占今舜，霍俊宏，詹 康，趙國琦，武艷平，馬月輝

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,江西南昌 330200；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100093；3.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇揚州 225009）

槲皮素是一種廣泛存在于植物的花、葉和果實中的多羥基黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等生物功能[1]。在肉羊飼糧中添加槲皮素，能夠調(diào)控瘤胃菌群結(jié)構(gòu)，促進瘤胃發(fā)酵，提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率，進而提高飼料利用率；能夠提高機體抗氧化能力和免疫力，改善肉品質(zhì)[2-4]。瘤胃是反芻動物營養(yǎng)消化和吸收的主要場所，瘤胃上皮在營養(yǎng)物質(zhì)吸收和運輸、瘤胃壁保護等方面發(fā)揮重要的生理作用[5]。反芻動物采食高比例易發(fā)酵的碳水化合物飼糧后，可能會出現(xiàn)瘤胃酸中毒，促使瘤胃脂多糖(LPS)濃度升高，導(dǎo)致瘤胃上皮屏障受損，引發(fā)消化道內(nèi)源LPS移位，進而引發(fā)宿主炎癥[3]。給山羊飼喂高精料(精粗比75∶25)飼糧中添加槲皮素，能夠下調(diào)山羊肝臟和蹄組織炎癥因子(IL-1β、TNF-α)基因表達水平，增加肝臟IL-10的表達水平。有研究結(jié)果表明，槲皮素能夠提高山羊組織的抗炎能力，有預(yù)防蹄葉炎的作用[6]。體外研究發(fā)現(xiàn)，LPS能夠抑制山羊瘤胃上皮細胞增殖，上調(diào)細胞炎性細胞因子的表達，導(dǎo)致細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿黃酮和苜蓿素等黃酮類化合物能夠通過調(diào)控TLR/MyD88信號通路來緩解LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細胞的炎癥損傷[8-9]。然而，槲皮素是否能夠保護山羊瘤胃上皮細胞免受炎性損傷尚不清楚。因此，研究槲皮素對LPS刺激下山羊瘤胃上皮細胞抗氧化和抗炎癥的影響，可以為今后合理利用槲皮素來緩解反芻動物瘤胃酸中毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

槲皮素(HPLC≥99%)和脂多糖(LPS，血清型O55:B5)均購于美國Sigma 公司，細胞培養(yǎng)級的二甲基亞砜(DMSO)購于北京索萊寶公司；試驗所用原代瘤胃上皮細胞來自波爾山羊，由揚州大學(xué)動物培養(yǎng)物保藏與應(yīng)用研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1細胞活性檢測

試驗于2019年9月開始，細胞活性采用CCK-8法進行檢測。將山羊瘤胃上皮細胞接種到96孔板中，每孔數(shù)量為1×105個·mL?1，細胞在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞貼壁后，去除培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗后加入分別含0、5、10、20、40、60、80、120、160和320μg·mL?1槲皮素的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每組5個重復(fù)，其中槲皮素用DMSO溶解，每組的DMSO含量為1‰。細胞培養(yǎng)6 h 后，每孔中加入10μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育3 h 后，用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光值，然后計算細胞活性。以此確定下一步槲皮素試驗的最佳濃度。

1.2.2抗氧化指標(biāo)的測定

取密度為5×105個·mL?1細胞接種到六孔板，待細胞貼壁后，去除培養(yǎng)基，PBS清洗后加入DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(對照組，Con)以及DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基[分別加入1μg·mL?1的LPS(L)、80 μg·mL?1槲皮素(Q)和1 μg·mL?1的LPS + 80 μg·mL?1槲皮素(L + Q)]中，每組5個重復(fù)，其中槲皮素用DMSO溶解，每組的DMSO含量為1‰。細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)6 h，然后收集細胞。根據(jù)試劑盒(南京建成生物工程研究所)中的說明書進行總抗氧化力(total antioxidant capacity，T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-PX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)等指標(biāo)的測定。

1.2.3基因相對表達的檢測

試驗分組和細胞培養(yǎng)方法同1.2.2。試驗結(jié)束時，去除細胞培養(yǎng)液，然后直接加入1 mL的Trizol，混勻靜置5～10 min。RNA 提取參照試劑盒(天根生化科技有限公司)中說明書上的方法進行。RNA 提取后采用One Drop儀器進行總RNA 的濃度和純度的檢測，采用Roche 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA 的合成，然后按照RT-PCR 試劑盒中試驗方法進行PCR 反 應(yīng) 液 的 配 制，在Light Cycler?96 PCR 儀(Roche公司)上進行PCR 檢測。操作方法、反應(yīng)體系和反應(yīng)液配制參照占今舜等[8]。試驗所需引物根據(jù)Gene Bank 中的基因序列，由Invitrogen 公司合成。引物序列如表1所列。

表1 引物序列與參數(shù)Table 1 Sequencesand detailsof the primersused in thisstudy

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)先用Excle 2007進行預(yù)處理，基因相對表達量采用2?△△Ct方法進行計算。然后用SPSS 21.0軟件進行ANOVA 分析，LSD法進行多重比較，以P<0.01表示差異極顯著，P< 0.05表示差異顯著。結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素對山羊瘤胃上皮細胞活性的影響

添加5～320μg·mL?1槲皮素均能顯著增加山羊瘤胃上皮細胞的活性(P<0.05)(圖1)。隨著槲皮素添加水平的升高，細胞活性呈先增加后下降的趨勢，其中80μg·mL?1槲皮素組的細胞活性最高。結(jié)果表明，槲皮素能夠增加山羊瘤胃上皮細胞的活性。本研究選擇濃度為80μg·mL?1槲皮素開展后續(xù)試驗。

圖1 槲皮素對山羊瘤胃上皮細胞相對活性的影響Figure 1 Effects of quercetin on the relative activity of goat rumen epithelial cells

2.2 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細胞氧化性能的影響

如表2所列，Q組和L + Q組細胞的T-AOC、GSH-PX 活性極顯著高于其他兩組(P<0.01)。Con組和L +Q組細胞的CAT活性極顯著高于L 組(P<0.01)，Con 組CAT活性極顯著低于Q組(P<0.01)，Con 組和L +Q組細胞的SOD活性顯著高于L 組(P<0.05)，但極顯著低于Q組(P<0.01)。L 組和L +Q組細胞的MDA 含量顯著高于其他兩組(P<0.05)，Q組最低。結(jié)果表明，槲皮素能夠增加山羊瘤胃上皮細胞的抗氧化能力。

表2 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細胞抗氧化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of quercetin on the antioxidant indices of goat rumen epithelial cellsstimulated by lipopolysaccharide

2.3 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細胞因子mRNA 表達的影響

如表3所列，Con 組和Q組細胞CXCL6、CXCL8、IL-6、TNF-α和IL-1β的mRNA 相對表達量極顯著低于L 組和L+Q組(P<0.01)，以L 組表達量最高。L組和L +Q組細胞CCL5的mRNA 相對表達量極顯著高于Con 組和Q組(P<0.01)，以Q組最低。Q組和L +Q組細胞IK的mRNA 相對表達量極顯著低于L 組和Con 組(P<0.01)，以L組表達量最高。以上結(jié)果表明，槲皮素具有抑制與炎癥相關(guān)細胞因子基因的表達。

表3 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細胞因子mRNA 表達的影響Table 3 Effect of quercetin on themRNA expression of cytokinesin goat rumen epithelial cells stimulated by lipopolysaccharide

2.4 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細胞調(diào)控因子mRNA 表達的影響

如表4所列，L組細胞TLR 2和TLR 4的mRNA相對表達量極顯著高于Q和L +Q組(P<0.01)，Q和L+Q組之間無顯著差異(P>0.05)。L組細胞NF-κB和MyD 88的mRNA 相對表達量極顯著高于其他3組(P<0.01)，L +Q組極顯著高于其他兩組(P<0.01)。L 組細胞TOLLIR的mRNA 相對表達量極顯著高于Q和L +Q 組(P<0.01)，但與Con 組無顯著差異(P>0.05)。L組細胞IRF3和IFIT 3的mRNA 相對表達量顯著高于Q組(P<0.05)，但各處理組細胞UXT的mRNA 相對表達量無顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明，槲皮素能夠下調(diào)TLR/MyD88/NF-κB 信號通路相關(guān)基因的表達。

表4 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細胞調(diào)控因子mRNA 表達的影響Table4 Effectsof quercetin on the mRNA expression of regulatory factorsin goat rumen epithelial cellsstimulated by lipopolysaccharide

3 討論

3.1 槲皮素對山羊瘤胃上皮細胞活性的影響

通過體外細胞培養(yǎng)方法研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類物質(zhì)如大豆異黃酮、辣木葉黃酮和苜蓿素等均能夠增加乳腺上皮細胞的活力和促進細胞增殖[10-12]。結(jié)果表明，黃酮類物質(zhì)能夠增加細胞活性，促進細胞增殖。槲皮素是植物中比較常見的黃酮類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠增加豬小腸上皮細胞和奶牛乳腺上皮細胞的活力，促進細胞增殖[13-14]。本研究也得到相似結(jié)果，說明槲皮素有促進山羊瘤胃上皮細胞增殖的作用。

3.2 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細胞氧化性能的影響

黃酮類化合物通過釋放的氫離子能夠與活性氧相結(jié)合而直接清除自由基，通過抑制氧化酶的活性和提高防御酶的活性來清除自由基，通過螯合作用、減少金屬離子誘導(dǎo)自由基等來發(fā)揮抗氧化作用[15]。黃思瑩等[16]以桑(Morus alba)葉槲皮素為研究對象，探索其對D-半乳糖衰老小鼠抗氧化能力的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桑葉槲皮素高劑量組能夠提高小鼠血清T-AOC水平、GSH-Px 和SOD的活性，顯著降低MDA 含量。楊璐愷等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍保護劑中添加槲皮素能夠提高羊卵巢組織的CAT 活性。本研究結(jié)果與其相似，結(jié)果表明，槲皮素能夠提高山羊瘤胃上皮細胞的抗氧化能力。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的主要成分，在體內(nèi)通過細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活上皮細胞合成和釋放細胞因子和炎性介質(zhì)，抑制抗氧化酶類的活性，導(dǎo)致脂質(zhì)氧化，產(chǎn)生活性氧自由基等，進而產(chǎn)生細胞氧化損傷[18]。研究發(fā)現(xiàn)，LPS能夠降低奶牛乳腺上皮細胞和人腎小球上皮細胞SOD的活性，升高MDA 的含量[19-20]。本研究得到相似的結(jié)果，表明LPS能夠誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮細胞的氧化損傷。在本研究中，LPS刺激下添加槲皮素能夠顯著提高細胞T-AOC、CAT、SOD和GSH-PX 的活性，結(jié)果表明，槲皮素能夠提高抗氧化酶類活性來緩解LPS誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮細胞的氧化損傷。

3.3 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細胞因子基因表達的影響

LPS 是革蘭性陰性菌細胞壁成分，當(dāng)細菌死亡溶解時，其釋放出來會誘導(dǎo)細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)參與炎癥反應(yīng)[21]。帕提古麗[7]研究體外LPS誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮細胞損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS顯著提高了細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA 表達，本研究結(jié)果與其一致。槲皮素、柚皮素、蘆丁和苜蓿黃酮等黃酮類物質(zhì)能夠降低單核細胞和奶牛乳腺 上 皮 細 胞 炎 癥 因 子TNF-α、IL-6和IL-1β基因的表達[8,22]。本研究得到相似結(jié)果，說明槲皮素能夠抑制炎癥反應(yīng)。主要組織相容性復(fù)合體II(MHCII)抗原大多位于抗原提呈細胞(APC)上，如巨噬細胞等。當(dāng)細菌侵入組織時，巨噬細胞吞食細菌后，并將細菌碎片利用主要組織相容性復(fù)合體(MHC)提示給輔助T 細胞，啟動免疫反應(yīng)。IK 細胞因子能夠抑制MHCII抗原的表達和由IFN-γ 誘導(dǎo)的MHC II 抗原的表達[23]。從本研究結(jié)果來看，LPS能夠促進山羊瘤胃上皮細胞的自身免疫反應(yīng)，而槲皮素具有抑制細胞自身免疫的作用。趨化因子是一類由細胞分泌，具有誘導(dǎo)附近反應(yīng)細胞定向趨化能力的細胞因子，分為CXC、CC、CX3C和C4類[24]。CCL5具有調(diào)節(jié)正常T 細胞表達和分泌的細胞因子，促進炎性細胞因子的釋放的作用[25]。CXCL6由巨噬細胞和上皮及間質(zhì)細胞等分泌，具有趨化粒細胞、促血管生成、抗菌和調(diào)節(jié)免疫等功能。IL-1β、TNF-α 和LPS均能誘導(dǎo)CXCL6表達，其中IL-1β是CXCL6的主要誘導(dǎo)劑[26]。CXCL8為中性粒細胞趨化因子，它可以誘導(dǎo)靶細胞向感染部位趨化，是一種促炎趨化因子[27]。LPS能夠刺激趨化因子的表達，而槲皮素則抑制趨化因子的表達，進而抑制炎癥的產(chǎn)生。

3.4 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細胞調(diào)控因子基因表達的影響

Toll 樣受體(TLRs)是一類廣泛存在于哺乳動物細胞表面的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，可以識別病原微生物的蛋白質(zhì)、核酸、脂類以及代謝產(chǎn)物等物質(zhì)，激活銜接蛋白，啟動下游信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生促炎性細胞因子及趨化因子，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[28]。TLR2和TLR4能識別微生物的脂蛋白和LPS。激活TLRs介導(dǎo)的信號通路需要MyD88、MyD88樣銜接蛋白、誘導(dǎo)β干擾素的TIR 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)等銜接蛋白的參與。TLR2和TLR4需要MyD88和含TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白的共同作用，引起NF-κB活化，誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性細胞因子的分泌和干擾素的表達，參與炎癥反應(yīng)[29]。另外，TLR2和TLR4還可以通過招募TRIF蛋白分子，激活I(lǐng)RF3蛋白分子，繼而進入細胞核并誘導(dǎo)一系列相關(guān)炎癥因子的分泌[30]。IFIT 家族蛋白參與蛋白之間的相互作用，并行使起始翻譯、識別雙鏈RNA、參與細胞遷徙及增殖等多種功能。通常該家族分子在大多數(shù)細胞中表達量較低，但在LPS刺激可以強烈誘導(dǎo)其表達，其中IFIT3 能夠在體內(nèi)和體外促進IFN 誘導(dǎo)細胞凋亡[31]。從本研究結(jié)果來看，槲皮素能夠抑制TLR2、TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活，進而抑制炎性細胞因子的分泌，發(fā)揮抗炎癥作用。泛表達轉(zhuǎn)錄子(UXT)蛋白主要在細胞核，可以與NF-κB形成信號依賴性動態(tài)復(fù)合體，促進NF-κB增強體形成的核分子伴侶[32]。本研究結(jié)果表明，槲皮素不會影響UXT 調(diào)控NF-κB 信號通路的功能。

4 結(jié)論

槲皮素能夠提高山羊瘤胃上皮細胞活性，通過提高抗氧化酶類的活性和調(diào)節(jié)TLR/MyD88/NF-κB信號通路抑制炎性細胞因子的分泌來緩解LPS誘導(dǎo)的細胞損傷。