姬海南，李海山，宋乃寧，趙潺，李文濤，徐寶梁，沈國林

中國檢驗檢疫科學(xué)研究院化學(xué)品安全研究所，北京 100123

TiO2(titanium dioxide, TiO2)，俗稱“鈦白粉”，在食品工業(yè)中常作為著色劑用于口香糖、糖果、甜點和沙拉醬等食品[1-2]。相比于常規(guī)TiO2，納米TiO2具有粒徑小、白色度高，并可以提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收率，故納米TiO2已被廣泛開發(fā)應(yīng)用于食品產(chǎn)業(yè)鏈的各個環(huán)節(jié)[3-4]。體內(nèi)研究表明，納米TiO2可以通過皮膚、呼吸系統(tǒng)和消化道等途徑進入體內(nèi)，對機體產(chǎn)生毒性[5-6]。納米TiO2可以使小鼠腦組織中的膠質(zhì)細(xì)胞過度增殖同時伴有腦出血現(xiàn)象，并且腦組織出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]。納米TiO2導(dǎo)致大鼠肝臟和腎臟組織出現(xiàn)細(xì)胞凋亡以及DNA損傷[8]。目前，納米TiO2的毒性研究主要集中在環(huán)境污染物中納米TiO2的肺部吸入是否會導(dǎo)致肺部炎癥和哮喘，及從消化道攝入是否會導(dǎo)致克羅恩病和癌癥的發(fā)生[9-10]。有報道指出，兒童每天通過食品攝入體內(nèi)的納米TiO2量在美國達到2 mg·kg-1bw，而在英國可達3 mg·kg-1bw，約為成年人每日攝入量的3倍～5倍[11-12]。由于，兒童的腸道功能尚未健全，屏障功能弱，納米食品添加劑對其影響更加嚴(yán)重[13-14]。這使得納米TiO2對嬰幼兒帶來的安全隱患不斷增大，人們應(yīng)當(dāng)對納米TiO2的生物安全性予以重視。

代謝組學(xué)研究關(guān)注的是生物體系受到外在和內(nèi)在因素刺激下所導(dǎo)致的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化，可以對那些能夠揭示和描述代謝循環(huán)情況的關(guān)鍵內(nèi)源性物質(zhì)進行定性或定量的分析。血液中含有多種代謝物，能夠較為全面反映生物體的代謝狀況[15]，且血漿樣品的收集方便等特點使操作簡便易行。本研究利用代謝組學(xué)技術(shù)研究經(jīng)口攝入納米TiO2對小鼠血漿代謝譜的影響，尋找與納米TiO2相關(guān)的生物標(biāo)志物，揭示小鼠體內(nèi)可能受到影響的代謝途徑，以期為進一步闡明納米TiO2對機體的毒性作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

DV215CD型電子分析天平(德國賽多利斯公司)，MS304TS/02型電子天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司)，88 700V型-80 ℃冰箱(賽默飛世爾科技有限公司)，UltiMate 3000型超高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)，Q-Exactive型高分辨質(zhì)譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)，Waters C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)色譜柱(美國沃特世公司)，Milli-QAdvantageA10型超純水儀(美國Millipore公司)，X-30R型離心機(美國西格瑪奧德里奇公司)，乙腈、甲醇、甲酸和甲酸銨均為色譜純，購于賽默飛世爾科技有限公司，其他試劑均為分析純。

1.2 實驗動物

ICR幼年小鼠，雌性，周齡3～4周，體質(zhì)量約10 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房中，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后按體質(zhì)量隨機分為對照組和納米TiO2染毒組。該實驗經(jīng)中國檢驗檢疫科學(xué)院化學(xué)品安全研究所動物倫理委員會批準(zhǔn)，4%的異氟烷麻醉取血，二氧化碳麻醉處死，實驗前禁食24 h，自由飲水。

1.3 染毒實驗

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，設(shè)置1個空白對照組和4個染毒劑量組，每組15只，染毒劑量分別為10、30、100和300 mg·kg-1，每天灌胃染毒一次，連續(xù)染毒28 d。末次染毒后，4%的異氟烷麻醉取血，于含有肝素鈉的2 mL無菌離心管中3 500 r·min-1離心10 min，取血漿凍存于-80 ℃冰箱。二氧化碳麻醉處死，取心、肝、脾和肺等臟器稱量質(zhì)量，并計算臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/動物體質(zhì)量×100%)。

1.4 血漿樣品的高分辨質(zhì)譜檢測[16]

分析前將血漿樣品于4 ℃冰箱中解凍，取50 μL，加入沉淀劑(V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1)450 μL(含正內(nèi)標(biāo)普萘洛爾10 ng·mL-1和負(fù)內(nèi)標(biāo)甲苯磺丁脲50 ng·mL-1)，渦流30 s，渦旋混勻60 s，13 000 r·min-1離心10 min，吸取100 μL采用高分辨質(zhì)譜儀QE-Orbitrap進行檢測。色譜流動相：A為乙腈，B為水(含0.1%甲酸及2 mmoL·L-1甲酸銨)；梯度洗脫：0～1 min，5% A；1～5 min，5%～60% A；5～8 min，60%～100% A；8～11 min，100% A；11～14 min，100%～60% A；11～15 min，60%～5% A；15～18 min，5% A；柱溫30 ℃，流速0.25 mL·min-1，進樣量5 μL，進樣盤溫度4 ℃。在電噴霧離子源(ESI)正負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，噴霧電壓3 kV；蒸發(fā)溫度350 ℃；毛細(xì)管溫度320 ℃；S-lens RF為50；一級全掃描(full scan)的分辨率為70 000，掃描范圍為70～1 050 (m/z)。二級數(shù)據(jù)依賴性掃描(full MS/dd-MS2)：分辨率為17 500；AGC target為1e5；Maximun TT為50 ms；NCE為20、40和60。

1.5 小鼠血漿膽汁酸含量的檢測[17]

小鼠血漿50 μL加入含內(nèi)標(biāo)的(V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1)沉淀劑450 μL，渦旋混勻60 s，13 000 r·min-1離心10 min，吸取100 μL進行測定，膽汁酸檢測色譜條件：A為水(含0.1%甲酸)，D為乙腈；梯度洗脫，梯度洗脫程序為0～0.5 min，30% D；0.5～2.5 min，30%～60% D；2.5～4.0 min，60%～95% D；4.0～6.0 min，95% D；6.0～6.1 min，95%～30% D；6.1～8.0 min，30% D，分析時間0～8 min，每次進樣5 μL，流速為0.3 mL·min-1。色譜柱：Thermo Hypersil Gold C18 (3 μm，2.1 mm×100 mm)，色譜柱溫度為30 ℃，自動進樣器的溫度保持在4 ℃。膽汁酸檢測在電噴霧離子源(ESI)負(fù)離子SIM模式下采集數(shù)據(jù)，噴霧電壓為2 500 V；蒸發(fā)溫度為350 ℃；鞘氣為40 Arb；輔助氣為10 Arb；毛細(xì)管溫度為350 ℃；S-lens RF為50。膽酸(CA)為407.28030、脫氧膽酸(DCA)為391.28538、熊脫氧膽酸(UDCA)為391.28538和?；悄懰?TCA)為514.28440。

1.6 代謝通路分析

根據(jù)文獻方法鑒定內(nèi)源性代謝物和處理數(shù)據(jù)(圖1)[18]。利用Metaboanalyst 4.0分析對照組與納米TiO2不同染毒劑量組小鼠血漿內(nèi)源性代謝物的差異，找出VIP值>1的內(nèi)源性代謝物，繪制主成分分析(principal component analysis, PCA)、偏最小二乘判別分析(partial least squared discriminant, PLS-DA)以及拓?fù)浞治鰣D，再利用MetaboAnalyst 4.0網(wǎng)站中的Pathway Analysis分析納米TiO2影響血漿的代謝通路，選擇Impact值>0.1的代謝通路作為納米TiO2影響血漿的主要代謝通路。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Metaboanalyst 4.0進行主成分分析、偏最小二乘判別分析以及拓?fù)浞治?，同時分析Impact值>0.1的作為納米TiO2影響血漿的主要代謝通路。相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示，數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)分析各實驗組之間的差異，再用Tukey’s test比較各實驗組與對照組之間的差異，*代表P<0.05，**代表P<0.01。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 納米TiO2對ICR幼年小鼠精神狀況、飲食量及臟器系數(shù)的影響

納米TiO228 d染毒后，各個染毒劑量組的幼鼠先后出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、體質(zhì)量減輕、進食飲水減少等現(xiàn)象，由表1可知，與對照組比較，隨著劑量的增加小鼠的體質(zhì)量以及心臟、肝臟和肺臟的臟器系數(shù)呈下降趨勢，說明納米TiO228 d染毒后可以影響小鼠自身和臟器正常的生理狀態(tài)，而且影響程度隨著染毒劑量的升高而增加。

表1 納米TiO2對小鼠體質(zhì)量及臟器系數(shù)的影響(Mean±SD, n=10)Table 1 The influence of nano-TiO2 on body mass and viscera coefficient of mice (Mean±SD, n=10)

2.2 血漿總離子圖及鑒別方式

采用mzcloud對血漿內(nèi)源性代謝物質(zhì)進行鑒定，利用分子式和分子量及二級離子碎片確定內(nèi)源性物質(zhì)，同時用TraceFinder軟件進行自建內(nèi)源性物質(zhì)[19-20]，血漿樣品總離子圖及鑒別方式如圖1所示。

2.3 納米TiO2對小鼠血漿內(nèi)代謝的影響

根據(jù)文獻方法鑒定內(nèi)源性物質(zhì)和處理數(shù)據(jù)(圖1)[21]，利用Metaboanalyst 4.0中的Statistical Analysis模塊計算PCA和PLS-DA，PCA(圖2(a))和PLS-DA(圖2(b))結(jié)果顯示，對照組和納米TiO2不同劑量染毒組血漿之間都能徹底分開，模型質(zhì)量參數(shù)：Accuracy=0.91，R2=0.93，Q2=0.85，即其中93%的變量被作為建立模型的主要成分，91%的樣本符合模型的判別，而模型的預(yù)測能力為85%。這表明，幼鼠經(jīng)不同劑量染毒后，血漿部分內(nèi)源性代謝輪廓發(fā)生改變，從一定程度上說明納米TiO2能夠影響幼鼠機體的代謝輪廓。通過PLS-DA方法對各組的代謝物差異進行分析，選擇VIP值>1的內(nèi)源性物質(zhì)作為進一步分析納米TiO2影響血漿代謝通路的種類。由表2可知，血漿中內(nèi)源性代謝物VIP值>1的總共有49種，其中，31種內(nèi)源性物質(zhì)的比例主要是上升，另18種主要呈下降趨勢。由表3可知，與對照組相比，各個染毒劑量組中的?；悄懰?、膽酸、脫氧膽酸和熊脫氧膽酸均升高。以上結(jié)果表明納米TiO2影響了小鼠血漿內(nèi)源性物質(zhì)的代謝分泌，使它們的含量發(fā)生明顯變化。

表2 幼鼠血漿主要差異性標(biāo)志物的平均變化Table 2 Average changes of major plasma differential markers in young mouse

表3 不同劑量納米TiO2對血漿膽汁酸濃度的影響(Mean±SD, n=5)Table 3 The changes of bile acid concentration in plasma under the influence of different doses of nano-TiO2(Mean±SD, n=5)

圖1 全掃描檢測幼鼠血漿總離子流圖及纈氨酸鑒別模式識別注：(a)正離子模式下的色譜圖；(b)負(fù)離子模式下的色譜圖；(c)纈氨酸色譜圖；(d)纈氨酸相應(yīng)的精確質(zhì)量數(shù)和分子式。Fig. 1 Full-scan detected total ion maps and valine identification pattern recognition of young mice plasmaNote: (a) Total ion current chromatography (TIC) of plasma samples derived from the positive ion scanning; (b) Total ion current chromatography (TIC) of plasma samples derived from the negative ion scanning; (c) Valine chromatogram; (d) The exact mass and molecular formula of valine.

圖2 高分辨質(zhì)譜QE-Orbitrap檢測的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析注：(a) PCA模型分析，(b) PLS-DA分析；A為對照組，B為10 mg·kg-1納米TiO2染毒組，C為30 mg·kg-1納米TiO2染毒組，D為100 mg·kg-1納米TiO2染毒組，E為300 mg·kg-1納米TiO2染毒組。Fig. 2 Analysis of metabonomics data detected by high resolution mass spectrometry QE OrbitrapNote: (a) PCA model analysis, (b) PLS-DA analysis; A represents control group; B represents 10 mg·kg-1 nano-TiO2 group; C represents 30 mg·kg-1 nano-TiO2 group; D represents 100 mg·kg-1 nano-TiO2 group; E represents 300 mg·kg-1 nano-TiO2 group.

2.4 納米TiO2對小鼠血漿內(nèi)源性物質(zhì)代謝通路的影響

如圖3和表4所示，血漿內(nèi)源性物質(zhì)相關(guān)代謝通路受到納米TiO2影響的主要有6條，包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成(valine, leucine and isoleucine biosynthesis)、花生四烯酸代謝(arachidonic acid metabolism)、煙酸酯和煙酰胺代謝(nicotinate and nicotinamide metabolism)、組氨酸代謝(histidine metabolism)、醚脂質(zhì)代謝(ether lipid metabolism)和甘油磷脂代謝(glycerophospholipid metabolism)等，以上結(jié)果說明，納米TiO2染毒28 d后主要影響小鼠血漿中氨基酸和脂肪酸的合成和代謝，從而導(dǎo)致小鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)含量的變化。

表4 用MetPA構(gòu)建分析通路結(jié)果Table 4 Result from pathway analysis with MetPA

圖3 使用MetPA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建重要內(nèi)源性小分子相關(guān)代謝通路Fig. 3 The pathway analysis summary diagram obtained by MetPA

2.5 差異性內(nèi)源性物質(zhì)相關(guān)性和分層聚類分析

血漿中差異性內(nèi)源性物質(zhì)相關(guān)性分析結(jié)果如圖4(a)所示，圖中水平軸和垂直軸均代表變量信息，顏色越深反映相關(guān)性越強，顏色越淺反映相關(guān)性越弱，紅色表示正相關(guān)，綠色表示負(fù)相關(guān)，根據(jù)圖4(a)可知差異性內(nèi)源性物質(zhì)之間的相關(guān)性。從水平軸看，在同一小分支下的物質(zhì)的正相關(guān)性最強，即某一個物質(zhì)含量升高或者降低，則與之相關(guān)性強的物質(zhì)會隨之升高或降低。分層聚類分析獲得的熱圖如圖4(b)所示，圖中水平軸和垂直軸分別代表樣本與變量信息。顏色深淺反映變量值大小，紅色表示含量升高，綠色表示含量降低，顏色越深表明變化量越大，從圖4(b)圖中可直觀看出49種差異性內(nèi)源性物質(zhì)在各組間的含量變化趨勢。以上結(jié)果進一步證明染毒28 d后納米TiO2影響了小鼠血漿內(nèi)源性物質(zhì)含量。

圖4 應(yīng)用相關(guān)性分析與分層聚類分析法分析血漿數(shù)據(jù)Fig. 4 Plasma data were analyzed using correlation analysis and hierarchical clustering

3 討論(Discussion)

磷脂不僅是細(xì)胞膜和各種細(xì)胞器(線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核等)膜的重要組成成分，還參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的許多重要功能，如神經(jīng)傳導(dǎo)、降血脂和降低膽固醇等[22]，由代謝通路拓?fù)浞治鼋Y(jié)果可知，納米TiO2影響了小鼠機體的磷脂代謝(Impact值>0.1)。如表2所示，與甘油磷脂代謝通路相關(guān)的差異性標(biāo)志物中，不同劑量染毒引起了細(xì)胞內(nèi)膜主要組成成分磷脂酰膽堿(PCs)及其水解產(chǎn)物溶血磷脂(LysoPCs)發(fā)生異常變化，而且隨著染毒劑量的增加變化更顯著，表明小鼠全身PCs和LysoPCs的代謝發(fā)生異常，文獻報道溶血磷脂含量的升高會導(dǎo)致細(xì)胞膜流動性增強，從而影響膜脂蛋白的有序性，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，進而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[23]，這表明納米TiO2對機體的毒性作用可能與LysoPCs的升高有關(guān)。此外，細(xì)胞外膜的主要組成成分鞘磷脂(SMs)的水平在不同染毒劑量組中均呈現(xiàn)顯著升高趨勢，表明小鼠全身SMs的代謝降解可能被抑制。與對照組相比，溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPEs)的比例隨著染毒劑量的升高均明顯降低，表明納米TiO2可能抑制了全身磷脂酰乙醇胺(PEs)水解生成LysoPEs的反應(yīng)。以上結(jié)果證實了納米TiO2將影響小鼠磷脂類的代謝。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，納米TiO2染毒導(dǎo)致部分LysoPCs含量升高，溶血磷脂酰膽堿是磷脂酶A2作用于磷脂酰膽堿的產(chǎn)物，磷脂酰膽堿主要來源是食物和膽汁分泌的磷脂。文獻報道健康人每天經(jīng)膽道分泌大量的磷脂酰膽堿必須經(jīng)水解釋放，最終以溶血磷脂酰膽堿的形式被腸道吸收入血形成腸肝循環(huán)[24]，說明膽汁是磷脂類物質(zhì)主要來源之一。膽汁酸由膽固醇在肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)化而來，是膽汁的主要成分。其在體內(nèi)的合成、轉(zhuǎn)運受到多種因素的調(diào)節(jié)[25]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠暴露于納米TiO228 d后，與對照組相比，隨著染毒劑量的增加血漿中膽酸的比例呈上升趨勢(表2)，通過定量檢測發(fā)現(xiàn)血漿中膽酸、脫氧膽酸、熊去氧膽酸和?；悄懰岬暮慷汲噬仙厔?表3)，說明納米TiO2可以引起肝臟膽汁酸代謝的變化，相關(guān)研究表明膽汁酸可以作為生物標(biāo)識物用來表征肝臟毒性[26-27]，由此推斷膽汁酸(膽酸、脫氧膽酸、熊去氧膽酸和?；悄懰?可以作為納米TiO2引起小鼠肝臟毒性的生物標(biāo)志物。

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