王京，鄭磊，閆振廣，李娟英

1. 上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306 2. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012 3. 國(guó)家環(huán)境分析測(cè)試中心，北京 100029

魚類是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)維持水生態(tài)系統(tǒng)功能完整性具有重要作用。同時(shí)魚類也是水質(zhì)基準(zhǔn)推導(dǎo)中所必需的一類生物，在美國(guó)、澳大利亞和歐盟等發(fā)達(dá)國(guó)家或地區(qū)的水質(zhì)基準(zhǔn)研究中，均要求使用魚類的毒性數(shù)據(jù)以加強(qiáng)對(duì)其的保護(hù)[1-4]。相對(duì)于大部分發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，我國(guó)正處于水質(zhì)基準(zhǔn)的探索研究階段，本土物種的篩選和毒性測(cè)試是水生生物基準(zhǔn)推導(dǎo)的關(guān)鍵因素之一。

中國(guó)的淡水魚類資源中，有一半以上屬鯉科，其中在中國(guó)漁業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位的四大家魚(青魚、草魚、鰱魚和鳙魚)、鯽魚和鯉魚都是鯉科魚類[5-6]。由于其分布廣泛、易獲得且在魚類資源經(jīng)濟(jì)中具有重要地位等特點(diǎn)，對(duì)鯉科魚類進(jìn)行物種敏感性評(píng)價(jià)很有必要。

青魚屬鯉科，青魚屬，因其具有生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，在中國(guó)的淡水漁業(yè)中得到廣泛養(yǎng)殖，成為中國(guó)淡水養(yǎng)殖的“四大家魚”之一[7]。截至2018年，青魚養(yǎng)殖年產(chǎn)量已達(dá)到69.13萬(wàn)t[5]，因此在淡水魚經(jīng)濟(jì)中具有重要意義。青魚在中國(guó)分布廣泛、適應(yīng)性和繁殖能力強(qiáng)且易于培養(yǎng)[8]，開(kāi)發(fā)青魚作為中國(guó)水質(zhì)基準(zhǔn)受試生物不僅易于獲得，且其毒性數(shù)據(jù)更能反映本土水環(huán)境的特點(diǎn)。青魚一般生活于水體底層，作為典型的底棲魚類，在外表、體型和生活習(xí)性等方面均與其他魚類有差異，因此，開(kāi)發(fā)青魚作為受試生物更有利于制定適合本土的水質(zhì)基準(zhǔn)以及對(duì)水環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行全面評(píng)估。

目前污染物對(duì)青魚的毒性方面有一些研究[9-10]，但尚無(wú)對(duì)青魚物種敏感性的研究，且青魚在水質(zhì)基準(zhǔn)中的應(yīng)用研究也尚未報(bào)道。近年來(lái)，農(nóng)藥、有毒有機(jī)化學(xué)品和金屬因其對(duì)水生生物的潛在危害而備受關(guān)注[11-17]。因此本研究選用毒死蜱、苯并[a]芘、熒蒽和三價(jià)砷這4種毒性較強(qiáng)危害較大的污染物作為代表性化學(xué)物質(zhì)來(lái)評(píng)價(jià)青魚的物種敏感性。

本研究開(kāi)展了上述4種物質(zhì)對(duì)青魚的急性毒性試驗(yàn)，并搜集和篩選了文獻(xiàn)毒性數(shù)據(jù)。通過(guò)分析和比較，對(duì)青魚的物種敏感性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以期為研究水質(zhì)基準(zhǔn)受試物種的選擇提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 測(cè)試生物與化學(xué)品

青魚魚苗，體長(zhǎng)3.2～3.8 cm，體質(zhì)量0.31～0.39 g，購(gòu)自河南省平頂山天惠花鳥市場(chǎng)。馴養(yǎng)所使用的容器為經(jīng)過(guò)高錳酸鉀消毒過(guò)的化學(xué)惰性材料制成的魚缸和水槽。實(shí)驗(yàn)所使用的化學(xué)品均為分析級(jí)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為除氯自來(lái)水，經(jīng)72 h充分曝氣后使用，測(cè)定的水質(zhì)參數(shù)如下：pH 7.5±0.3，溫度(25±1) ℃，溶解氧≤空氣飽和值的60%，總硬度(以CaCO3計(jì))185 mg·L-1。

1.2 實(shí)驗(yàn)前處理

購(gòu)買后的魚苗用少量高錳酸鉀消毒，經(jīng)過(guò)3次換水使魚適應(yīng)水質(zhì)，最后將魚放入準(zhǔn)備好的容器中進(jìn)行馴化。馴化過(guò)程中，光照時(shí)間設(shè)定為12 h∶12 h(光照∶黑暗)。急性毒性試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室馴化7 d后開(kāi)始，在此期間，每2 d更換一次水，每天清理容器中的排泄物。每天在固定時(shí)間投喂少量食物，試驗(yàn)前24 h內(nèi)不投喂食物。

1.3 急性毒性試驗(yàn)

開(kāi)展了水環(huán)境代表性污染物毒死蜱、苯并[a]芘、熒蒽和三價(jià)砷對(duì)青魚的96 h急性毒性試驗(yàn)，試驗(yàn)方法參照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法[18]，有機(jī)污染物實(shí)驗(yàn)選用丙酮作為助溶劑(<0.1 mL·L-1)。所有試驗(yàn)均采用半靜態(tài)試驗(yàn)，每24 h更換一次試驗(yàn)溶液，4種污染物試驗(yàn)濃度設(shè)定值如表1所示。每種污染物試驗(yàn)均設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組，每組試驗(yàn)3個(gè)平行，每個(gè)平行放10尾魚。試驗(yàn)開(kāi)始3 h后開(kāi)始連續(xù)觀察并記錄異常行為，并于24、48、72和96 h記錄死魚情況，試驗(yàn)中及時(shí)撈出死亡個(gè)體。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照組魚死亡率不得超過(guò)10%。

表1 4種污染物的試驗(yàn)濃度設(shè)置Table 1 Exposure concentrations of the four pollutants

1.4 化學(xué)分析

檢測(cè)4種污染物試驗(yàn)的最低濃度組和最高濃度組在試驗(yàn)溶液更新前后濃度，依據(jù)OECD化學(xué)物質(zhì)測(cè)試方法指南的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[18]，4種污染物的濃度變化均<20%，滿足毒性試驗(yàn)的要求。具體檢測(cè)方法如下。

對(duì)于苯并[a]芘和熒蒽，采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器(Agilent 1200，美國(guó))進(jìn)行樣品分析[19]。色譜柱為Eclipse PAH柱(250 mm×4.6 mm，粒徑為5 μm)，柱溫為20 ℃。進(jìn)樣量為20 μL，流動(dòng)相為乙腈和水(60∶40,V/V)的混合液，流速為2.0 mL·min-1。苯并[a]芘和熒蒽的檢出限分別為0.004 μg·L-1和0.002 μg·L-1，不同濃度組平均回收率為95.0%～98.7%。

對(duì)于As2O3溶液，樣品分析采用原子熒光法(PF 6-3，北京PG儀器有限公司)[20-21]。儀器條件如下：負(fù)高壓280 V，燈電流40 mA，霧化器預(yù)熱溫度200 ℃，載氣流速400 mL·min-1，保護(hù)氣流速900 mL·min-1。三價(jià)砷的檢出限為0.3 μg·L-1，不同濃度組平均回收率為94.4%～99.3%。

毒死蜱溶液采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器(Agilent 1100，美國(guó))進(jìn)行樣品分析[22]。色譜柱為HC-18柱(150 mm×4.6 mm，粒徑為5 μm)，柱溫為25 ℃。進(jìn)樣量為20 μL，流動(dòng)相為甲醇和水(80∶20,V/V)的混合液，流速為1.0 mL·min-1。毒死蜱的檢出限為30 μg·L-1，不同濃度組平均回收率為90.0%～93.8%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用直線回歸法求得青魚96 h的半致死濃度(96 h-LC50)的95%置信區(qū)間[23]，以污染物的濃度為自變量(X)，以相應(yīng)濃度下死亡概率作為因變量(Y)，應(yīng)用分析軟件SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，建立“濃度-死亡概率”線性方程，并得出回歸方程以及相關(guān)的系數(shù)LC50、R2和95%置信區(qū)間等參數(shù)。

急性毒性數(shù)據(jù)來(lái)源于美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(US EPA)ECOTOX(http://epa.gov/ecotox/)毒性數(shù)據(jù)庫(kù)和公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)。急性毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)的篩選原則：溞或其他枝角類和搖蚊幼蟲的急性毒性試驗(yàn)終點(diǎn)選擇48 h半數(shù)致死或抑制濃度(48 h-LC50或EC50)，魚類及其他動(dòng)物的急性毒性試驗(yàn)終點(diǎn)選擇96 h-LC50或EC50[1]，單細(xì)胞動(dòng)物的急性毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)不予采用，未設(shè)立對(duì)照組、對(duì)照死亡超過(guò)10%的毒性數(shù)據(jù)棄用，同物種的急性毒性數(shù)據(jù)如果差異過(guò)大，應(yīng)被判斷為有疑點(diǎn)的數(shù)據(jù)而謹(jǐn)慎使用。

對(duì)所有獲得的急性毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和排序：首先求得各個(gè)物種的種平均急性值(SMAV)，SMAV等于同一物種的所有LC50或EC50求幾何平均值。然后根據(jù)污染物對(duì)全部物種的SMAV從小到大進(jìn)行排序并編號(hào)，以SMAV的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以每個(gè)數(shù)據(jù)的編號(hào)除以數(shù)據(jù)總數(shù)加1(即累積頻率)為縱坐標(biāo)作圖，數(shù)據(jù)處理使用Origin 2018軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 4種污染物對(duì)青魚的急性毒性

4種污染物對(duì)青魚急性毒性的試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。對(duì)4種毒物的毒性數(shù)據(jù)比較來(lái)看，苯并[a]芘對(duì)青魚的毒性最高，其次為毒死蜱。根據(jù)OECD制定的毒性標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)LC50<1 mg·L-1(第一等級(jí))、1～10 mg·L-1(第二等級(jí))、10～100 mg·L-1(第三等級(jí))[24]，結(jié)合表2中青魚的毒性數(shù)據(jù)：熒蒽<10 mg·L-1，苯并[a]芘、三價(jià)砷和毒死蜱<1 mg·L-1，可知4種污染物對(duì)青魚的急性毒性均屬中高毒級(jí)，說(shuō)明青魚可能是較為靈敏的受試生物。

表2 4種污染物對(duì)青魚的96 h-LC50值Table 2 96 h-LC50 values of four pollutants to Mylopharyngodon piceus

2.2 青魚的敏感性排序

按上述方法搜集并篩選了苯并[a]芘、毒死蜱、三價(jià)砷和熒蒽的急性毒性數(shù)據(jù)，獲得可接受的數(shù)據(jù)如下：苯并芘包括3門8科的13個(gè)物種毒性數(shù)據(jù)，其中5種魚類毒性數(shù)據(jù)；毒死蜱包括7門55科的120個(gè)物種毒性數(shù)據(jù)，其中40種魚類毒性數(shù)據(jù)；三價(jià)砷包括4門18科的24個(gè)物種毒性數(shù)據(jù)，其中15種魚類毒性數(shù)據(jù)；熒蒽包括5門25科的31個(gè)物種毒性數(shù)據(jù)，其中8種魚類毒性數(shù)據(jù)。對(duì)毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行分類排序，如表3和圖1所示。

在物種敏感性分布曲線上，物種敏感性隨累積頻率的降低而增加。前人研究發(fā)現(xiàn)[25]，生物受污染物脅迫的比例超過(guò)15%會(huì)對(duì)水生生物及群落造成一定風(fēng)險(xiǎn)，超過(guò)30%時(shí)會(huì)有明顯風(fēng)險(xiǎn)，超過(guò)50%時(shí)則會(huì)有嚴(yán)重風(fēng)險(xiǎn)[26]。按此，本研究設(shè)定物種敏感性和累積頻率的關(guān)系為：累積頻率<5%為非常敏感，5%～<15%為敏感，15%～<30%為較敏感，30%～<50%為較不敏感，≥50%為不敏感。

從圖1和表3中可知，在全部物種敏感性排序中，魚類對(duì)各類污染物的敏感程度跨度較大，一般而言其敏感性低于浮游甲殼類動(dòng)物(如大型溞等)和軟體動(dòng)物(如無(wú)褶螺等)，而高于兩棲類動(dòng)物(如澤蛙等)和昆蟲類(搖蚊幼蟲等)，在利用物種敏感性分布法推導(dǎo)苯并芘、硝基苯和三價(jià)砷水生生物水質(zhì)基準(zhǔn)時(shí)也出現(xiàn)類似的現(xiàn)象[27-29]。在魚類敏感性排序中，各科魚類排序差別也較大，一般鯉科魚類和鮭科魚類排在較為敏感的位置，而麗魚科魚類則對(duì)污染物不太敏感，造成該差異的原因可能是因?yàn)椴煌频聂~類對(duì)污染物的生物利用度差別較大。

圖1 青魚對(duì)不同污染物的敏感性排序注：*鯉科魚類；**鮭科魚類；***麗魚科魚類。Fig. 1 Sensitivity order of Mylopharyngodon piceus to different pollutantsNotes: The scientific name with “*” represents Cyprinidae; the scientific name with “**” represents Salmonidae; the scientific name with “***” represents Cichlidae.

表3 青魚對(duì)不同污染物敏感性排序Table 3 Sensitivity of Mylopharyngodon piceus to different pollutants

青魚對(duì)各類污染物敏感性具有顯著差異。雖然在毒性測(cè)試中，三價(jià)砷對(duì)青魚屬于中等毒性，但是無(wú)論是和全部測(cè)試物種還是和魚類相比，青魚對(duì)三價(jià)砷的反應(yīng)都是非常靈敏的。而相對(duì)于毒死蜱和苯并[a]芘而言，盡管這2種污染物對(duì)青魚的急性毒性為劇毒，但青魚的物種敏感性排序僅處于末端區(qū)域。究其原因，對(duì)于毒死蜱，徐瑞祥和陳亞華[30]曾報(bào)道，有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物的毒性高于脊椎動(dòng)物，尤其對(duì)甲殼類動(dòng)物毒性最大，對(duì)魚類毒性較??；而對(duì)于苯并[a]芘，可能是因?yàn)槠鋵?duì)魚類毒性研究較少且多為慢性毒性，造成數(shù)據(jù)不足所致。青魚對(duì)熒蒽的敏感性表現(xiàn)一般，Wu等[31]報(bào)道，相對(duì)于重金屬而言有機(jī)物對(duì)淡水水生生物的毒性較小，產(chǎn)生的毒性效應(yīng)主要由其代謝產(chǎn)物引起，且不如對(duì)重金屬的毒性效應(yīng)敏感。對(duì)以上4種污染物分析可得青魚具有成為三價(jià)砷的生物監(jiān)測(cè)指示生物的潛力。

青魚和斑馬魚同屬鯉科魚類，斑馬魚是毒理學(xué)研究中重要的模式生物，也是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試物種[32]。斑馬魚的毒性數(shù)據(jù)多為對(duì)處于胚胎和幼稚期的魚體進(jìn)行毒性測(cè)試得到的，而本研究選取的青魚也處于幼稚魚期，將青魚和斑馬魚的物種敏感性進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)(圖1)，整體而言青魚對(duì)污染物的敏感性優(yōu)于斑馬魚，尤其對(duì)于污染物三價(jià)砷和苯并[a]芘。三價(jià)砷和苯并[a]芘對(duì)青魚的SMAV值分別為1.98 mg·L-1和0.012 mg·L-1，對(duì)斑馬魚的SMAV值分別為18.45 mg·L-1和0.41 mg·L-1，兩者都相差了接近一個(gè)數(shù)量級(jí)。本結(jié)論是基于青魚幼稚魚的毒性測(cè)試得出的，是否具有普遍性還需要進(jìn)一步研究。另外，青魚對(duì)三價(jià)砷特別敏感，而對(duì)于其他的污染物敏感性則較弱，這也體現(xiàn)了青魚可能的特異性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明：

(1) 4種污染物對(duì)青魚的毒性均較高，青魚幼稚魚的物種敏感性整體上可能比模式生物斑馬魚要高，說(shuō)明青魚可能是較為敏感的受試生物；

(2) 青魚對(duì)本研究中4種污染物的敏感性具有顯著差異，對(duì)三價(jià)砷非常敏感，物種累積頻率為8%，對(duì)于其他污染物的敏感性則表現(xiàn)一般，因此在無(wú)機(jī)砷水質(zhì)基準(zhǔn)研究中值得關(guān)注；

(3) 魚類對(duì)本研究中4種污染物的敏感性差異較大，相對(duì)來(lái)說(shuō)，鯉科魚類和鮭科魚類較為敏感，而麗魚科魚類則不太敏感；青魚作為中國(guó)典型的鯉科底棲魚類，在水質(zhì)基準(zhǔn)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估受試生物選擇中值得關(guān)注。

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