黃鐘，孫潔，姚振濱，劉冬，盧獻(xiàn)靈

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 急診內(nèi)科，石河子 832000)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由多種病因引起的肺內(nèi)過度性、失控性炎癥反應(yīng)，其最初于1967年由Ashbaugh等[1]定義。ARDS 由急性肺損傷(acute lung injury，ALI)發(fā)展而來，是重癥監(jiān)護(hù)病房常見的危重病，因病死率居高不下(30%～50%)而備受關(guān)注[2]。隨著近年來對ARDS的深入研究，發(fā)現(xiàn)感染、創(chuàng)傷等引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome， SIRS)是引發(fā)ALI/ARDS的主要原因。ARDS不是單一疾病，多數(shù)由直接或間接組織損傷誘發(fā)炎癥反應(yīng)而引起，尤其是創(chuàng)傷和膿毒癥患者，疾病迅速進(jìn)展而進(jìn)入全身炎癥反應(yīng)狀態(tài)，最終導(dǎo)致ARDS的發(fā)生[3]。

研究表明，患者肺內(nèi)大面積炎癥反應(yīng)是誘發(fā)ALI/ARDS的最主要原因[4]。炎癥小體是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的多蛋白復(fù)合物，NOD樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing protein 3, NLRP3)參與組成的炎癥小體是細(xì)胞質(zhì)中的一種大分子復(fù)合蛋白，由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和Caspase-1組成，參與機(jī)體固有免疫反應(yīng)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，激活NLRP3炎癥小體的主要途徑有：(1)細(xì)胞內(nèi)鉀離子外流[7]；(2)溶酶體破壞[8]；(3)線粒體活性氧類(reactive oxygen species， ROS)生成[9]。細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，產(chǎn)生的ROS促進(jìn)與硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)相互作用的硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)與細(xì)胞中的TRX解離，并使之與NLRP3結(jié)合，從而激活NLRP3炎癥小體及其下游信號通路[10]。

TXNIP又稱維生素D3上調(diào)蛋白1(vitamin D3 upregulated protein 1， VDUP-1)/硫氧還蛋白結(jié)合蛋白2(thioredoxin-binding protein 2，TBP-2)[11]，是體內(nèi)重要的抗氧化蛋白，它通過抑制TRX介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及對抗細(xì)胞增殖等[12]。氧化應(yīng)激作為ALI/ARDS最主要的發(fā)病機(jī)制，是目前研究的熱點(diǎn)[13]，同時(shí)也是激活NLRP3炎癥小體的重要途徑。

本研究通過分析膿毒癥所致ALI/ARDS患者及健康對照者PBMC中TXNIP和NLRP3 mRNA及蛋白水平，旨在探討TXNIP/NLRP3炎癥小體通路是否在ALI/ARDS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 收集2017年1月-2018年12月于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院住院治療的40例膿毒癥導(dǎo)致ALI/ARDS患者為病例組，其中男性23例、女性17例，年齡(71.56±6.52)歲；隨機(jī)收集同期于該院進(jìn)行健康體檢的40例健康者為對照組，其中男性21例、女性19例，年齡(69.23±5.30)歲，與病例組在性別和年齡上匹配。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，血液樣本及信息的收集均獲得患者的知情同意

ALI/ARDS的診斷以歐洲危重病醫(yī)學(xué)會(huì)、美國胸科學(xué)會(huì)和美國重癥醫(yī)學(xué)會(huì)于2012年制定的《急性呼吸窘迫綜合征：柏林標(biāo)準(zhǔn)》以及中華醫(yī)學(xué)會(huì)重癥醫(yī)學(xué)分會(huì)制定的《中國嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南(2014)》[14]作為標(biāo)準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：伴其他肺部疾病，包括支氣管哮喘、活動(dòng)性肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張、肺囊性纖維化、肺膿腫、間質(zhì)性肺?。徊l(fā)冠心病、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、肝腎疾病、腫瘤及自身免疫性疾病等。

1.1.2 試劑與儀器 人外周血淋巴細(xì)胞分離液，購自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol 試劑，購自美國英杰生命技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Thermo Fisher Scientific公司；RT-PCR 試劑盒，購自凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司；TXNIP、NLRP3 及β-actinmRNA引物，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；小鼠抗人β-actin一抗、羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRG)和兔抗鼠IgG-HRG二抗， 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人TXNIP一抗，購自Abcam公司；兔抗人NLRP3一抗，購自CST公司 ；化學(xué)發(fā)光底物，購自Thermo Fisher Scientific公司。Thermo NanoDrop 2000紫外可見分光光度計(jì)，購自Thermo Fisher Scientific公司；PCR 儀，購自Thermo Hybaid公司；7500Fast RT-PCR儀，購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；高速離心機(jī)，購自Thermo Fisher Scientific公司；Western blotting電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)，購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床治療方案及預(yù)后判斷 (1)治療方案：在治療原發(fā)病的基礎(chǔ)上，采用中華醫(yī)學(xué)會(huì)重癥醫(yī)學(xué)分會(huì)制定的《中國嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南(2014)》建議方案治療?；颊呷朐汉罅⒓唇o予廣譜抗生素抗感染、胃黏膜保護(hù)以預(yù)防應(yīng)激性潰瘍、化痰平喘、營養(yǎng)支持、電解質(zhì)酸堿平衡維持和機(jī)械通氣治療，以及可能的針對原發(fā)病的治療。同時(shí)給予患者皮下注射5 000 IU低分子肝素鈉，12 h/次，共治療7 d。(2)資料收集：所有病例組患者均于初診時(shí)詢問和記錄一般資料、臨床特點(diǎn)、輔助檢查結(jié)果和序貫器官衰竭估計(jì)評分(sequential organ failure assessment， SOFA)，并于確診病情且未予治療前抽取患者外周血5 mL；治療第0天(D0)、第3天(D3)、第7天(D7)再次抽取外周血并進(jìn)行SOFA。(3)預(yù)后判斷：所有患者最終均完成7 d治療，其中10例患者于治療第10天死亡，3例患者于第14天死亡，其余患者均好轉(zhuǎn)并由重癥監(jiān)護(hù)病房轉(zhuǎn)移至普通病房繼續(xù)治療，其中14 例患者因病情需要，進(jìn)行了經(jīng)皮氣管切開術(shù)治療。

1.2.2 研究對象外周血PBMC的分離 在潔凈試管中加入6 mL Ficoll分離液，取肝素抗凝靜脈血與等量全血稀釋液充分混勻，用滴管將混懸液沿管壁緩慢滴至分層液面上。以377×g離心15 min，取上、中層界面處白色云霧層狹窄帶細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至含4～5 mL細(xì)胞洗滌液的試管中；充分混勻后，以107×g離心10～30 min，沉淀經(jīng)反復(fù)洗滌2次得到所需細(xì)胞樣本，于4 ℃冷藏備用。

1.2.3 PBMC中TXNIP和NLRP3 mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測 按TRIzol試劑操作說明書提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測并記錄總RNA的濃度與純度[D(260 nm)/D(280 nm)比值在1.8～2.0者為合格]。cDNA的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書要求進(jìn)行。根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書，取1 μL RNA提取液反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 建立20 μL反應(yīng)體系，進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min(1個(gè)循環(huán))，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s(40個(gè)循環(huán))，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。 以2-ΔΔCt表示目的mRNA與對照mRNA表達(dá)的倍數(shù)。(表1)

表1 引物序列

1.2.4 PBMC中TXNIP和NLRP3蛋白表達(dá)的Western blotting檢測 將全蛋白提取裂解液按Ficoll法收集至細(xì)胞沉淀中。通過二辛可寧酸(bicinchoninic acid， BCA)測定法測定蛋白質(zhì)濃度。將20 μg總蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。依次用抗TXNIP、NLRP3一抗在4 ℃條件下孵育PVDF膜過夜，然后按1∶5 000稀釋羊抗兔IgG-HRP(抗體稀釋液為5%脫脂牛奶)，1∶5 000稀釋兔抗鼠 IgG-HRP(抗體稀釋液為5%脫脂牛奶)，與PVDF膜共孵育1 h。使用超高靈敏度增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物顯影，曝光后使用ImageJ2x軟件分析條帶灰度。

2 結(jié)果

2.1 各組TXNIP、NLRP3mRNA與SOFA的相關(guān)性與對照組比較，病例組治療D0組、D3組和D7組SOFA評分顯著升高(P<0.05，圖1)。病例治療D0組、D3組和D7組NLRP3 mRNA表達(dá)量與SOFA呈正相關(guān)(r=0.976，P=0.004；r=0.845，P=0.005；r=0.910，P=0.032)，NLRP3 mRNA表達(dá)量與SOFA亦呈正相關(guān)(r=0.879，P=0.003；r=0.899，P=0.038；r=0.782，P=0.007)。

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 各組NLRP3及TXNIP蛋白表達(dá)水平的比較病例治療D0組、D3組和D7組NLRP3和TXNIP蛋白表達(dá)水平較對照組顯著升高(P<0.05)；病例組治療D0組較D3組和D7組NLRP3和TXNIP蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。(圖2)

注：A.NLRP3的Western blotting蛋白條帶圖； B.各組NLRP3蛋白相對表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)分析； C.TXNIP的Western blotting蛋白條帶圖； D.各組TXNIP蛋白相對表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)分析。與對照組比較，*P<0.05； 與D0組比較，#P<0.05。

2.3 各組NLRP3和TXNIPmRNA表達(dá)水平的比較以對照組mRNA表達(dá)量為1、2-△△Ct值為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各組NLRP3、TXNIPmRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，病例組治療D0時(shí)NLRP3 mRNA表達(dá)量為對照組的83.22倍，D3時(shí)降至38.02倍，D7時(shí)降低至18.18倍；病例組D0時(shí)TXNIPmRNA表達(dá)量為對照組的96.15倍，D3時(shí)降至39.40倍，D7時(shí)降至29.75倍。這說明對ARDS患者的治療以NLRP3 mRNA顯著下降為主，伴TXNIPmRNA表達(dá)顯著下降，但至治療D7后仍顯著高于對照組(圖3)。

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

眾所周知，ARDS不是單因性疾病，是由直接或間接損傷導(dǎo)致的與肺功能急劇下降相關(guān)聯(lián)的一系列呼吸道癥候群。由于ARDS及其病因的異質(zhì)性，發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年來， ARDS的鑒別診斷和治療已取得了進(jìn)展。

在已知的NLRP3炎癥小體激活途徑中氧化應(yīng)激作為ALI/ARDS重要的發(fā)生機(jī)制，是目前的研究熱點(diǎn)[15-16]。課題組前期通過文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，炎癥小體活化的經(jīng)典途徑是在PAMP提供的第一信號與損傷相關(guān)分子模式提供的第二信號相互作用下產(chǎn)生的，第一信號激活TLR4信號通路，促使NF-κB激活, 介導(dǎo)pro-IL-18、pro-IL-1β等產(chǎn)生[17]；第二信號促進(jìn)NLRP3/ASC/pro-Caspase-1蛋白復(fù)合物(炎癥小體)組裝，pro-Caspase-1自剪切為活化形式，繼而活化的Caspase-1將pro-IL-18、pro-IL-1β等剪切、活化、釋放至細(xì)胞外[18]。炎癥小體活化的非經(jīng)典途徑無需依賴TLR4信號通路，是由細(xì)胞焦亡造成的病原微生物釋放和被識別引起的。Caspase-1能夠識別細(xì)胞內(nèi)的LPS，進(jìn)而活化NLRP3炎癥小體，促進(jìn)Gasdermin D的活化與釋放，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞死亡[19]。因此，當(dāng)炎癥刺激因子誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量ROS時(shí)，會(huì)促使TXNIP 與TRX解離，解離的TXNIP 識別并結(jié)合NLRP3，通過ASC募集 pro-Caspase-1 形成 NLRP3 炎癥小體，激活 Caspase-1，促進(jìn)IL-1家族的成熟和釋放，引發(fā)炎癥級聯(lián)效應(yīng)，引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，最終引發(fā)ALI/ARDS。

TXNIP/NLRP3炎癥小體通路在許多疾病中都有所研究，如視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病[20]、高尿酸血癥[21]、帕金森病[22]和急性肝損傷[23]等。已有研究發(fā)現(xiàn), TXNIP/NLRP3炎癥小體通路參與慢性阻塞性肺疾病患者的機(jī)體炎癥反應(yīng)[24-25]，但有關(guān)其在膿毒癥導(dǎo)致的ALI/ARDS患者PBMC中的表達(dá)報(bào)道較少。因此，深入了解TXNIP/NLRP3炎癥小體通路在膿毒癥患者中的表達(dá)及治療相關(guān)作用，有助于進(jìn)一步認(rèn)識膿毒癥的形成及發(fā)展，同時(shí)可為探究抑制TXNIP的治療藥物提供參考。TXNIP VDUP-1/TBP-2起初是在1，25-二羥維生素D3治療后的HL-60白血病細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的[26]。Jin等[27]研究發(fā)現(xiàn)， TXNIP在肝損傷小鼠炎癥較重組中高表達(dá)，炎癥較輕組呈低表達(dá)，與本研究結(jié)果一致——在病例治療D0、D3、D7發(fā)現(xiàn)隨著炎癥反應(yīng)的減輕，TXNIP的蛋白和mRNA表達(dá)也隨之下降。機(jī)體通過增加PBMC中TXNIPmRNA和蛋白表達(dá)量參與急性加重期的機(jī)體炎癥反應(yīng)，給予患者有效的糖皮質(zhì)激素類藥物治療后，TXNIP在mRNA和蛋白表達(dá)水平上隨著炎癥反應(yīng)的減弱而降低。

NLRP是NLR家族蛋白中的一個(gè)重要亞家族，炎癥小體是一種存在于細(xì)胞胞質(zhì)中的多蛋白復(fù)合物，NLRP3參與組成的炎癥小體稱為NLRP3炎癥小體[7]，其在ALI/ARDS等疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[28-30]。Li等[31]通過LPS誘導(dǎo)ARDS小鼠模型的肺組織及肺巨噬細(xì)胞借助免疫熒光及Western blotting檢測到NLRP3表達(dá)的顯著增加。Shikano等[32]發(fā)現(xiàn)， 在ARDS小鼠模型骨髓分離的巨噬細(xì)胞中NLRP3 mRNA及蛋白表達(dá)量也升高。本研究發(fā)現(xiàn)， 在人外周血中NLRP3 mRNA及蛋白水平同樣升高，并且隨著治療引起的炎癥反應(yīng)減弱而表達(dá)降低。

綜上所述，本研究證明了炎癥和氧化應(yīng)激導(dǎo)致了TXNIP/NLRP3炎癥小體通路激活，該通路的異常過度表達(dá)與ALI/ARDS的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。TXNIP/NLRP3炎癥小體通路與ALI/ARDS的關(guān)聯(lián)為抑制TXNIP和NLRP3的治療藥物研制提供可能，TXNIP/NLRP3炎癥小體通路或?qū)⒊蔀橹委烝LI/ARDS的新靶點(diǎn)。