齊澈力木格，尹曉宇，李嘉偉，董文靜，陳浩，王歡，楚文慶，楊景峰，于建華，董武

內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)毒物監(jiān)控及毒理學(xué)重點(diǎn)實驗室，通遼 028000

近年來，隨著醫(yī)藥行業(yè)的迅速發(fā)展，抗生素被更廣泛地應(yīng)用，但同時也出現(xiàn)很多安全問題?？股氐臑E用會造成抗藥性，給人類健康帶來威脅，同時也帶來了嚴(yán)重的環(huán)境問題[1]。目前，世界上生產(chǎn)的抗生素已達(dá)200多種，其中，至少有50%的抗生素用于畜牧業(yè)、養(yǎng)蜂業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[2]。在禽畜養(yǎng)殖行業(yè)中，為了控制生產(chǎn)成本，部分養(yǎng)殖戶會通過過量抗生素的使用來減少禽畜的發(fā)病率，或者在飼料中添加抗生素以提高飼料轉(zhuǎn)化率，加快畜禽生長[3]。四環(huán)素類抗生素(tetracyclines, TCs)是一類廣譜抗菌藥物，主要包括金霉素(chlorotetracycline, CTC)、土霉素(oxytetracycline, OTC)、四環(huán)素和強(qiáng)力霉素。由于TC的大量使用，人們在農(nóng)場廢水中檢測到TC的殘留[4-5]，其中，金霉素高達(dá)3.99～107.14 mg·L-1、四環(huán)素也達(dá)到0.13～1.78 mg·L-1[6-7]?？股夭⒉煌耆粍游镂眨^85%以原始狀態(tài)直接排放到環(huán)境中或作為代謝物形式隨糞便排入環(huán)境中[8]。由于長期使用和持續(xù)排放到環(huán)境中，造成動物腸道菌群的變化，影響體重[9]?？股卦诃h(huán)境中的遷移推動了抗性基因的傳播[10]，這對人類的健康和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定構(gòu)成了潛在的風(fēng)險[11-12]。

四環(huán)素類抗生素除了抗菌作用外，還被報道可阻止骨吸收。例如，強(qiáng)力霉素和二甲胺四環(huán)素已被證明通過阻斷基質(zhì)金屬蛋白酶-9(mmp-9)活性來抑制破骨細(xì)胞形成[13]。四環(huán)素類抗生素及其衍生物對破骨細(xì)胞形成抑制作用機(jī)制尚不完全清楚[14]。四環(huán)素類似物，特別是替加環(huán)素通過阻斷mmp-9介導(dǎo)的組蛋白H3來抑制破骨細(xì)胞的形成，并提示mmp-9的抑制可能為糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的策略[15-16]。這對人和動物的正常骨發(fā)育勢必造成不良影響。

軟骨發(fā)育是骨骼形成過程中最早的發(fā)育形態(tài)[17-18]。在胚胎發(fā)育過程中，間充質(zhì)細(xì)胞分化產(chǎn)生骨軟骨前體和軟骨細(xì)胞。無論是硬骨魚還是哺乳動物，軟骨細(xì)胞的成熟都伴隨著軟骨細(xì)胞形態(tài)、生物合成活性和能量代謝的重大變化[19]。隨著軟骨的成熟，軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大，導(dǎo)致細(xì)胞直徑和體積增大[17]。runx是決定成骨細(xì)胞和早期分化的轉(zhuǎn)錄因子[20]。當(dāng)runx2某些功能喪失后，軟骨的內(nèi)骨化進(jìn)程會被推遲[21]。骨骼發(fā)育中sox9家族基因是成骨細(xì)胞/軟骨細(xì)胞關(guān)聯(lián)基因，其表達(dá)被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因小鼠中軟骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物[22]。在軟骨早期發(fā)育中sox9a的表達(dá)被促進(jìn)，而軟骨發(fā)育后期sox9a的表達(dá)被抑制。sox9a則主要參與早期軟骨細(xì)胞的增殖分化進(jìn)程[23-24]。sox9a還作為col2α1的調(diào)控因子，具有至關(guān)重要的作用[25-26]。目前，在小鼠、兔子和狗等動物上有一些關(guān)于氟喹諾酮類抗生素(fluoroquinolones antibiotics, FQs)軟骨毒性的報道，但在魚上還沒有關(guān)于軟骨毒性的研究，更沒有關(guān)于其遺傳毒性的報道[27]。斑馬魚是研究骨骼軟骨和脊索形成的極好的遺傳模型[28-31]。斑馬魚因其具有發(fā)育迅速、胚胎透明、便于操作和觀察、對藥物極其敏感，及可利用資源極其豐富等諸多的優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用。

本研究使用斑馬魚為動物模型，通過母體的鹽酸四環(huán)素暴露實驗，觀察四環(huán)素對F1代斑馬魚胚胎軟骨發(fā)育的影響并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗試劑

鹽酸四環(huán)素(tetracycline hydrochloride, TCH)購于北京索萊寶科技有限公司，CAS號為64-75-5，分子式為C22H24N2O8·HCl，分子量為480.90，純度為≥98%標(biāo)準(zhǔn)品；總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購自美國Sigma公司。

1.2 斑馬魚F0親代處理

斑馬魚(Daniorerio) (AB系)，飼養(yǎng)于斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生科技發(fā)展公司)中，保持飼養(yǎng)水溫(28±1) ℃，并在自然環(huán)境下保持光照∶黑暗時間為14 h∶10 h。從繁育群體中挑出數(shù)量、條件一致的雌雄成年斑馬魚(4個月)，將雄性和雌性分離并觀察1周，通過確認(rèn)可存活的胚胎來確定個體的生殖狀態(tài)。將選定的魚轉(zhuǎn)移到實驗缸，F(xiàn)0親代斑馬魚經(jīng)TCH處理30 d，最終確定為4組，分別為空白對照組、0.1 μg·L-1(低濃度組)、1 μg·L-1(中濃度組)和100 μg·L-1(高濃度組)。5～7 d換水換藥，每天喂食2次魚飼料和豐年蟲。在實驗前一天傍晚，隨機(jī)選取1∶1雌雄魚放在同一斑馬魚專用孵化缸中混養(yǎng)過夜，次日見光產(chǎn)卵。

1.3 斑馬魚F1代胚胎處理

斑馬魚F0親代經(jīng)TCH處理30 d后合缸，實施繁育實驗。受精后1.5 hpf進(jìn)行產(chǎn)卵數(shù)及受精卵數(shù)統(tǒng)計，并將F1代斑馬魚胚胎移入28 ℃ Heratherm IGS180恒溫孵化箱(Thermo Fisher Scientific，美國)中培養(yǎng)。分別于受精后8、24、48、72、96和120 hpf取樣并觀察，記錄胚胎均勻性、孵化率、死亡率和畸形率等形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)(每組進(jìn)行3次以上的平行及重復(fù)實驗)。

1.4 胚胎及幼魚形態(tài)學(xué)評估

形態(tài)學(xué)評估采用Brannen等[32]改進(jìn)的量表對斑馬魚幼魚的身體形態(tài)進(jìn)行評分。分別觀察8、24、48、72、96和120 hpf的F1代胚胎的形態(tài)變化。每組10粒卵，分為正常、輕度、中度和嚴(yán)重異常4組。進(jìn)一步分析對胚胎各個器官發(fā)育的影響。評分結(jié)構(gòu)包括卵黃囊、心囊、心臟血池和脊索彎曲程度等。形態(tài)學(xué)評估分?jǐn)?shù)在幼魚形態(tài)結(jié)構(gòu)的正常發(fā)育情況下為4分，輕度畸形為3分，中度畸形為2分，重度畸形為1分，評分時器官缺失為0分，未發(fā)現(xiàn)異常的正常發(fā)育幼魚最高得分為16分。評分時若幼魚死亡得分為0，最后進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5 阿爾新藍(lán)軟骨染色方法及測量方法

取受精后72、96和120 hpf的幼魚10條，用4%的中性緩沖多聚甲醛(PFA)于4 ℃下固定并過夜，樣本用1×磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗2次，在0.1%阿爾新藍(lán)染液(阿利新藍(lán)8GX∶80%乙醇∶20%乙酸)室溫染色12 h以上，用體積分?jǐn)?shù)為95%、90%、80%、70%、50%和20%的酒精脫水各30 min，用蒸餾水清洗30 min，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氫氧化鉀和體積分?jǐn)?shù)為30%的雙氧水混合后處理1 h，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的胰酶處理1 h，并實時觀察，在70%的甘油中觀察及保存。然后用ImageJ對幼魚頭部下頜骨長度(A)、角舌骨長度(B)、下頜骨寬度(C)和下頜弓長度(D)進(jìn)行軟骨長度測量(圖1)。

圖1 斑馬魚胚胎頭部軟骨染色長度測量示意圖注：A下頜骨長度；B角舌骨長度；C下頜骨寬度；D下頜弓長度。Fig. 1 Schematic diagram of measuring the length of cartilage staining on the head of zebrafish embryoNote: A indicates mandibular length; B indicates angular hyoid length; C indicates mandibular width; D indicates mandibular arch length.

1.6 總RNA的提取及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

使用Trizol試劑處理完整的胚胎，從整體斑馬魚胚胎中提取總RNA(Grand Island公司；12183-555)。使用Nano Drop2000c(Thermo Fisher Scientific，美國)測定提取的總RNA濃度。純化的總RNA使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems Inc.)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)方法按照廠家說明書進(jìn)行，cDNA樣本使用前保存在-20 ℃條件下。使用TaqMan進(jìn)行基因表達(dá)測定和基因表達(dá)分析(Applied Biosystems Inc.)。反轉(zhuǎn)錄加入0.2 ng cDNA后進(jìn)行反應(yīng)與TaqMan Universal PCR Master Mix混合，并使用7900HT實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)進(jìn)行PCR檢測，采用Sequence Detection System 2.0軟件分析，實驗方法與步驟基本與Dong等[33]描述的相同。內(nèi)參基因為β-Actin，采用2-ΔΔCT方法計算基因表達(dá)的相對變化(表1)。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR primers

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均以平均值±SEM表示，使用GraphPad Prism software進(jìn)行統(tǒng)計分析。差異顯著性使用單因素方差分析。P<0.05的情況下被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)上的差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 TCH對F1代胚胎的影響

2.1.1 TCH對F1代斑馬魚胚胎均勻性的影響

斑馬魚F0親代經(jīng)TCH處理30 d后，引起F1代胚胎外胚層前緣和組織的均勻性出現(xiàn)不均勻現(xiàn)象，發(fā)育至8 hpf時觀察并統(tǒng)計分析。F1代斑馬魚的胚胎均勻性隨著TCH濃度的升高而下降(圖2)。胚胎均勻性比例在濃度為1 μg·L-1時與空白對照組相比降低至58.62%(P<0.01)。100 μg·L-1濃度組與空白對照組相比降低至48.27%(P<0.001)。

圖2 鹽酸四環(huán)素(TCH)對F1代斑馬魚胚胎均勻性的影響注：TCH引起F1代斑馬魚胚胎外胚層前緣和組織出現(xiàn)不均勻性；受精卵發(fā)育到8 hpf時進(jìn)行鏡下觀察，(a) 空白對照組，(b) 0.1 μg·L-1濃度組，(c) 1 μg·L-1濃度組，(d) 100 μg·L-1濃度組；星號表示暴露組與對照組之間的顯著差異(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)；數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM；標(biāo)尺=1 mm。Fig. 2 Effect of tetracycline hydrochloride (TCH) on the uniformity of F1 generation zebrafish embryosNote: TCH causes heterogeneity in the front edge and tissue uniformity of ectoderm in F1 zebrafish embryos; the fertilized egg was observed under the microscope when it reached 8 hpf; (a) blank control group; (b) 0.1 μg·L-1 concentration groups; (c) 1 μg·L-1 concentration groups; (d) 100 μg·L-1 concentration groups; the asterisk indicates the significant difference between the exposed group and the control group (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001); data are expressed as mean±SEM; bar =1 mm.

2.1.2 TCH對F1代斑馬魚幼魚發(fā)育影響

TCH處理F0親代斑馬魚30 d后，其F1代幼魚出現(xiàn)各種形態(tài)發(fā)育異常，主要包括脊柱彎曲、頭部變形、卵黃浮腫、心囊浮腫、尾部彎曲，或缺失等 (圖3) 。F1代斑馬魚胚胎卵黃浮腫率、心囊浮腫率、卵黃浮腫面積和心囊浮腫面積隨著TCH濃度的升高而增加(P<0.05)。在48 hpf時，卵黃浮腫率在100 μg·L-1濃度組比空白對照組上升了23.33%(P<0.001)，卵黃浮腫面積與空白對照相比增加了3.47倍(P<0.01)。心囊浮腫率在100 μg·L-1濃度組比空白對照組上升了33.33%(P<0.01)，心囊浮腫面積比空白對照組相比增加了11.76倍(P<0.01)。

圖3 TCH引起F1代斑馬魚幼魚卵黃和心囊浮腫注：TCH處理親代F0斑馬魚30 d后，實施交配獲得F1代，并觀察其形態(tài)發(fā)育異常；bs為脊柱彎曲；ehc為心囊水腫；yse為卵黃囊水腫；sbl為體長縮短；bt為尾部彎曲；星號表示暴露組與對照組之間的顯著差異(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)；數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM；標(biāo)尺=1 mm。Fig. 3 TCH causes yolk and pericardial edema in F1 generation zebrafish larvaeNote: The parent zebrafish (F0) is treated with TCH for 30 d, then mated to obtain F1 generation and the morphological abnormalities in the F1 generation juveniles were observed; after 30 d of parental zebrafish treatment with TCH, bs represents spinal curvature; ehc represents cardiac capsule edema; yse represents yolk sac edema; sbl represents shortened body length; bt represents the tail bends; the asterisk indicates the significant difference between the exposed group and the control group (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001); data are expressed as mean ±SEM; bar=1 mm.

2.1.3 TCH對F1代的形態(tài)學(xué)評估

TCH處理親代F0斑馬魚30 d后，F(xiàn)1代斑馬魚胚胎畸形率隨著濃度的升高而增加，中濃度組(1 μg·L-1)相比空白對照組畸形率上升了13.33%(P<0.05)，高濃度組(100 μg·L-1)與空白對照組相比畸形率上升了26.67%(P<0.001)(圖4(a))。對其形態(tài)學(xué)進(jìn)行評估發(fā)現(xiàn)，中濃度組(1 μg·L-1)下降至對照組的70.81%(P<0.05)，高濃度組(100 μg·L-1)下降至對照組的50%(P<0.001)(圖4(b))。

圖4 TCH對F1代斑馬魚胚胎發(fā)育的影響注：TCH處理親代F0斑馬魚30 d后交配獲得F1代，并實施形態(tài)學(xué)觀察到120 hpf；(a)胚胎畸形率，(b)形態(tài)學(xué)評估；星號表示暴露組與對照組之間的顯著差異(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)；數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。Fig. 4 Effects of TCH on embryo development of F1 generation of zebrafishNote: The parent zebrafish were treated with TCH for 30 d, then mated to obtain F1 generation, and the morphology was observed until 120 hpf; (a) embryo deformity rate, (b) morphological evaluation; the asterisk indicates the significant difference between the exposed group and the control group (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001); data are expressed as mean±SEM.

2.2 TCH對F1代幼魚頭部軟骨的影響

為檢測TCH對斑馬魚F1代胚胎骨骼的影響，經(jīng)阿爾新藍(lán)軟骨染色，觀察到頭面軟骨的變形(圖5)。頭部軟骨的下頜骨長度隨著TCH濃度的升高而變長，胚胎發(fā)育至72、96和120 hpf時，隨著TCH濃度升高有變長趨勢，但無顯著差異 (P>0.05) (圖6(a))。角舌骨長度隨著TCH濃度的升高而縮短。在96 hpf時100 μg·L-1濃度組縮短至對照組的87.56%(P<0.05)，在72 hpf和120 hpf時雖與對照組相比沒有顯著差異性，但有明顯的縮短趨勢(圖6(b))。下頜骨寬度隨著TCH濃度的升高而縮短，在72 hpf時高濃度組(100 μg·L-1)縮短至對照組的76.91% (P<0.05)，胚胎發(fā)育至96 hpf和120 hpf時雖與對照組相比沒有顯著差異性，但有縮短趨勢 (P>0.05) (圖6(c))。下頜弓長度隨著TCH濃度的升高而變長，胚胎發(fā)育到72、96和120 hpf時下頜弓長度雖與對照組相比沒有顯著差異，但整體有明顯變長趨勢 (P>0.05) (圖6(d))。

圖5 TCH對斑馬魚F1代幼魚軟骨的影響注：F0親代斑馬魚在TCH暴露30 d后，收集F1代胚胎，發(fā)育至72、96和120 hpf時分別進(jìn)行阿爾新藍(lán)軟骨染色，并在鏡下觀察；標(biāo)尺=100 μm。Fig. 5 Effects of TCH on F1 lava cartilage of zebrafishNote: F0 parental zebrafish were treated with TCH for 30 d, and F1 generation embryos were collected; when F1 developed to 72, 96 and 120 hpf, they were stained with Alcian blue and observed under the microscope; bar =100 μm.

圖6 TCH對F1代斑馬魚幼魚頭部軟骨的影響注：胚胎發(fā)育至72、96和120 hpf時進(jìn)行阿爾新藍(lán)軟骨染色，并鏡下觀察；用ImageJ對幼魚顱部軟骨測量；(a)下頜骨長度，(b)角舌骨長度，(c)下頜骨寬度，(d)下頜弓長度；星號表示暴露組與對照組之間的顯著差異(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)；數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。Fig. 6 Effects of TCH on the head cartilage of F1 zebrafish larvaeNote: Alcian blue cartilage staining are carried out when the embryo developed to 72, 96 and 120 hpf, and the samples were observed by microscopy; the cranial cartilage of juvenile fish was measured by ImageJ; (a) mandibular length, (b) angular hyoid length, (c) mandibular width, (d) mandibular arch length; the asterisk indicates the significant difference between the exposed group and the control group (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001); data are expressed as mean±SEM.

2.3 TCH對F1代骨骼相關(guān)基因表達(dá)的影響

為探究軟骨畸形出現(xiàn)的機(jī)制，對相關(guān)軟骨關(guān)聯(lián)基因，如runx1、sox9a、sox10和col2α1a進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，runx1基因的表達(dá)在72 hpf時，高濃度組(100 μg·L-1)降低至對照組的61.76%(P<0.05)。高濃度組與空白對照組相比，基因表達(dá)量有降低趨勢(圖7(a)～圖7(d))。72 hpf和96 hpf時，sox9a基因在100 μg·L-1濃度組分別降低至對照組的84.99%和69.07% (P<0.05)。48 hpf時，sox10基因在中濃度組 (1 μg·L-1)降低至空白對照組的77.45% (P<0.05)，高濃度組 (100 μg·L-1)降低至對照組的67.03% (P<0.01)，在120 hpf時，1 μg·L-1和100 μg·L-1濃度組分別降低至對照組的76.45%和73.70%(P<0.05)。72 hpf時，col2α1a基因在中濃度組(1 μg·L-1)降低至對照組的40.65% (P<0.05)；高濃度組(100 μg·L-1)下降至對照組的39.52% (P<0.01)；胚胎發(fā)育至120 hpf時，中濃度組(1 μg·L-1) 降低至對照組的79.78% (P<0.05)；高濃度組(100 μg·L-1)下降至對照組的72.69%(P<0.01)。

圖7 TCH對F1代斑馬魚胚胎骨骼發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響注：當(dāng)胚胎發(fā)育到48、72、96和120 hpf，使用RT-PCR檢測runx1、sox9a、sox10和col2α1a mRNA表達(dá)；每組包含10個胚胎，每組3個重復(fù)；星號表示暴露組與對照組之間的顯著差異(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)；數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。Fig. 7 Effect of TCH on the gene expression of skeletal development in F1 zebrafish larvaeNote: mRNA expressions of runx1, sox9a, sox10 and col2α1a were detected by RT-PCR when the embryo developed to 48, 72, 96 and 120 hpf, respectively; each group contained 10 embryos, each with three replicates; the asterisk indicates the significant difference between the exposed group and the control group (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001); data are expressed as mean±SEM.

3 討論(Discussion)

研究結(jié)果表明，當(dāng)成年斑馬魚分別經(jīng)不同濃度TCH暴露30 d后，F(xiàn)1代的胚胎均勻性隨著濃度的升高而下降。其孵化率隨著TCH濃度的升高而降低，存活率隨濃度升高而下降。親代斑馬魚TCH暴露30 d后，F(xiàn)1代斑馬魚幼魚在各個TCH暴露組都出現(xiàn)不同程度畸形，如心囊水腫、卵黃囊水腫和脊索彎曲等。統(tǒng)計分析表明，F(xiàn)1代斑馬魚幼魚經(jīng)TCH暴露后，總畸形率都顯著增高。經(jīng)軟骨染色發(fā)現(xiàn)，TCH造成F1代斑馬魚幼魚下頜骨長度、下頜弓長度、下頜骨寬度和下頜角骨長度的變化，并隨著TCH濃度升高而出現(xiàn)不同程度的變長或縮短現(xiàn)象。這可能與TCH能夠顯著抑制斑馬魚F1代胚胎骨骼相關(guān)基因有關(guān)。

孵化是斑馬魚胚胎發(fā)育的關(guān)鍵時期。延遲孵化可能是由于斑馬魚胚胎發(fā)育遲緩或胚胎無法打破絨毛膜而造成[34]。四環(huán)素能夠影響斑馬魚的胚胎死亡率，且濃度越高死亡率越高[35]，卵黃囊是胚胎唯一的營養(yǎng)來源，在胚胎發(fā)育早期起著重要的作用。隨著胚胎的發(fā)育，卵黃囊的體積逐漸縮小[36]。本實驗結(jié)果顯示，TCH處理F0親代斑馬魚30 d后，其F1代胚胎孵化率降低，死亡率升高，幼魚卵黃吸收緩慢，心囊浮腫嚴(yán)重，畸形率顯著上升，最終影響斑馬魚胚胎發(fā)育進(jìn)程。這與本實驗結(jié)果一致，表明斑馬魚F0親代經(jīng)TCH處理后，對F1代胚胎發(fā)育存在顯著性影響。

頭部軟骨長度指示著軟骨發(fā)育的程度。FQs類抗生素會在幼犬中引起軟骨損傷，尤其是在負(fù)重滑膜關(guān)節(jié)軟骨中[37]。另外，Goto等[38]給幼年大鼠短期飼喂氧氟沙星，會增加關(guān)節(jié)軟骨中氧氟沙星的最大濃度值。實驗研究發(fā)現(xiàn)，TCH造成F1代幼魚下頜骨寬度和角舌骨長度與對空白照組相比均縮短，且下頜骨變長，夾角變小，兩側(cè)有縮短的趨勢，可能是TCH處理后斑馬魚頭部的部分軟骨發(fā)育受到抑制作用，軟骨發(fā)育減緩，才導(dǎo)致軟骨長度縮短。和親本經(jīng)TCH暴露而影響F1代軟骨發(fā)育相比，F(xiàn)0代胚胎經(jīng)TCH暴露的實驗表明，除了高濃度(100 μg·L-1) 造成嚴(yán)重的骨骼發(fā)育延遲和畸形外，低濃度(1 μg·L-1) TCH沒有造成軟骨發(fā)育的顯著變化。

有研究表明，sox9a可以參與軟骨細(xì)胞分化，而當(dāng)軟骨發(fā)育到一定時間，sox9a會受到明顯抑制作用[39-40]。col2α1是編碼膠原蛋白Ⅱ的基因，col2α1a基因在很多器官組織中都有表達(dá)，例如大腦、眼睛和心臟等，但它表達(dá)量最高的地方是在軟骨[41-42]。col2α1a基因在組成細(xì)胞外骨架中具有重要作用，col2α1a基因的缺失會導(dǎo)致骨骼發(fā)育不良，在小鼠中表現(xiàn)為骨骼發(fā)育畸形，在人的癥狀上表現(xiàn)為內(nèi)骨骼畸形、骨骼變短和缺失腦骺生長板等軟骨成長不全癥[43-44]。本實驗研究結(jié)果表明，TCH處理后的斑馬魚F1代胚胎對骨骼相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也有影響。由此初步認(rèn)為由于軟骨組織的產(chǎn)生增加或減少，runx1、sox9a、sox10和col2α1amRNA表達(dá)水平升高或下降可能是斑馬魚下頜骨、下頜弓長度加長，角舌骨、下頜骨寬度縮短及脊索和尾部彎曲的原因，但還需進(jìn)一步研究確認(rèn)。

綜上所述，F(xiàn)0親代斑馬魚經(jīng)TCH處理30 d后，對F1代胚胎發(fā)育產(chǎn)生顯著的影響。TCH造成F1代胚胎孵化周期延長，孵化率和死亡率升高。TCH對F1幼魚軟骨的發(fā)育造成顯著影響，畸形率升高，且骨骼發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著下降。提示環(huán)境中TCH對下一代軟骨發(fā)育有毒性影響，建議加強(qiáng)四環(huán)素類抗生素飼料添加的監(jiān)管。

◆