王曉麗，張運(yùn)超，夏滬彬，陳超，劉勇弟, *

1. 華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，上海200237 2. 華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海200237

四溴雙酚A(TBBPA)是目前產(chǎn)量最大的溴系阻燃劑，由于其良好的阻燃、耐熱性能等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生活的各個(gè)方面，如家用電器、家具、塑料和電子產(chǎn)品等。TBBPA可阻止或降低燃燒的速度，同時(shí)也可以防止添加的材料燃燒[1]。TBBPA可分為添加型和反應(yīng)型2種類型，其中，添加型未形成新的化學(xué)鍵，易釋放至環(huán)境中；反應(yīng)型通過化學(xué)反應(yīng)加入阻燃成分，以形成化學(xué)鍵的形式與材料結(jié)合，這種結(jié)合方式相對(duì)穩(wěn)定，但是其中未聚合的TBBPA也會(huì)釋放到環(huán)境中。在含有TBBPA的產(chǎn)品生產(chǎn)、使用及產(chǎn)品廢棄之后堆放、填埋或者焚燒等處理過程中，TBBPA通過揮發(fā)、滲透等途徑進(jìn)入環(huán)境。TBBPA進(jìn)入環(huán)境后，在不同介質(zhì)之間進(jìn)行遷移轉(zhuǎn)化。在大氣、土壤、水體沉積物及生物體中已被檢出。土壤中TBBPA的污染狀況已有報(bào)道。Yu和Hu[2]在垃圾填埋場附近的土壤中測得TBBPA濃度為1.4～1.8 μg·g-1(干重)。彭浩等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在電子廠周圍的土壤樣本中TBBPA的濃度為(25.2±2.7) ng·g-1。?berg等[4]在22處用市政廢水澆灌的土壤中取116個(gè)污泥樣品，測定出TBBPA的含量在220 ng·g-1范圍內(nèi)；清遠(yuǎn)的電子廢物回收站點(diǎn)土壤中TBBPA污染水平極高，其濃度高達(dá)780 ng·g-1。電子廢物回收站點(diǎn)的TBBPA濃度明顯高于農(nóng)田土壤，但與某些工業(yè)區(qū)土壤的污染水平相當(dāng)，表明電子廢物回收和工業(yè)場所是這些地區(qū)TBBPA的主要來源[5]。水環(huán)境中TBBPA的污染狀況也有很多報(bào)道，Watanabe等[6]1983年在日本的Neya河的淤泥中檢出了TBBPA，其含量為1.8～20 ng·g-1(干重)。Chu等[7]測定了加拿大的廢水處理廠樣本中TBBPA含量，其范圍為2.1～28.3 ng·g-1(干重)；Saint-Louis和Pelletier[8]測定了加拿大Saint Lawrence河底泥中TBBPA含量，為300 ng·g-1(干重)。在中國，除了黃河和巢湖外，其余水體中檢測到的TBBPA濃度普遍<10 ng·L-1；黃河和巢湖水系TBBPA濃度較高，安徽省巢湖水樣中TBBPA含量最高，遠(yuǎn)高于環(huán)境水域的全球水平[9]。大氣中的TBBPA主要來源于電子產(chǎn)品的生產(chǎn)及回收。Takigami等[10]測定了在日本北海道采集的2個(gè)室內(nèi)灰塵樣本，其中，TBBPA含量分別為49 ng·g-1和52 ng·g-1，室內(nèi)空氣中的TBBPA分別為12～20 pg·m-3和8～10 pg·m-3，室外空氣中分別為9.5 pg·m-3和7.1 pg·m-3。在中國貴嶼的一個(gè)電子廢物回收站點(diǎn)檢測到的TBBPA的濃度平均值為82 850 pg·m-3[5]。Yu和Hu[2]測定了從中國一個(gè)辦公室的計(jì)算機(jī)房內(nèi)采集到的4個(gè)灰塵樣品，其TBBPA含量為18.9～39.6 μg·g-1。TBBPA會(huì)對(duì)生物體造成危害。Herzke等[11]采集分析了挪威6種食肉性鳥類的鳥蛋中溴代阻燃劑的濃度水平，8個(gè)樣品中都檢出TBBPA且含量約為13 pg·g-1(濕重)；Law等[12]測定了英國海域的68個(gè)海豚脂肪樣品，其中，18個(gè)樣品中檢出的TBBPA濃度為6～35 ng·g-1(濕重)。最近人體內(nèi)TBBPA含量的報(bào)道主要集中在母乳和血液樣本。Shi等[13]調(diào)查了中國24組母乳樣品和食物樣品，其中，肉、蛋和水產(chǎn)品中TBBPA的平均含量分別為263、194和738 pg·g-1(脂重)，母乳中TBBPA的含量為5 124 pg·g-1(脂重)，嬰兒通過母乳每日TBBPA的攝入量為320～37 240 pg·kg-1，平均為5 094 pg·kg-1(體重)，成人日攝入TBBPA的平均值為256 pg·kg-1(體重)，肉類產(chǎn)品是人類攝入TBBPA的主要來源。

TBBPA可通過皮膚接觸、呼吸和進(jìn)食等途徑進(jìn)入生物和人體內(nèi)，TBBPA對(duì)生物體有很強(qiáng)的毒性效應(yīng)，目前研究的重點(diǎn)是內(nèi)分泌干擾性、神經(jīng)毒性和生殖發(fā)育毒性等。研究表明，TBBPA在中國倉鼠卵巢細(xì)胞和蝌蚪變態(tài)過程中表現(xiàn)出抗甲狀腺激素活性[14]。神經(jīng)行為學(xué)研究表明，TBBPA急性暴露3 h會(huì)增加小鼠的運(yùn)動(dòng)行為，0.1 mg·kg-1和5 mg·kg-1劑量的處理組中小鼠相比對(duì)照組有更強(qiáng)的恐懼行為表現(xiàn)[15]。研究表明，當(dāng)TBBPA濃度<1.5 μmol·L-1時(shí)，會(huì)使斑馬魚早熟，產(chǎn)卵率、孵化率和仔魚成活率下降[16]。但是TBBPA對(duì)人體肝臟毒性的研究尚且不足，對(duì)TBBPA的人體肝毒性報(bào)道相當(dāng)有限，未對(duì)其凋亡機(jī)制進(jìn)行具體研究。另外，肝臟是人體主要的代謝和解毒器官，可以促進(jìn)多種酶的合成進(jìn)而對(duì)進(jìn)入體內(nèi)的外源毒性物質(zhì)進(jìn)行清除。探究TBBPA的肝毒性對(duì)于評(píng)價(jià)其對(duì)人體健康的毒性效應(yīng)具有十分重要的意義。

在本研究中，用L02細(xì)胞作為受體模型來研究TBBPA的肝細(xì)胞毒性，并探討細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量變化、細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡的變化，闡明TBBPA對(duì)L02細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用及相關(guān)機(jī)制。進(jìn)一步拓寬了TBBPA毒性研究的領(lǐng)域，并為相關(guān)的環(huán)境管理提供毒理學(xué)參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 L02細(xì)胞來源

人體肝細(xì)胞HL-7702(L02)細(xì)胞系購自中國科學(xué)院的細(xì)胞庫類型培養(yǎng)物保藏中心(上海，中國)。

1.2 L02細(xì)胞實(shí)驗(yàn)預(yù)處理

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，培養(yǎng)瓶中貼壁細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，用磷酸緩沖溶液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，消化后加入DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，依次接種于滅菌后的6孔板中，每孔加入2 mL，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)15 h。棄上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入含有5、10、20和40 μmol·L-1TBBPA的培養(yǎng)基用于脅迫實(shí)驗(yàn)，溶劑對(duì)照組為含0.1%二甲基亞砜(DMSO)的完全培養(yǎng)基，每組濃度設(shè)3個(gè)平行。在37 ℃、5% CO2下孵育48 h后，用移液槍吸出培養(yǎng)基，用PBS緩慢洗滌細(xì)胞2次。

1.3 L02細(xì)胞形態(tài)變化

細(xì)胞預(yù)處理同1.2部分，立即在倒置顯微鏡(IX71-F22RC，OLYMPUS，日本)(200×)下觀察，并拍照。

1.4 L02細(xì)胞活力檢測

脅迫細(xì)胞預(yù)處理同1.2部分，加入2.5、5、10、20、40、80、100和200 μmol·L-1的TBBPA進(jìn)行脅迫實(shí)驗(yàn)，在37 ℃、5% CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h。每孔加入20 μL MTT液(5 g·L-1)，繼續(xù)孵化4 h。棄去上清液，向每個(gè)孔里加入170 μL DMSO，在37 ℃振蕩15 min，用酶標(biāo)儀(Elx808，BIOTEK，美國)檢測每個(gè)孔在490 nm處吸光度值(OD)，并按式(1)計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。

RAC=(OD濃度-OD調(diào)零)/(OD對(duì)照-OD調(diào)零)×100%

(1)

式中：RAC為細(xì)胞相對(duì)活力(%)；OD濃度為實(shí)驗(yàn)組吸光度值；OD調(diào)零為調(diào)零組吸光度值；OD對(duì)照為對(duì)照組吸光度值。

1.5 L02細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定

細(xì)胞收集和處理參照1.2部分。在37 ℃、5% CO2下孵育12 h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化并收集在離心管中，1 200 r·min-1離心5 min，棄去上清液。收集細(xì)胞并懸浮在用無血清培養(yǎng)液稀釋的DCFH-DA中，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育15 min，探針和細(xì)胞充分接觸。使用流式細(xì)胞儀檢測ROS，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。使用脂質(zhì)過氧化測定試劑盒測量丙二醛(MDA)含量。將細(xì)胞收集在離心管中，離心后，棄去上清液并提取MDA。將樣品在離心管中混合，在水浴中保溫30 min后，進(jìn)行冰浴和離心以測量532 nm和600 nm的吸光度；收集細(xì)胞并用PBS洗滌2次。分光光度計(jì)將波長調(diào)節(jié)至412 nm，測量在412 nm處30 s和150 s的吸光度(A1和A2)，并制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后，將樣品的吸光度引入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算每0.1 g細(xì)胞樣品中還原型谷胱甘肽(GSH)或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量。

1.6 L02細(xì)胞內(nèi)DNA損傷的測定

細(xì)胞收集和處理參照1.2部分。將細(xì)胞消化并在離心管中收集，1 200 r·min-1離心5 min，棄去上清液，PBS洗滌細(xì)胞2次。鋪片、細(xì)胞進(jìn)行裂解、漂洗，將載玻片置于冷卻至4 ℃的堿性電泳液，解旋后電泳、加PI、蓋玻片，熒光顯微鏡(Eclipse 80i，NIKON，日本)下觀察、拍照(激發(fā)波長530 nm，觀察波長>630 nm)。用CASP圖像分析軟件分析彗星圖像，本實(shí)驗(yàn)采用尾部DNA百分含量(Tail DNA%)作為定量衡量彗星拖尾程度的指標(biāo)。

1.7 L02細(xì)胞凋亡分析

細(xì)胞收集和處理參照1.2部分。將細(xì)胞消化并在離心管中收集，1 200 r·min-1離心5 min，消化細(xì)胞收集在離心管中，離心后棄去上清液；加入預(yù)冷PBS，重懸細(xì)胞，再次離心棄上清；分別加入5 μL的FITC-Annexin V及PI染液，室溫下避光染色5～10 min，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，結(jié)果使用FACSDiva 4.1軟件分析。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)的表達(dá)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用的處理軟件是SPSS18.0(SPSS, Chicago, IL, USA)，統(tǒng)計(jì)分析方法是方差分析(analysis of variance, ANOVA)。繪圖采用Origin 8.0軟件(OriginLab, Northampton, MA, USA)。顯著性水平達(dá)P<0.05和P<0.01為差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 TBBPA對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響

TBBPA處理L02細(xì)胞48 h后其形態(tài)變化如圖1所示。由圖1可知，正常L02細(xì)胞數(shù)量多，邊界清楚，細(xì)胞折光率良好，L02細(xì)胞形態(tài)具有良好梭形，并且邊緣清晰、肝細(xì)胞明亮。TBBPA處理48 h后，與對(duì)照組相比，5 μmol·L-1劑量組中L02細(xì)胞未顯示顯著形態(tài)學(xué)的變化。隨著TBBPA濃度的增加，L02細(xì)胞的數(shù)目慢慢減少，死亡細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞形態(tài)改變，并且大部分細(xì)胞傾向于變扁、變小和變圓。當(dāng)濃度達(dá)到10 μmol·L-1時(shí)，L02細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞體積變小，部分細(xì)胞出現(xiàn)邊緣模糊，甚至消失；在40 μmol·L-1劑量組暴露48 h后，細(xì)胞形態(tài)變圓，并且貼壁細(xì)胞形態(tài)趨于扁平，貼壁細(xì)胞減少，與周圍的細(xì)胞脫離。細(xì)胞數(shù)量也達(dá)到最低。這表明，TBBPA對(duì)L02肝細(xì)胞具有毒性。

圖1 L02細(xì)胞形態(tài)變化注：DMSO表示二甲基亞砜溶劑組。Fig. 1 Morphological changes of L02 cellsNote: DMSO means dimethyl sulfoxide solvent control.

2.2 TBBPA對(duì)細(xì)胞活力的影響

為了研究TBBPA對(duì)L02細(xì)胞活性的影響，用不同劑量的TBBPA處理L02細(xì)胞24、48和72 h后，MTT法測定細(xì)胞存活率。如圖2所示，隨著TBBPA劑量和脅迫時(shí)間的增加，L02細(xì)胞活力降低的程度不同。TBBPA濃度為5、10、20、40、80、100和200 μmol·L-1時(shí)，48 h暴露使細(xì)胞活力呈濃度依賴方式顯著降低(P<0.05)。濃度為2.5 μmol·L-1時(shí)未發(fā)現(xiàn)顯著的細(xì)胞死亡。當(dāng)細(xì)胞暴露于5、10、20和40 μmol·L-1TBBPA 48 h后，觀察到明顯的細(xì)胞死亡(圖2)。TBBPA將細(xì)胞活力分別降低至82.2%±1.05%、80.7%±0.63%、72.3%±0.89%和57.5%±0.79%。結(jié)果表明，TBBPA能夠顯著降低L02細(xì)胞活性。

圖2 2.5～200 μmol·L-1四溴雙酚A(TBBPA)暴露24、48和72 h后對(duì)L02細(xì)胞增殖的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=6；D表示DMSO溶劑對(duì)照組；*P<0.05、**P <0.01，與DMSO對(duì)照組相比。Fig. 2 Effects of 2.5～200 μmol·L-1 tetrabromobisphenol A (TBBPA) on the proliferation of the L02 cell after 24, 48 and 72 h exposureNote: All data were expressed as mean±S.E.M, n=6; D represents DMSO solvent control; *P<0.05, **P<0.01, compared with DMSO control.

2.3 TBBPA對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的影響

在本實(shí)驗(yàn)中，通過熒光探針DCFH-DA檢測L02細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，結(jié)果如圖3所示，圖3中流式圖的橫軸表示DCF的熒光強(qiáng)度，反映細(xì)胞內(nèi)ROS濃度，縱軸表示對(duì)應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量。用TBBPA處理L02細(xì)胞12 h引起胞內(nèi)ROS濃度呈劑量依賴性增加。如圖4所示，5、10、20和40 μmol·L-1TBBPA處理組的胞內(nèi)ROS濃度與DMSO對(duì)照組細(xì)胞相比，分別增加至DMSO對(duì)照組的1.26倍、1.63倍、2.51倍和3.07倍。5 μmol·L-1TBBPA暴露組中ROS含量與DMSO對(duì)照組之間沒有顯著性差異。20 μmol·L-1和40 μmol·L-1TBBPA暴露組中ROS含量與DMSO對(duì)照組比較差異性顯著(P<0.05)。隨著TBBPA劑量的增加，ROS的產(chǎn)量增加。高劑量的TBBPA可刺激L02細(xì)胞中產(chǎn)生大量的ROS，并使細(xì)胞中發(fā)生氧化應(yīng)激。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析L02細(xì)胞活性氧(ROS)水平Fig. 3 Analysis of reactive oxygen species (ROS) levels in L02 cells by flow cytometry

圖4 TBBPA對(duì)L02細(xì)胞內(nèi)的ROS水平的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=6；*P<0.05、**P<0.01，與DMSO對(duì)照組相比。Fig. 4 Effects of TBBPA on cellular ROS level in L02 cellsNote: All data were expressed as mean±S.E.M, n=6; *P<0.05, **P<0.01, compared with DMSO control.

如表1所示，TBBPA導(dǎo)致MDA含量顯著增加。與DMSO對(duì)照組相比，20 μmol·L-1和40 μmol·L-1TBBPA暴露組的MDA含量增加至對(duì)照的約2.6倍和3.3倍(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TBBPA可增加L02細(xì)胞內(nèi)MDA含量，導(dǎo)致細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。如表1所示，TBBPA引起胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)GSH含量降低。與DMSO對(duì)照組相比，20 μmol·L-1和40 μmol·L-1TBBPA暴露組的GSH含量降低至DMSO對(duì)照組的0.38%和0.29%(P<0.05)。這表明，TBBPA可導(dǎo)致L02細(xì)胞內(nèi)GSH含量降低；TBBPA導(dǎo)致GSSG水平顯著升高。與DMSO對(duì)照組相比，20 μmol·L-1和40 μmol·L-1TBBPA暴露組的GSSG含量升高為DMSO對(duì)照組的1.89倍和2.18倍(P<0.05)。這表明，TBBPA可導(dǎo)致L02細(xì)胞中抗氧化能力降低。

表1 L02細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSH)的含量Table 1 Contents of malondialdehyde (MDA), reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSH) in L02 cells

2.4 TBBPA對(duì)DNA損傷的影響

DNA主要存在于細(xì)胞核的染色質(zhì)中，作為基因的載體，是貯存全部遺傳信息的分子[17]。選取了彗星頭部和尾部DNA分布的相對(duì)含量作為參考指標(biāo)來評(píng)價(jià)分析DNA損傷程度，經(jīng)5、10、20和40 μmol·L-1TBBPA處理后，彗星頭部DNA分布的相對(duì)含量分別為91.8%±0.25%、89.7%±0.43%、82.6%±1.09%和69.4%±3.37%(圖5和圖6)。尾部DNA分布的相對(duì)含量分別為8.2%±0.25%、10.3%±0.43%、17.4%±1.09%和30.6%±3.37%(圖5和圖6)。隨著TBBPA濃度的增加，彗星頭部DNA含量明顯降低，尾部DNA含量增加。40 μmol·L-1TBBPA處理組細(xì)胞尾部DNA的相對(duì)量是DMSO對(duì)照組的6.5倍。這表明，隨著TBBPA濃度的增加，拖尾現(xiàn)象愈加明顯，DNA損傷程度逐漸增強(qiáng)。

圖5 彗星實(shí)驗(yàn)的熒光照片(200×)Fig. 5 Photographs of Comet assay by fluorescence microscopy (200×)

圖6 細(xì)胞頭部和尾部DNA相對(duì)含量注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=6；*P<0.05、**P<0.01，與DMSO對(duì)照組相比。Fig. 6 Relative content of DNA in the head and tail of cellsNote: All data were expressed as mean±S.E.M, n=6; *P<0.05, **P<0.01, compared with DMSO control.

2.5 TBBPA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)通過Annexin V/PI染色考察了TBBPA對(duì)L02細(xì)胞凋亡的影響。圖7中流式圖橫軸表示膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)的綠色熒光強(qiáng)度，縱軸表示PI的紅色熒光強(qiáng)度。Annexin V陽性且PI陰性表示是早期凋亡細(xì)胞，Annexin V陽性且PI陽性表示是晚期凋亡細(xì)胞。流式檢測結(jié)果顯示，TBBPA可以濃度依賴性地誘導(dǎo)L02細(xì)胞凋亡(P<0.05)(圖8)，L02細(xì)胞分別經(jīng)5、10、20和40 μmol·L-1TBBPA處理48 h后細(xì)胞凋亡率分別為12.63%、15.11%、30.69%和42.88%。在處理組、空白對(duì)照組和DMSO對(duì)照組之間觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。如圖8所示，細(xì)胞凋亡率隨著TBBPA濃度的增加而增加，與DMSO對(duì)照組相比，20 μmol·L-1和40 μmol·L-1TBBPA處理組細(xì)胞凋亡率分別增加了3.2倍和4.8倍，誘導(dǎo)L02細(xì)胞的凋亡的效果明顯。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡Fig. 7 Representative graphs of cell apoptosis obtained from flow cytometry analysis

圖8 TBBPA對(duì)L02細(xì)胞凋亡率的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=6；*P<0.05、**P<0.01，與DMSO對(duì)照組相比。Fig. 8 Effect of TBBPA on the apoptosis rate of L02 cellsNote: All data were expressed as mean±S.E.M, n=6; *P<0.05, **P<0.01, compared with DMSO control.

3 討論(Discussion)

肝臟是人體主要的代謝和解毒器官，可以促進(jìn)多種酶的合成，對(duì)進(jìn)入體內(nèi)的外源毒性物質(zhì)進(jìn)行清除。環(huán)境中的TBBPA可通過多種途徑進(jìn)入人體后，在肝臟中積累，增加肝臟的代謝負(fù)擔(dān)并對(duì)人體肝臟造成損傷。本研究的結(jié)果顯示，TBBPA抑制L02細(xì)胞增殖，與對(duì)照組比較，隨著TBBPA濃度的增加，L02細(xì)胞數(shù)量明顯減少，死亡細(xì)胞數(shù)量增多。細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞體積變小，突觸變短，甚至消失；貼壁細(xì)胞減少，與周圍的細(xì)胞脫離。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TBBPA能不同程度地降低L02細(xì)胞的活性，對(duì)L02細(xì)胞有致毒性，TBBPA可以濃度依賴性地誘導(dǎo)L02細(xì)胞凋亡。Tada等[18]的研究表明，TBBPA處理組小鼠的肝細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組。Nakagawa等[19]研究了TBBPA對(duì)原代大鼠肝細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)TBBPA可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而造成肝功能損傷。

TBBPA暴露可誘導(dǎo)大鼠小腦顆粒細(xì)胞[20]和大鼠胰腺細(xì)胞凋亡[21]。Grasselli等[22]發(fā)現(xiàn)TBBPA會(huì)影響田鼠肝癌細(xì)胞的基因表達(dá)異常和細(xì)胞凋亡；Wikoff和Birnbaum[23]認(rèn)為是TBBPA通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激造成細(xì)胞凋亡對(duì)肝臟產(chǎn)生毒性作用，研究氧化應(yīng)激機(jī)制對(duì)于研究的細(xì)胞凋亡調(diào)控具有非常重要的理論意義。向明燈等[24]結(jié)果顯示，隨著TBBPA處理濃度增加，HepG2細(xì)胞存活率下降，凋亡率增加。以上結(jié)果均說明TBBPA對(duì)肝細(xì)胞有毒性效應(yīng)。

肝細(xì)胞代謝時(shí)會(huì)產(chǎn)生ROS[25]。在正常的生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和消除的ROS處于平衡狀態(tài)，以維持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)定。當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境刺激時(shí)ROS會(huì)過量產(chǎn)生，引起細(xì)胞內(nèi)ROS的積累[26]。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是細(xì)胞內(nèi)氧化損傷的一個(gè)重要指標(biāo)，MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量可以間接反映細(xì)胞內(nèi)氧化損傷的程度，如果細(xì)胞內(nèi)MDA含量增加，則表明細(xì)胞ROS過多而造成氧化攻擊[27]。TBBPA可以引起L02細(xì)胞中MDA含量增加，細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)不平衡，細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生抗氧化酶以維持氧化還原平衡。GSH是體內(nèi)的重要的抗氧化劑，負(fù)責(zé)去除多余的ROS。GSSG為GSH的氧化形式，在氧化劑作用下GSH通過谷胱甘肽過氧化物酶被氧化成GSSG，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)[28]。GSSG/GSH是體內(nèi)主要的內(nèi)源性氧化還原調(diào)節(jié)劑。細(xì)胞內(nèi)GSH水平與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，過度消耗GSH可引發(fā)細(xì)胞凋亡[29]。在正常生理?xiàng)l件下，GSSG/GSH的比例保持在一定水平，而在氧化應(yīng)激下，GSH被氧化成GSSG，導(dǎo)致GSSG/GSH比率上升。因此，GSSG/GSH可用于評(píng)估細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。本研究結(jié)果顯示，隨著TBBPA濃度的增加，GSSG/GSH比率也顯著增加。這表明，細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)偏移至氧化態(tài)。

細(xì)胞內(nèi)ROS大量積累而使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，對(duì)細(xì)胞中的DNA分子造成不同程度的氧化損傷，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，對(duì)肝臟造成損傷[30]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生和清除的ROS之間的不平衡導(dǎo)致ROS持續(xù)升高，可直接或間接造成DNA損傷，導(dǎo)致基因突變，激活細(xì)胞敏感信號(hào)通路[31]。Zhao等[32]的研究表明，阻燃劑暴露誘導(dǎo)細(xì)胞過量產(chǎn)生ROS，引起氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)40 μmol·L-1TBBPA處理組的胞內(nèi)ROS含量顯著增加，MDA和GSSG/GSH明顯高于對(duì)照組和低劑量組，說明細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，40 μmol·L-1TBBPA處理后細(xì)胞尾部DNA相對(duì)含量增加至DMSO對(duì)照的6.5倍，細(xì)胞凋亡率比DMSO對(duì)照組增加了4.8倍。DNA損傷程度和L02細(xì)胞凋亡水平比對(duì)照組都有顯著增強(qiáng)，這些結(jié)果表明氧化應(yīng)激對(duì)DNA損傷和細(xì)胞凋亡有重要作用。

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