田迪英，畢麗君，董麗娟，張鴻發(fā)

(浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018)

海魚富含二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等不飽和脂肪酸，海魚在加工和貯藏過程中，不飽和脂肪酸易被氧化而產(chǎn)生不良的氣味，是海魚品質(zhì)惡化的主要因素，也是魚類產(chǎn)品貨架期的決定性因素[1-7]。因此，測定分析海魚的脂肪氧化程度，對確保海魚制品的品質(zhì)具有重要意義。

目前測定脂肪氧化大多采用過氧化值（PV）法和硫代巴比妥酸試驗（TBA）法[8-9]，分別是以氫過氧化物和醛含量為指標(biāo)，但這兩種方法均忽略了脂肪氧化產(chǎn)生的小分子揮發(fā)性化合物醇、酮、酸等物質(zhì)[5-6]?，F(xiàn)已證實1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、壬醛等小分子揮發(fā)性物質(zhì)與肉類制品脂肪氧化程度密切相關(guān)[10]，而對于此類揮發(fā)性物質(zhì)與海魚脂肪氧化程度的相關(guān)性研究鮮有報道?；诖耍疚囊哉憬?nèi)常見海魚（黃魚、鰻魚、鱈魚、鯧魚和馬鮫魚）為原料制成魚片，采用Schaal 烘箱加速氧化法進行加速氧化試驗[11-13]，利用SPMEGC-MS 技術(shù)分析揮發(fā)性物質(zhì)含量的變化，與感官評定[14]、TBA 值測定[15]進行比較，以建立評價脂肪氧化程度的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

浙江市場常見海魚：鯧魚、黃魚、鰻魚、鱈魚、馬鮫，購于杭州華商超市。

試劑：己醛、庚醛、1-辛烯-3-醇、壬醛、甲醇（色譜純，上海寶曼生物科技有限公司）；3-辛醇（色譜純，購于Sigma 公司）；三氯乙酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽、氯仿、TBA（分析純）。

1.1.2 儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Thermo 公司），SPME（65 μm DVB/CAR/ PDMS）（Supelco 公司），GG-9123A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司），DHP-9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠），Thermo sorvall RC-6 Plus 冷凍離心機（瑞士）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理、色譜、質(zhì)譜測定條件[6]

冰鮮海魚清洗后切得魚肉，沸水中煮5 min后，取2.5 g 樣品置于15 mL 頂空樣品瓶中，將樣品瓶放于60 ℃恒溫預(yù)處理室預(yù)熱10 min，將萃取頭插入密封的萃取瓶內(nèi)，頂空萃取20 min 后插入氣相色譜進樣口熱解吸5 min，進行氣質(zhì)分析。

色譜條件：ThermoTR-WaxMS 柱（30m×0.25mm×0.25 μm），載氣為氦氣，載氣流速為0.8 mL/min，不分流。進樣口溫度為230 ℃。升溫程序：起始溫度為40 ℃，保持2 min，然后以10 ℃/min 的速率上升至90 ℃，再以4 ℃/min 上升到160 ℃，保持1 min，最后以8 ℃/min 的速率升至230 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊（EI 源），電子能量為70 eV；燈絲發(fā)射電流為200 μA；傳輸桿溫度為250 ℃，離子源溫度為200 ℃，檢測器電壓為350 V；質(zhì)量掃描速率為5 scans/sec，掃描范圍為33～350 m/z。

1.2.2 頂空固相微萃取條件

向15 mL 樣品瓶中加入2 g 樣品、4 mL 純水及內(nèi)標(biāo)物3-辛醇，在(60±0.1) ℃下水浴10 min，頂空萃取20 min，插入氣相色譜進樣口熱解吸5 min后進行SPME-GC-MS 分析。

1.2.3 定性定量方法[16]

歸一法：揮發(fā)性成分通過與NISTDEMO、MAINLIB、REPLIB 標(biāo)準(zhǔn)譜庫數(shù)據(jù)進行比對，且僅對正反相似度均大于800（最大值為1000）的鑒定結(jié)果才予以報道。按峰面積歸一化計算各揮發(fā)性成分在魚肉氣味物質(zhì)中的相對百分含量。

內(nèi)標(biāo)法：配制1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、壬醛系列標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液（3-辛醇）后進行GCMS 測試分析。以外內(nèi)標(biāo)濃度比為橫坐標(biāo)、外內(nèi)標(biāo)面積比為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算試樣中1-辛烯-3 醇、己醛、庚醛、壬醛的含量。

1.2.4 試樣的加速氧化試驗

采用Schaal 烘箱法對海魚進行加速氧化處理。將海魚處理后制成15 g 左右的魚片，晾干后置于（60±1）℃烘箱中加速氧化，每隔3 d 取樣用于SPME-GC-MS 分析揮發(fā)性物質(zhì)含量的變化、TBA 值測定及感官評定。

1.2.5 感官評定

感官評定參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動物性水產(chǎn)制品》（GB 10136—2015）[14]。選擇對氣味相對較為敏感的8 人組成感官評定小組，對加速氧化試驗進行氣味評價。

1.2.6 TBA 值測定[15]

取10 g 絞碎后的魚肉，加入50 mL 7.5%的三氯乙酸（含0.1% EDTA），振搖30 min，過濾，取10 mL 上清液，加入10 mL 0.02 mol/L 硫代巴比妥酸（TBA）溶液，100 ℃水浴30 min，冷卻，以10000 r/min 離心5 min，向上清液中加入10 mL氯仿?lián)u勻，靜置分層，取上清液分別在532 nm 和600 nm 處比色，記錄吸光值，并計算TBA 值。

TBA 值（mg/100g）=（A532－A600）/155×10-1×72.6×100

與TBA 反應(yīng)的物質(zhì)的量（TBA）以每100 g 肉中丙二醛的毫克數(shù)來表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 常見海魚脂肪氧化小分子揮發(fā)物含量測定

脂肪氧化產(chǎn)生的小分子揮發(fā)物1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、壬醛，因閾值較低，在含量較少時有特有的香味，對新鮮魚肉的總體風(fēng)味起到重要的作用[16]。本實驗利用SPME-GC-MS 的歸一法測定了常見新鮮海魚（鯧魚、黃魚、鰻魚、鱈魚、馬鮫）中上述4 種小分子揮發(fā)物的含量，結(jié)果見表1。

表1 常見海魚中4 種小分子揮發(fā)物相對含量Tab.1 Relative contents of four small molecule volatile compounds in common marine fish

由表1 可知，5 種海魚樣品中均檢測到1-辛烯-3 醇、己醛、庚醛、壬醛化合物，其中黃魚中檢出量高于其他魚類。因魚肉氧化變質(zhì)產(chǎn)生“哈喇味”與此類物質(zhì)密切相關(guān)[10]，為客觀建立脂肪氧化分析的新方法，課題組以黃魚為對象，開展加速氧化試驗。測定與脂肪氧化密切相關(guān)的小分子揮發(fā)物1-辛烯-3 醇、己醛、庚醛、壬醛含量，進一步明確脂肪氧化程度與此類小分子化合物的含量關(guān)系。

2.2 黃魚脂肪加速氧化試驗小分子揮發(fā)物含量測定

Schaal 烘箱法是最常用的脂肪加速氧化方法，用以推測試樣的貯藏時間，一般脂肪在（60±1）℃烘箱中1 d，相當(dāng)于常溫下放置1 個月。本實驗對黃魚進行0 d、3 d、6 d、9 d、12 d 和15 d 加速氧化處理，利用SPME-GC-MS 的內(nèi)標(biāo)法定量，對試樣中的1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、壬醛含量進行測定，并進行加標(biāo)回收實驗，結(jié)果見表2、表3、圖1 和圖2。

表2 1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、壬醛的GC-MS 標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.2 Standard GC-MS curves of 1-octene-3-ol,hexanal,heptanal and nonanal

表3 己醛、庚醛、壬醛、1-辛烯-3-醇的GC-MS 回收率Tab.3 The recovery of hexanal,heptanal,nonanal and 1-octene-3-alcohol by GC-MS

圖1 黃魚片加速氧化后1-辛烯-3-醇的含量Fig.1 The content of 1-octene-3-alcohol in the fish fillets of yellow croaker after accelerated oxidation

圖2 黃魚片加速氧化醛類化合物的含量Fig.2 The content of aldehyde compounds content in the fish fillets of yellow croaker after accelerated oxidation

由表2、表3 可知，采用內(nèi)標(biāo)法測定己醛、庚醛、壬醛、1-辛烯-3-醇，其線性范圍均在樣品預(yù)設(shè)的范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2均在0.9947 以上；內(nèi)標(biāo)法的回收率均大于80%，可以滿足樣品中己醛、庚醛、壬醛、1-辛烯-3-醇的測定需求。

由圖1 可知，1-辛烯-3-醇的含量在6～9 d增加明顯，為0～4 d 增加量的1.5 倍左右。1-辛烯-3-醇是花生四烯酸氧化產(chǎn)物，其含量越高，腐敗氣味越強烈，是引起魚類異味的重要組分[17]。Iglesias 等[18]也把1-辛烯-3-醇檢測量用于監(jiān)測冷凍馬鯖魚肌肉脂肪的氧化程度。醛類物質(zhì)是油酸、亞油酸、亞麻酸的氧化產(chǎn)物，己醛在低濃度時呈現(xiàn)蔬菜和水果的清香味，隨著濃度增大，其酸敗味、惡臭味越來越濃[19]。庚醛、壬醛在低濃度時分別呈現(xiàn)類似甜杏、堅果香氣和橙子及玫瑰香味，隨著濃度增高，強烈地令人不快且刺鼻的氣味越來越大[20]。圖2 中醛類物質(zhì)含量亦從第6 天開始均明顯增加，其中己醛上升最為明顯，6～9 d己醛含量增加了0.206 μg/g。醛類物質(zhì)含量增加的原因可能是隨著氧化時間的增加，脂肪水解、氧化程度加快[7-8]，試樣中與脂質(zhì)氧化密切相關(guān)的1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、壬醛等4 種小分子揮發(fā)性化合物含量亦隨之增長。

2.3 SPME-GC-MS 法與感官評定、TBA 值測定比較

本課題組應(yīng)用目前食品行業(yè)普遍使用的感官評定[11]、TBA 值測定[12]對黃魚試樣進行氧化程度分析，以驗證利用SPME-GC-MS 建立的方法是否具有客觀性、可行性。結(jié)果見表4、圖3。

表4 黃魚片加速氧化試驗的感官評定Tab.4 Sensory evaluation of accelerated oxidation test for yellow croaker fillets

圖3 黃魚片加速氧化試驗TBA 值的變化Fig.3 Changes of TBA values in the accelerated oxidation test of yellow croaker fillets

由表4、圖3 可知，試樣加速氧化過程中，隨著氧化時間增加，感官氣味的變化與TBA 值的變化趨勢較為一致，在0～12 d 中，試樣的TBA 值呈上升趨勢，哈喇味也越來越重；TBA 值在6 d 后明顯上升，哈喇味也是明顯發(fā)生變化。

為建立評價脂肪氧化程度的新方法，本研究將SPME-GC-MS 法測定黃魚片加速氧化0～15 d后的己醛、庚醛、壬醛、1-辛烯-3-醇揮發(fā)物含量與TBA 值作了線性回歸方程，其相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9911、0.9625、0.9838、0.9832，均在0.96 以上，相關(guān)性顯著。

采用相似方法測定了鯧魚、鰻魚、鱈魚、馬鮫魚試樣，結(jié)果一致。由此可知，測定海魚脂肪氧化程度不僅可以通過感官氣味評價、TBA 值測定，也可以己醛、庚醛、壬醛和1-辛烯-3-醇的含量作為脂肪氧化變質(zhì)的指標(biāo)，利用SPME-GC-MS 法進行分析評價。相較感官氣味評價，SPME-GCMS 法受人為影響更小，評價結(jié)果更具客觀性。

3 小結(jié)

利用SPME-GC-MS 法測定常見海魚氧化過程中氧化物己醛、庚醛、壬醛、1-辛烯-3-醇含量的變化趨勢，其結(jié)果與感官氣味的變化較為一致，與TBA 值的變化相關(guān)性顯著。海魚脂肪氧化過程較為復(fù)雜，感官評價受主觀性影響，TBA 只檢測產(chǎn)物醛的含量，忽略了醇、酮、酸等含量。SPME-GC-MS 法作為脂質(zhì)氧化分析新方法，己醛、庚醛、壬醛、1-辛烯-3-醇可作為判斷海魚脂肪氧化變質(zhì)度的指標(biāo)，評價脂質(zhì)氧化程度更客觀、全面。