó)Bio-world公司。

1.2方法

1.2.1Lewis肺癌模型建立與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 取處于對(duì)數(shù)期Lewis肺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL，以0.1 mL/只接種于C57/BL6小鼠右大腿。腫瘤體積增長(zhǎng)到100～200 mm3(接種前通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，接種時(shí)確保細(xì)胞懸液無外滲，以確保每只小鼠成瘤；接種后隔天觀察小鼠，用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠瘤體積，約10 d 28只小鼠均成瘤)，采用隨機(jī)數(shù)字法分為空白對(duì)照組、阿帕替尼組、吉西他濱組、阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組，每組7只?？瞻讓?duì)照組：0.9%氯化鈉注射液0.2 mL/d，灌胃，第1～7天；阿帕替尼組：阿帕替尼200 mg/(kg·d)，灌胃，第1～7天；吉西他濱組：吉西他濱50 mg/(kg·d)，腹腔注射，每周2次；阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組：阿帕替尼200 mg/(kg·d)，灌胃，第1～7天，吉西他濱50 mg/(kg·d)，腹腔注射，每周2次。成瘤后隔天采用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑及最短徑，根據(jù)公式V=1/2ab2(a：最長(zhǎng)徑，b：最短徑)計(jì)算瘤體積[7]。治療結(jié)束次日每組隨機(jī)選取3只行小動(dòng)物正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(positron emission tomography,PET)/CT。治療后第13天采用頸椎脫臼法處死所有小鼠,處死后取出腫瘤組織，行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率：(對(duì)照組平均瘤體積-治療組平均瘤體積)/對(duì)照組平均瘤體積(×100%)[7]。

1.2.2PET/CT掃描 治療結(jié)束次日，每組隨機(jī)選取3只，禁食6～8 h，次日予以1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，經(jīng)尾靜脈注氟代脫氧葡萄糖(18F-fluorodeoxyglucose，18F-FDG)150～200 uCi 30 min后，固定于PET掃描架上掃描，獲得衰減校正后小鼠18F-FDG 分布融合圖像，沿腫瘤邊緣勾畫感興趣區(qū)后通過計(jì)算機(jī)測(cè)出腫瘤最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(standardized uptake value max，SUVmax)。

1.2.3免疫組織化學(xué)檢測(cè) 小鼠處死后立即取出腫瘤組織，用4%甲醛溶液固定、石蠟包埋，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶鏈免疫組織化學(xué)法檢測(cè)VEGFR-2，所有操作嚴(yán)格按照試劑何說明書進(jìn)行。結(jié)果判定[8]：以VEGFR-2陽性所占百分比作為標(biāo)準(zhǔn)，在低倍鏡(×100)下隨機(jī)選擇5個(gè)VEGFR-2密集分布區(qū)域，再在高倍鏡(×400)下計(jì)數(shù)，棕黃色或棕褐色為陽性，淡黃色或無色為陰性。

2 結(jié) 果

2.1荷瘤小鼠一般情況 阿帕替尼組、吉西他濱組、阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組小鼠腫瘤生長(zhǎng)均受到不同程度抑制,見圖1。空白對(duì)照組、阿帕替尼組一般情況可，飲食，大便正常，未見消瘦、皮下脂肪減少，吉西他濱組、阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組出現(xiàn)一過性消瘦，皮下脂肪減少，但整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)小鼠死亡事件。

2.2小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況 空白對(duì)照組、吉西他濱組、阿帕替尼組、阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組腫瘤體積分別為(5 010±334) mm3、(3 101±217) mm3、(3 413±349) mm3、(2 063±289) mm3，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=114.393，P<0.01)，吉西他濱組、

阿帕替尼組、阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組腫瘤體積小于空白對(duì)照組(P<0.01)，阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組小于吉西他濱組和阿帕替尼組(P<0.01)，而阿帕替尼組和吉西他濱組腫瘤體積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。吉西他濱組、阿帕替尼組、阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組抑制率分別為38.1%、31.9%、58.5%。見圖1。

圖1 各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線圖

2.3PET/CT掃描結(jié)果 空白對(duì)照組、吉西他濱組、阿帕替尼組、阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組SUVmax值分別為4.08±0.26、3.53±0.19、3.33±0.22、2.28±0.18，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.914,P<0.01),吉西他濱組、阿帕替尼組、阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組SUVmax值均低于空白對(duì)照組(P<0.01)，阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組低于吉西他濱組和阿帕替尼組(P<0.01)，而阿帕替尼組與吉西他濱組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組荷瘤小鼠PET/CT圖像

2.4免疫組織化學(xué)結(jié)果 空白對(duì)照組、阿帕替尼組、吉西他濱組、阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組VEGFR-2陽性表達(dá)率平分別為(90±6)%、(61±8)%、(86±6)%、(29±7)%，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=117.293,P<0.01)，阿帕替尼組、阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組低于空白對(duì)照組和吉西他濱組(P<0.01)，阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組低于阿帕替尼組(P<0.01)，但吉西他濱組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

3a:空白對(duì)照組;3b:吉西他濱組;3c:阿帕替尼組;3d:阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組

圖3各組免疫組織化學(xué)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2陽性表達(dá)(×400)

3 討 論

長(zhǎng)期以來，肺癌的發(fā)病率居我國(guó)第1位，其中80%為非小細(xì)胞肺癌[6]，由于其惡性程度高，且大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，化療成為大部分肺癌患者的主要治療手段，然而由于化療藥物的不良反應(yīng)以及腫瘤血管的無序性阻礙了化療藥物進(jìn)入腫瘤組織等使化療的治療效果受到一定程度的限制[9-10]。

隨著Folkman“餓死腫瘤”理論的提出[1,11]，發(fā)現(xiàn)腫瘤血管形成可以為腫瘤提供營(yíng)養(yǎng)，這成為腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移的重要條件，因此抑制腫瘤血管生成即可達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。Escudier等[12]研究發(fā)現(xiàn)索拉菲尼可以延長(zhǎng)晚期腎癌患者的無進(jìn)展生存率，相關(guān)研究也表明舒尼替尼可明顯提高腫瘤患者的生活質(zhì)量[10]，由此可見抗血管生成治療在腫瘤的治療中取得了良好的療效。阿帕替尼作為我國(guó)自主研發(fā)的新型抗血管生成藥物，在晚期胃癌的治療中取得良好療效。而相關(guān)研究表明，阿帕替尼對(duì)非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌也表現(xiàn)出顯著的療效[13-16]。目前晚期非小細(xì)胞肺癌的主要治療手段包括化療及酪氨酸激酶抑制劑靶向治療，吉西他濱作為非小細(xì)胞肺癌一線用藥，為細(xì)胞周期特異性抗代謝藥物，主要作用于DNA合成期，常與鉑類藥物聯(lián)合化療，然而部分患者身體不能耐受聯(lián)合化療，因此降低了肺癌患者的療效。研究證實(shí)抗血管生成可以提高化療療效[17]，因此本研究將阿帕替尼與化療藥物吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用，初步探討其對(duì)非小細(xì)胞肺癌移植瘤的治療效果。

本研究結(jié)果顯示，阿帕替尼組腫瘤生長(zhǎng)曲線較空白對(duì)照組明顯延緩，與Wu等[18]關(guān)于阿帕替尼Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)論類似，均證實(shí)了阿帕替尼對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌治療有效。從本研究中的腫瘤生長(zhǎng)曲線中可以看出，阿帕替尼組和吉西他濱組較空白對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)得到明顯延緩，這也證實(shí)了單用阿帕替尼可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)，阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組腫瘤生長(zhǎng)抑制較單藥組更顯著，充分說明阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱治療可明顯提高抗腫瘤效應(yīng)。18F-FDG是目前臨床最常用的PET顯像劑，18F-FDG可反映腫瘤細(xì)胞糖代謝水平，通過PET/CT探測(cè)18F-FDG SUV的大小可以反映腫瘤惡性程度。SUV值越高，糖代謝水平越高，提示腫瘤的惡性程度越高，療效越差，否則反之[19-20]。本研究結(jié)果顯示，阿帕替尼組和吉西他濱組SUVmax較空白對(duì)照組明顯降低，表明在單阿帕替尼、單吉西他濱的治療下腫瘤代謝降低，單藥治療有一定抗的腫瘤效應(yīng)，而阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組中SUVmax最低，較其他各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再次證明阿帕替尼聯(lián)合化療藥物吉西他濱具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。這與Qiu等[21]的阿帕替尼聯(lián)合紫杉醇在宮頸癌移植瘤治療中產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)類似。

腫瘤血管的生成受到許多促血管生成因子的調(diào)控，其中VEGF/VEGFR成為腫瘤血管生成的關(guān)鍵因素，通過抑制VEGF/VEGFR即可抑制腫瘤生長(zhǎng)。VEGFR家族包括VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，其中VEGFR-2在血管生成中發(fā)揮重要作用。阿帕替尼對(duì)細(xì)胞內(nèi)VEGFR-2高度親和，通過抑制VEGF與VEGFR-2結(jié)合，進(jìn)而達(dá)到抑制血管生成“餓死腫瘤”的目的[22-24]。本研究結(jié)果顯示，阿帕替尼組和阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組VEGFR-2陽性表達(dá)率均低于空白對(duì)照組，且阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱組較阿帕替尼組降低更顯著(P<0.01)。由此表明，阿帕替尼通過下調(diào)VEGFR-2表達(dá)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)說明聯(lián)合用藥可產(chǎn)生聯(lián)合效應(yīng)，增強(qiáng)抗腫瘤的效果。

綜上所述，阿帕替尼聯(lián)合吉西他濱可以明顯縮小Lewis肺癌的腫瘤體積，降低SUVmax值，兩者具有協(xié)同作用，這為今后臨床治療非小細(xì)胞肺癌提供了新思路。然而，受限于研究時(shí)間、研究條件，本研究未進(jìn)一步探討其分子機(jī)制，但課題組通過查閱文獻(xiàn)推測(cè)此種協(xié)同作用可能與阿帕替尼可以使腫瘤血管正?；嘘P(guān)，因?yàn)橐延醒芯勘砻?，腫瘤血管畸形生長(zhǎng)可導(dǎo)致腫瘤組織間壓力和乏氧增加，從而降低腫瘤組織對(duì)化療藥物的敏感性[25-27]。此外，本研究樣本量較少，研究結(jié)論需更多大樣本、多中心研究進(jìn)一步論證。