李炳, 王瑞旋, 張立, 羅幫, 牟紅莉, 王江勇

1. 上海海洋大學, 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心, 上海 201306;

2. 韓山師范學院, 廣東 潮州 521041;

3. 中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所, 廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室, 廣東 廣州 510300;

4. 廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學研究院, 廣西 南寧 530021;

5. 惠州學院, 廣東 惠州 516007

香港牡蠣隸屬雙殼綱、牡蠣科, 其產(chǎn)量高、生長快、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟價值高, 是我國華南沿海重要經(jīng)濟貝類之一。近年來, 海域污染、養(yǎng)殖密度增加、純系種質(zhì)退化、病害侵襲、缺乏科學管理等問題日漸凸顯(張銳, 2014)。在華南沿海牡蠣養(yǎng)殖區(qū),大規(guī)模死亡事件時有發(fā)生, 一般在每年的3—5月份和10—12月份, 死亡率達80%～90%, 目前認為牡蠣的大規(guī)模死亡是由病害和環(huán)境等因素共同導致的(張占會, 2006)。在廣西的牡蠣養(yǎng)殖區(qū)(包括大風江、欽州港、青菜頭一帶), 每年4—5月期間牡蠣死亡率高達60%。據(jù)報道, 該區(qū)域春季降雨少, 鹽度居高不下, 香港牡蠣精卵的排放受到抑制, 進而性腺發(fā)育過熟和退化, 這可能是造成牡蠣大規(guī)模死亡的主要原因(於鋒 等, 2016)。夏季持續(xù)高溫導致牡蠣死亡的情況也有發(fā)生, 牡蠣在異常環(huán)境如病原體、溫度、鹽度和氨氮濃度等因素突變下, 會出現(xiàn)新陳代謝紊亂、免疫機能異常, 甚至發(fā)病死亡(廉偉 等, 2010)。牡蠣是濾食性的雙殼貝類, 主要通過過濾海水來獲取水體中的有機物、微生物作為食物。牡蠣在濾食過程中體內(nèi)會大量聚集養(yǎng)殖水體中的細菌, 其中包括氣單胞菌(Aeromonas)、弧菌(Vibrio)等條件致病菌(Balbi et al, 2019; Grilo et al, 2020)。弧菌廣泛存在于海洋環(huán)境中, 弧菌中的某些致病菌, 如哈維弧菌(V.harvei)是一種毒力強、流行廣的細菌性病原體。據(jù)報道, 隨海水溫度、鹽度升高, 弧菌等條件致病菌繁殖達到一定閾值后, 致病菌將會侵襲貝類的外套膜、鰓、肝胰腺等組織, 造成貝類大量死亡(明紅霞等, 2015; 劉曉靖 等, 2019; Wickramanayake et al,2020)。

從上世紀40年代以來, 多種抗生素被應用在水生動物的細菌性疾病防治上, 例如土霉素、青霉素、卡那霉素、氯霉素等(Tendencia et al, 2001)。目前, 水產(chǎn)細菌性疾病的防治手段主要以抗生素為主, 因而抗生素的濫用情況時有發(fā)生, 導致細菌耐藥性問題日益嚴重(Wu et al, 2019; 魏文娟 等, 2020)。對皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)消化道中異養(yǎng)細菌耐藥率的研究發(fā)現(xiàn), 大部分菌株為多重耐藥菌株, 對青霉素、卡那霉素、慶大霉素、利福平的耐藥率最高達83.9%(孫永嬋 等, 2017)。根據(jù)筆者此前對廣東沿海的香港牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)菌的研究, 異養(yǎng)細菌對青霉素、呋喃唑酮、克林霉素、卡拉霉素、阿莫西林及萬古霉素有較強的耐藥性, 且高溫時期分離的異養(yǎng)細菌大部分為多重耐藥細菌, 其在6月和9月所占比例分別為84.18%和91.72%(李炳 等, 2020)。眾所周知, 異養(yǎng)細菌在海洋生態(tài)系統(tǒng)中(如能量流動、物質(zhì)循環(huán)等方面)起著重要作用。異養(yǎng)細菌作為水體有機質(zhì)高低的指示生物, 在《水環(huán)境監(jiān)測規(guī)范》(SL219-98)中, 異養(yǎng)細菌豐度是地表水和地下水水體監(jiān)測的必測項目(肖慧, 2005; 謝煜 等, 2017;Begum et al, 2019)。本研究針對同一海域出現(xiàn)不同程度死亡的牡蠣, 從微生物角度出發(fā)探究牡蠣死亡率與微生物之間的相關性, 旨在了解牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌數(shù)量與牡蠣死亡率之間的聯(lián)系以及牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌種屬之間的差異。同時, 對牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌的耐藥性進行比較分析, 掌握牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)菌的多重耐藥情況。本文研究結(jié)果能夠為牡蠣的細菌性疾病預警以及牡蠣的健康養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

2019年5月在廣西北部灣茅尾海養(yǎng)殖區(qū)(鹽度:21‰～25‰; pH: 7.5～8.0; 溫度: 27.5℃)采集吊養(yǎng)的香港牡蠣樣本。采樣時, 在同一海域A、B、C三個采樣點隨機抽取數(shù)十吊, 并統(tǒng)計每吊死亡牡蠣的數(shù)量。其中, A采樣點的平均死亡率為70%(記為高死亡率養(yǎng)殖區(qū)), B采樣點的平均死亡率為50%(記為中死亡率養(yǎng)殖區(qū)), C采樣點的平均死亡率為20%(記為低死亡率養(yǎng)殖區(qū))。隨機挑取有活性的牡蠣5～10個,清洗牡蠣外殼后稱取0.5g的內(nèi)臟團并置于滅菌后的1.5mL玻璃勻漿器中, 加入無菌生理鹽水稀釋至10-3、10-4、10-5的稀釋度。將各個梯度的稀釋液涂布于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(BHA培養(yǎng)基)、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(TCBS培養(yǎng)基)、水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(MHA培養(yǎng)基), 這3種培養(yǎng)基均購于環(huán)凱生物科技有限公司。每個稀釋梯度設置3組平行, 培養(yǎng)基放于恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)96h,培養(yǎng)后對各個培養(yǎng)基的異養(yǎng)細菌數(shù)量和弧菌數(shù)量進行統(tǒng)計。BHA培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果為異養(yǎng)細菌總數(shù),TCBS培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果為弧菌數(shù)量, MHA培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果為對單種藥物具有抗性的菌株數(shù)量。

1.2 耐藥菌株(單種藥物)的分離

取牡蠣內(nèi)臟勻漿液均勻涂布在添加了抗生素藥物的MHA培養(yǎng)基上, 分別為恩諾沙星(8μg·mL-1)、慶大霉素(16μg·mL-1)、環(huán)丙沙星(4μg·mL-1)、呋喃唑酮(4μg·mL-1)、氯霉素(8μg·mL-1)、利福平(4μg·mL-1)、復方新諾明(胺甲惡唑16μg·mL-1, 甲氧芐啶4μg·mL-1),抗生素藥粉購于上海阿拉丁生化有限公司。然后挑取培養(yǎng)基上的單菌落, 經(jīng)過劃線分離和純化后保存, 將用于后續(xù)的菌株鑒定和細菌耐藥性研究中。

1.3 細菌16S rDNA的擴增及菌株鑒定

使用試劑盒提取細菌DNA(購于廣州吉瑞生物有限公司), 以細菌DNA為模板、上下游引物、PCR-mix、ddH2O進行PCR擴增。

反應體系(25μL體系): PCR-mix 12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、DNA模板1μL、ddH2O 9.5μL。采用引物8F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492F(5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3')進行擴增。

擴增反應條件為: 95℃預變性5min, 95℃變性40s, 55℃復性40s, 72℃延伸45s, 其中第2步至第4步進行35個循環(huán), 之后72℃延伸10min, 4℃終止反應。

PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳, 得到單一目的條帶之后(約1500bp), 樣品送至廣州天一輝遠有限公司進行序列測定, 將測序結(jié)果輸入GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中進行數(shù)據(jù)比對, 確定菌株的種屬。

1.4 藥物敏感實驗及耐藥率計算

本研究中藥敏紙片購于杭州生物試劑有限公司,分別為: 青霉素(10μg·mL-1)、阿莫西林(10μg·mL-1)、萬古霉素(30μg·mL-1)、恩諾沙星(10μg·mL-1)、諾氟沙星(10μg·mL-1)、氧氟沙星(5μg·mL-1)、環(huán)丙沙星(5μg·mL-1)、慶 大 霉 素(10μg·mL-1)、新 霉 素(30μg·mL-1)、鏈 霉 素(10μg·mL-1)、妥 布 霉 素(10μg·mL-1)、紅 霉 素(15μg·mL-1)、多 西 環(huán) 素(30μg·mL-1)、四 環(huán) 素(30μg·mL-1)、氟 苯 尼 考(30μg·mL-1)、氯霉素(30μg·mL-1)。

藥敏測試實驗采用紙片擴散法, 實驗操作過程參考相關藥敏實驗及研究文獻(李璐璐 等, 2014;Wang et al, 2014)。以大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC25922和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)ATCC25923為參考菌株進行質(zhì)控, 通過游標卡尺測量藥敏紙片的抑菌圈直徑。以CLSI文件M100藥敏實驗判定標準(Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012)判定菌株對抗生素的敏感程度, 并以S(敏感)、I(中度)、R(耐藥)表示。對各個菌株的抗性藥物進行分類、記錄, 形成其特有的耐藥譜型(耐藥譜型即菌株對不同抗生素的耐受情況),以便開展后續(xù)的耐藥性分析(毛燦 等, 2020)。對3種及3種以上的抗生素存在抗性的菌株被判定為多重耐藥菌(Magiorakos et al, 2012)。計算不同死亡率養(yǎng)殖區(qū)菌株的多重耐藥指數(shù)為 Σn/(D×S)(Krumperman, 1983), 其中n為菌株存在抗性的藥物數(shù)量, Σn即為所有菌株存在抗性的藥物數(shù)量總和;D和S分別是實驗所用的抗生素種類數(shù)量和菌株數(shù)量。耐藥譜型豐富度(%)=耐藥譜型種數(shù)/耐藥譜型總數(shù)×100。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010軟件、IBM SPSS 22進行實驗數(shù)據(jù)及單因素方差分析, 利用Spearman進行相關性分析, 進一步統(tǒng)計分析異養(yǎng)細菌數(shù)量、弧菌數(shù)量和牡蠣死亡的相關性。

2 結(jié)果

2.1 牡蠣體內(nèi)細菌與牡蠣死亡率的相關性分析及細菌數(shù)量統(tǒng)計

各養(yǎng)殖區(qū)的牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌和弧菌經(jīng)分離、培養(yǎng)和統(tǒng)計, 異養(yǎng)細菌數(shù)量由高到低依次為: 高死亡率養(yǎng)殖區(qū)[(8.6±0.4)×106CFU·g-1]＞中度死亡率養(yǎng)殖區(qū)[(6.9±0.2)×106CFU·g-1]＞低死亡率養(yǎng)殖區(qū)[(3.3±0.1)×106CFU·g-1]; 弧菌數(shù)量由高到低依次為:高死亡率養(yǎng)殖區(qū)[(9.5±0.4)×105CFU·g-1]＞中死亡率養(yǎng)殖區(qū)[(4.5±0.6)×105CFU·g-1]＞低死亡率養(yǎng)殖區(qū)[(2.5±0.6)×105CFU·g-1]。對各個養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌和弧菌數(shù)量的平均值分別取對數(shù)值, 結(jié)果顯示異養(yǎng)細菌數(shù)量比弧菌數(shù)量高1～2個數(shù)量級(圖1)。高死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌數(shù)量與低死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌數(shù)量差異極顯著(P＜0.01);高死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)弧菌數(shù)量與低死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)弧菌數(shù)量差異顯著(P＜0.05)。根據(jù)各養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌及弧菌數(shù)量經(jīng)SPSS進行的Spearman相關性分析結(jié)果(見表1), 異養(yǎng)細菌數(shù)量與牡蠣死亡率的相關系數(shù)為0.996, 弧菌數(shù)量與牡蠣死亡率的相關系數(shù)為0.936。

圖1 各養(yǎng)殖區(qū)域牡蠣體內(nèi)的異養(yǎng)細菌數(shù)量和弧菌數(shù)量Fig.1 The numbers of heterotrophic bacteria and Vibrio in oysters from different farming areas

表1 牡蠣死亡率與細菌數(shù)量的相關性Tab.1 Correlation between oyster mortality and number of bacteria

根據(jù)不同抗生素培養(yǎng)基生長細菌數(shù)量的對數(shù)值(圖2)可知, 來自不同死亡率養(yǎng)殖區(qū)域的牡蠣細菌數(shù)量差異較大, 并且以利福平和呋喃唑酮培養(yǎng)基生長的細菌數(shù)量較大。其中, 高死亡率環(huán)境中的牡蠣體內(nèi)的細菌主要在慶大霉素、利福平、氯霉素、呋喃唑酮、環(huán)丙沙星培養(yǎng)基上生長, 數(shù)量分別為9.4×102CFU·g-1、7.8×103CFU·g-1、2.0×102CFU·g-1、1.1×104CFU·g-1、2.0×102CFU·g-1; 中度死亡率環(huán)境中的牡蠣體內(nèi)的細菌主要在慶大霉素、利福平、氯霉素、呋喃唑酮培養(yǎng)基上生長, 數(shù)量分別為4.0×102CFU·g-1、1.1×104CFU·g-1、8.0×102CFU·g-1、1.4×104CFU·g-1; 低死亡率環(huán)境中的牡蠣體內(nèi)的細菌僅在慶大霉素、利福平、呋喃唑酮培養(yǎng)基上生長,數(shù) 量 分 別 為 6.0×102CFU·g-1、9.0×103CFU·g-1、1.1×104CFU·g-1。

圖2 不同抗生素培養(yǎng)基生長的細菌數(shù)量Fig.2 The numbers of heterotrophic bacteria and Vibrioin oysters from different farming areas

2.2 牡蠣體內(nèi)耐藥細菌的鑒定及分類

牡蠣體內(nèi)的耐藥細菌經(jīng)添加單種抗生素的藥物平板篩選后, 進一步進行分離、培養(yǎng)、鑒定。如表2所示, 在高死亡率環(huán)境中的牡蠣體內(nèi)分離了64個菌株, 主要來自呋喃唑酮、利福平、慶大霉素、環(huán)丙沙星和氯霉素的培養(yǎng)基; 在中死亡率環(huán)境中的牡蠣體內(nèi)分離了68個菌株, 主要來自呋喃唑酮、利福平、氯霉素、慶大霉素的培養(yǎng)基; 低死亡率環(huán)境中的牡蠣體內(nèi)分離了24個菌株, 主要來自呋喃唑酮、利福平和慶大霉素的培養(yǎng)基。

表2 各養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)的耐藥菌株種屬及數(shù)量Tab. 2 Classification of antibiotic-resistant strains in oysters from different farming areas

根據(jù)表2所示, 高死亡率養(yǎng)殖區(qū)域牡蠣體內(nèi)分離的耐藥菌株主要為: 弧菌屬(Vibrio)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、大洋單胞菌屬(Oceanimonas)、類香味菌屬(Myroides)、海單胞菌屬(Marinomonas)、藤桿菌屬(Tenacibaculum)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、短波單胞菌屬(Brevundimonas); 中死亡率養(yǎng)殖區(qū)域牡蠣體內(nèi)分離的耐藥菌株主要為: 弧菌屬(Vibrio)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、海單胞菌屬(Marinomonas)、大洋單胞菌屬(Oceanimonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、芽孢桿菌屬(Bacillus); 低死亡率區(qū)域牡蠣體內(nèi)分離的耐藥菌株主要為: 弧菌屬(Vibrio)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、希瓦氏菌屬(Shewanella)。

2.3 牡蠣體內(nèi)細菌對不同抗生素的耐藥情況

對牡蠣體內(nèi)分離的耐藥菌進行了16種常用藥物敏感性實驗, 耐藥菌對各藥物的耐藥率如圖3所示。由圖3可知, 異養(yǎng)細菌對β-內(nèi)酰胺類(青霉素、阿莫西林)、糖肽類(萬古霉素)抗生素表現(xiàn)出較高的耐藥率, 平均為69.2%; 對四環(huán)素類(四環(huán)素、多西環(huán)素)的耐藥率平均為31.6%; 對氨基糖苷類(慶大霉素、鏈霉素、新霉素、妥布霉素)的耐藥率平均為20.2%; 對大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素)、氯霉素類的耐藥率平均為14.5%; 對喹諾酮類(諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星)的耐藥率平均為5.1%。

圖3 異養(yǎng)細菌對不同抗生素的耐藥率Fig.3 Resistant rate of bacteria to different antibiotics

低死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)分離的24個菌株對各種抗生素的耐藥性存在差異(表3), 其中對青霉素、萬古霉素、阿莫西林的耐藥率較高, 分別為75%、50%和45.8%, 對妥布霉素、四環(huán)素、鏈霉素、多西環(huán)素的耐藥率介于33.3%～20.8%, 對紅霉素、氯霉素、新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率在10%以下。根據(jù)表3所示, 低死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)分離的菌株的耐藥譜型共17種, 分別為H1～H17, 譜型豐富度為70.8%。H1～H3型對1種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的16.6%; H4、H5型對2種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的25.0%; H6、H7型對3種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的12.5%; H8、H9型對4種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的16.6%; H10～H12型對5種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的12.5%; H13～H15型對6種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的12.5%; H16型對7種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的4.16%; H17型對14種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的4.16%。在低死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣分離的菌株中, 多重耐藥菌株占58.4 %, 多重耐藥指數(shù)(MARI)為0.28。

表3 低死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌的耐藥譜Tab. 3 Antibiotic resistance spectrum of heterotrophic bacteria in oysters in low-mortality farming area

中死亡率養(yǎng)殖區(qū)的牡蠣體內(nèi)分離的68個菌株對16種抗生素的耐藥存在差異, 其中對青霉素、萬古霉素的耐藥率為92.6%, 對阿莫西林、四環(huán)素、多西環(huán)素的耐藥率分別為42.6%、32.3%、27.9%, 對鏈霉素、慶大霉素、紅霉素、新霉素、氯霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率均在15%以下。中死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣分離的菌株的耐藥譜型共30種(表 4), 分別為M1～M30, 譜型豐富度為44.2%。M1～M3型對1種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的4.42%; M4、M5型對2種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的29.4%; M6～M12型對3種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的27.9%; M13～M19型對4種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的16.1%; M20～M23型對5種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的7.35%; M24～M27型對6種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的8.82%; M28、M29型對7種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的2.9%; M30型對8種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的1.47%。在中死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)分離的菌株中, 多重耐藥菌株占66.2%,多重耐藥指數(shù)(MARI)為0.22。

表4 中死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌的耐藥譜Tab. 4 Antibiotic resistance spectrum of heterotrophic bacteria in oysters in medium-mortality farming area

續(xù)表

高死亡率養(yǎng)殖區(qū)的牡蠣體內(nèi)分離的64個菌株對16種抗生素的耐藥存在差異, 其中對青霉素、萬古霉素的耐藥率分別為81.3%、73.4%, 對鏈霉素、阿莫西林和四環(huán)素的耐藥率分別為45.3%、42.3%、43.3%, 對紅霉素、妥布霉素、諾氟沙星、慶大霉素、氯霉素、新霉素和多西環(huán)素的耐藥率為29.7%～21.9%, 對恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率在11%以下。高死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣分離的菌株的耐藥譜型共48種(表5), 分別為D1～D48, 譜型豐富度為75%。D1～D4型對1種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的10.9%; D5型對2種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的9.4%; D6～D15型對3種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的27.9%; D16～D20型對4種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的7.81%; D21～D26型對5種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的14.1%; D27～D35型對6種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的15.6%; D36～D40型對7種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的10.9%; D41型對8種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的3.1%;D42～D46型對9種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的7.8%;D47型對11種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的1.5%; D48型對12種抗生素耐藥, 占總菌數(shù)的3.1%。在高死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)分離的菌株中, 多重耐藥菌株占79.7%, 多重耐藥指數(shù)(MARI)為0.31。

表5 高死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌的耐藥譜Tab. 5 Antibiotic resistance spectrum of heterotrophic bacteria in oysters in high-mortality farming area

續(xù)表

3 討論

3.1 不同死亡率養(yǎng)殖區(qū)的牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌和弧菌數(shù)量分析

異養(yǎng)細菌在養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中有著重要的作用,其生長速度快、周期短、變化快(Zaccone et al, 2002;Huang et al, 2020)。據(jù)報道, 異養(yǎng)細菌能夠指示水體中有機質(zhì)的高低, 在《水環(huán)境監(jiān)測規(guī)范》(SL219-98)中是水體監(jiān)測的必檢項目(謝煜 等, 2017)。異養(yǎng)細菌的數(shù)量及組成的變化可間接地影響?zhàn)B殖動物的健康(González et al, 2003; 駱向萍 等, 2014)。異養(yǎng)細菌中的弧菌廣泛存在于海洋環(huán)境和海洋動物體內(nèi),大多數(shù)病原弧菌具有侵襲貝類的外套膜、鰓、肝胰腺等組織的能力, 從而引起貝類大規(guī)模死亡(張穎雪等, 2019; Xie et al, 2020)。本研究中異養(yǎng)細菌數(shù)量由高到低依次為: 高死亡率養(yǎng)殖區(qū)(8.6×106CFU·g-1)＞中死亡率養(yǎng)殖區(qū)(6.9×106CFU·g-1)＞低死亡率養(yǎng)殖區(qū)(3.3×106CFU·g-1)。高死亡率和中死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌多樣性較豐富, 其中弧菌、發(fā)光桿菌、大洋單胞菌、希瓦氏菌等出現(xiàn)頻率較高; 低死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)分離的異養(yǎng)細菌種類較單一, 主要為發(fā)光桿菌和弧菌。在易引發(fā)海參病害的池塘中,弧菌總數(shù)(3.4×105CFU·g-1)顯著高于正常池塘(2.5×105CFU·g-1)(陳文博 等, 2012)。本研究中高死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)的異養(yǎng)細菌數(shù)量為8.6×106CFU·g-1,弧菌數(shù)量為9.5×105CFU·g-1, 較Wang等(2016)對牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌數(shù)量(5.3×104CFU·g-1)和弧菌數(shù)量(6.0×103CFU·g-1)的周年監(jiān)測結(jié)果高出1～2個數(shù)量級。

環(huán)境因子與異養(yǎng)細菌的數(shù)量有著密切的關系。鐘碩良等(2012)對貝類養(yǎng)殖環(huán)境中異養(yǎng)細菌的研究發(fā)現(xiàn), 異養(yǎng)細菌數(shù)量在不同環(huán)境中的大小排序為:蝦塘養(yǎng)殖區(qū)＞灘涂養(yǎng)殖區(qū)＞淺海養(yǎng)殖區(qū)。根據(jù)凌慧等(2019)對方斑東風螺養(yǎng)殖水體中的細菌數(shù)量研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 異養(yǎng)細菌的數(shù)量與氮氨呈正相關關系, 與亞硝酸鹽氮則呈負相關關系, 弧菌數(shù)量與溫度呈負相關關系。因此, 在后續(xù)的研究中應更多地關注環(huán)境因子對牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌數(shù)量的影響, 了解異養(yǎng)細菌與鹽度、溫度、氮氨等環(huán)境因子之間的關系。本研究中3個不同牡蠣死亡率的采樣點在同一海區(qū),其鹽度、溫度等環(huán)境因素差異不大, 因而從微生物角度出發(fā)探究牡蠣不同死亡率之間的差異。有研究表明異養(yǎng)細菌和弧菌數(shù)量越高, 病害發(fā)生幾率越大(Cao et al, 2015; 董楊 等, 2016)。本研究中弧菌數(shù)量由高到低依次為: 高死亡率養(yǎng)殖區(qū)(9.5×105CFU·g-1)＞中死亡率養(yǎng)殖區(qū)(4.5×105CFU·g-1)＞低死亡率養(yǎng)殖區(qū)(2.5×105CFU·g-1), 牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌數(shù)量和弧菌數(shù)量與死亡率呈正相關關系, 相關系數(shù)分別為0.99和0.93。這表明在水產(chǎn)養(yǎng)殖中弧菌數(shù)量與養(yǎng)殖牡蠣的健康密切相關, 弧菌在異養(yǎng)細菌中占絕大多數(shù), 牡蠣體內(nèi)弧菌數(shù)量越多, 異養(yǎng)細菌豐度越大, 牡蠣發(fā)病死亡的風險就越高。

3.2 不同死亡率養(yǎng)殖區(qū)的牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌耐藥性分析

目前, 針對水產(chǎn)細菌性疾病的主要防治方式是使用抗生素。然而水生動物對抗生素藥物的代謝吸收僅有20%～30%(李兆新 等, 2017), 水生環(huán)境中殘留著大量的抗生素(Chen et al, 2019)。細菌在抗生素的選擇性壓力下發(fā)生自適應突變, 從而細菌耐藥性變強, 甚至出現(xiàn)多重耐藥的“超級細菌”(Huo et al,2010)。據(jù)報道, 水產(chǎn)養(yǎng)殖中細菌對酰胺醇類、四環(huán)素類的耐藥率較高, 而對喹諾酮類的耐藥率較低(王瑞旋 等, 2013; 吳小梅 等, 2015)。本研究中來自各養(yǎng)殖區(qū)的牡蠣所分離的異養(yǎng)細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素(青霉素、阿莫西林)的耐藥率較高, 對大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素)、喹諾酮類(諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星)的耐藥率較低, 這與李炳等(2020)對廣東沿海牡蠣體內(nèi)的細菌耐藥性研究結(jié)果相似。本研究揭示了細菌對青霉素、卡那霉素、克林霉素、呋喃唑酮、阿莫西林及萬古霉素表現(xiàn)出較強的耐藥性。本研究分離的耐藥細菌主要為弧菌屬、發(fā)光桿菌屬、假單胞菌屬、希瓦氏菌屬等革蘭氏陰性(G-)菌, 其細胞壁的肽聚糖含量低, 細胞壁不易受損;青霉素、萬古霉素、阿莫西林等抗生素主要針對革蘭氏陽性(G+)菌細胞壁的肽聚糖, 故耐藥率較高。本研究中, 高死亡率養(yǎng)殖區(qū)的牡蠣所分離的細菌主要來自呋喃唑酮、慶大霉素、利福平、氯霉素和環(huán)丙沙星培養(yǎng)基, 而低死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)的細菌僅在呋喃唑酮、慶大霉素和利福平培養(yǎng)基上生長, 在氯霉素、環(huán)丙沙星和復方新諾明培養(yǎng)基上卻幾乎沒有生長。這一結(jié)果間接反映了不同死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)的細菌耐藥性差異, 高死亡率養(yǎng)殖區(qū)的牡蠣體內(nèi)耐藥細菌數(shù)量多、耐藥譜型較廣; 低死亡率養(yǎng)殖區(qū)的牡蠣體內(nèi)耐藥細菌較少, 對環(huán)丙沙星、氯霉素和復方新諾明等藥物較敏感。

多重耐藥細菌廣泛存在于養(yǎng)殖水體中(Prabhu et al, 2007; Abriouel et al, 2008)。據(jù)寫臘月等(2011)對海水養(yǎng)殖弧菌耐藥性的調(diào)查結(jié)果, 多重耐藥細菌的比例高達80.4%; 王瑞旋等(2012)在對水產(chǎn)致病菌耐藥性的研究中發(fā)現(xiàn), 多重耐藥菌株占68.5%。某些病原菌對抗生素具有廣譜性的耐藥, 其耐藥性可能通過耐藥基因等移動元件水平傳播到其他致病菌,從而進一步威脅水生動物甚至人類的健康(Li et al,2020 )。本研究中由單種藥物篩選分離得到的異養(yǎng)細菌大多數(shù)顯示出多重耐藥性, 其中高死亡率養(yǎng)殖區(qū)的牡蠣體內(nèi)多重耐藥菌占79.7%, 其耐藥譜型(48種)較廣; 中死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)多重耐藥菌占66.2%, 其耐藥譜型為30種; 低死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)多重耐藥菌占58.4%, 其耐藥譜型為17種。Krumperman(1983)在多重耐藥指數(shù)研究中指出, 多重耐藥指數(shù)＞0.2說明細菌可能受到抗生素污染的風險較高。本研究中牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細菌的多重耐藥指數(shù)(MARI)為0.22～0.31, 多重耐藥指數(shù)偏高, 異養(yǎng)細菌可能處于抗生素暴露狀態(tài)。因此, 在生產(chǎn)實踐中應盡可能地減少抗生素的使用, 避免抗生素濫用和污染等情況的出現(xiàn)。

4 結(jié)論

本文研究結(jié)果表明, 不同死亡率環(huán)境中牡蠣體內(nèi)的異養(yǎng)細菌數(shù)量由高到低依次為: 高死亡率養(yǎng)殖區(qū)[(8.6±0.4)×106CFU·g-1]＞中 度 死 亡 率 養(yǎng) 殖 區(qū)[(6.9±0.2)×106CFU·g-1]＞低死亡率養(yǎng)殖區(qū)[(3.3±0.1)×106CFU·g-1]; 弧菌數(shù)量由高到低依次為: 高死亡率養(yǎng) 殖 區(qū)[(9.5±0.4)×105CFU·g-1]＞中 死 亡 率 養(yǎng) 殖 區(qū)[(4.5±0.6)×105CFU·g-1]＞低死亡率養(yǎng)殖區(qū)[(2.5±0.6)×105CFU·g-1]。牡蠣體內(nèi)的弧菌數(shù)量與牡蠣死亡率呈正相關關系, 進一步反映了弧菌數(shù)量越多, 牡蠣死亡的風險越大。本研究分離獲得的耐藥細菌主要為弧菌屬、發(fā)光桿菌屬、假單胞菌屬、希瓦氏菌屬等革蘭氏陰性菌。分離的菌株對β-內(nèi)酰胺類抗生素(青霉素)、糖肽類(萬古霉素) 的耐藥率較高; 對四環(huán)素類(四環(huán)素、多西環(huán)素)的耐藥率次之; 對氨基糖苷類(鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、新霉素)、大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素、氯霉素)、喹諾酮類(諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星)的耐藥率較低。不同死亡率養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)的多重耐藥細菌數(shù)量由高到低依次為: 高死亡率養(yǎng)殖區(qū)(79.7%)＞中死亡率養(yǎng)殖區(qū)(66.2%)＞低死亡率養(yǎng)殖區(qū)(58.4%), 多重耐藥指數(shù)(MARI)為0.22～0.31。牡蠣不同程度的死亡與其體內(nèi)的異養(yǎng)細菌數(shù)量和細菌耐藥性有關, 異養(yǎng)細菌數(shù)量與牡蠣死亡率呈正相關關系, 相關系數(shù)為0.996。