梁曉 陳青 伍春玲 方永軍

摘 ?要：轉錄因子Nrf2對脊椎動物抗氧化酶的調(diào)控起關鍵作用，然而當前Nrf2對害蟲（螨）抗氧化酶調(diào)控功能的相關研究報道較少，本研究擬克隆六點始葉螨轉錄因子EsNrf2，并分析采用RNAi沉默EsNrf2對六點始葉螨取食感螨橡膠樹種質‘IAN2904和抗螨橡膠樹種質‘IRCI12后抗氧化酶EsSOD、EsCAT基因表達水平和超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性的影響。結果表明，采用RACE-PCR從六點始葉螨體內(nèi)克隆得到大小為1719 bp的序列，并經(jīng)同源分析和功能域注釋確證其為六點始葉螨轉錄因子EsNrf2。飼喂?jié)舛葹?0 ng/?L的dsEsNrf2 48 h后對EsNrf2基因的沉默效率達到90.6%，進一步研究發(fā)現(xiàn)，與EsNrf2沉默前相比，EsNrf2沉默后六點始葉螨取食抗、感螨橡膠樹種質后體內(nèi)EsSOD和EsCAT的基因表達量、SOD和CAT酶的活性均顯著降低（P<0.05）。上述結果從分子水平證明EsNrf2能夠調(diào)控六點始葉螨抗氧化酶SOD和CAT的表達。

關鍵詞：RNAi;六點始葉螨;轉錄因子Nrf2;抗氧化酶;調(diào)控功能

Abstract： The transcription factor Nrf2 （Nuclear factor erythroid 2-related factor） plays a key role in regulating antioxidant enzymes in vertebrates. However， there are few reports regarding the Nrf2 function of insects （mites）. This study aimed to clone the Nrf2 gene of Eotetranychus sexmaculatus （EsNrf2）， furthermore， after EsNrf2 was silenced via RNA interference （RNAi）， the transcription of EsSOD and EsCAT and enzyme activity of SOD and CAT was analyzed while E. sexmaculatus feeding on mite-susceptible rubber tree germplasm ‘IAN2904 and mite-resistant rubber tree germplasm ‘IRCI12， respectively. The results showed a sequence 1719 bp long was cloned using RACE-PCR， and then it was identified as transcription factor EsNrf2 by homology analysis and conserved domain. In addition， it was found that EsNrf2 silencing efficiency could reach 90.6% after feeding 50 ng/?L of dsEsNrf2 for 48 hours. Further analysis showed that， compared with those before silencing， the transcription of EsSOD and EsCAT as well as the activity of SOD and CAT were significantly reduced after RNAi of EsNrf2 （P < 0.05）. The above results showed that EsNrf2 could regulate the expression of SOD and CAT in E. sexmaculatus.

Keywords： RNAi; Eotetranychus sexmaculatus; transcription factor Nrf2; antioxidant enzymes; regulation function

天然橡膠是我國重要的戰(zhàn)略物資，在國防和國民經(jīng)濟建設中具有不可替代的作用。我國是世界上第一大天然橡膠消費國和進口國，對外依存度已超過80%，天然橡膠安全問題的嚴峻性十分突出[1-2]。六點始葉螨（Eotetranychus sexmaculatus）是危害我國橡膠樹最嚴重的一種世界危險性害螨，2008年以來六點始葉螨在海南、云南多地的橡膠樹上暴發(fā)成災，導致大量葉子變黃脫落、開割樹停割，膠乳產(chǎn)量急劇下降[3]。當前，各橡膠產(chǎn)區(qū)對于該螨的防治仍依賴于化學藥劑防治，但橡膠樹高大，藥劑難以靶標，防治難度很大，特別是藥劑防治過程中因施藥技術落后所致農(nóng)藥的有效利用率不足、使用頻率與劑量不斷加大和“3R”等問題嚴重[4]。因此，尋求有效的控制橡膠害螨且符合環(huán)保要求的新的防治策略和防治方法，成為當前我國天然橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟待解決的重要課題。

培育抗性品種是防治橡膠害螨最經(jīng)濟、最有效、最簡便的方法，而研究害螨取食不同橡膠樹種質后對其生理生化的影響能夠為抗螨種質資源的鑒定、評價與創(chuàng)新，以及害螨的高效防治技術研究提供重要科學依據(jù)。前期研究中從國家天然橡膠樹種質資源圃核心種質中篩選出‘IRCI12‘IAN29042份種質分別對六點始葉螨表現(xiàn)出穩(wěn)定良好的抗、感特性[4]。相關研究表明，害蟲（螨）體內(nèi)抗氧化酶的活性變化與其取食寄主作物的適應性密切相關[5-9]。前期研究也發(fā)現(xiàn)，抗螨種質能顯著抑制六點始葉螨抗氧化酶活性，例如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性，轉錄因子Nrf2（Nuclear factor erythroid 2-related factor， Nrf2）對脊椎動物抗氧化酶的調(diào)控起關鍵作用[10]，但目前為止Nrf2調(diào)控害螨抗氧化酶的相關報道很少。本研究擬從六點始葉螨體內(nèi)克隆EsNrf2，然后采用RNAi技術沉默EsNrf2對六點始葉螨取食抗、感橡膠樹種質時抗氧化酶基因表達水平和酶活性的影響，從分子水平解析EsNrf2對六點始葉螨抗氧化酶的調(diào)控功能，為橡膠樹害螨的高效綜合防控提供新的解決方案。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試橡膠樹種質 ?選用遺傳穩(wěn)定的抗螨參照橡膠樹種質‘IRCI12和感螨參照橡膠樹種質‘IAN2904為試驗材料[4]?！甀RCI12和‘IAN2904均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所國家橡膠種質資源圃提供。

1.1.2 ?供試六點始葉螨 ?供試六點始葉螨為實驗室以感螨參照橡膠樹種質‘IAN2904新鮮葉片繼代飼養(yǎng)的室內(nèi)種群。將六點始葉螨雌成螨分別接于橡膠樹葉背面，并將葉子放置于長25?cm、寬19 cm的白瓷盤中濕潤海綿上方，同時以濕潤吸水紙圍攏于葉片周圍以防止試螨逃離，每隔3～5 d更換葉片以保證材料新鮮。飼養(yǎng)條件為：溫度（25±1）℃，相對濕度（75±5）%，光照周期14（L）∶10（D）的人工氣候箱中。

1.1.3 ?供試試劑 ?組織勻漿機、高速冷凍離心機、Bio-Rad qPCR系統(tǒng)（Bio-Rad， USA）等。RNA提取及酶活測定相關試劑均購自Sigma公司，SMART RACE試劑盒購自Clontech公司（美國），MEGAscript? RNAi試劑盒購自Ambion公司（美國），cDNA合成試劑盒、Master mix、MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒均為Fer mentas公司產(chǎn)品（Fermentas， Glen Burnie， MD）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?六點始葉螨EsNrf2基因的克隆 ?從實驗室前期構建的六點始葉螨轉錄組數(shù)據(jù)庫中篩選獲得的疑似EsNrf2基因的部分序列信息設計5RACE和3RACE引物（表1），利用SMART RACE試劑盒分別擴增得到EsNrf2基因5和3端序列，序列經(jīng)測序后進行拼接得到完整的cDNA序列，根據(jù)ORF Finder軟件預測的編碼區(qū)（coding sequence， CDS）設計引物（表1）進行PCR擴增、測序得到EsNrf2編碼區(qū)全長序列。EsNrf2基因克隆的PCR程序如下：94?℃預變性5 min;94?℃變性30 s，65?℃退火30 s（每個循環(huán)降低1?℃），72?℃延伸2 min，10個循環(huán);94?℃變性30 s，58?℃退火30 s，72?℃延伸2 min，20個循環(huán);最后72?℃再延伸10 min。

1.2.2 ?六點始葉螨EsNrf2與不同昆蟲（螨）Nrf2基因的序列比對 ?將六點始葉螨Nrf2氨基酸序列（基因登錄號：MT134458）與NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中已經(jīng)發(fā)布的12種不同昆蟲（螨）[包括二斑葉螨（Tetranychus urticae）、中華蜜蜂（Apis cerana）、意大利蜜蜂（Apis mellifera）、松葉蜂（Neodiprion lecontei）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、大紅斑蝶（Danaus plexippus）、乳草蝽（Oncopeltus fasciatus）、小菜蛾（Plutella xylostella）、草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、致倦庫蚊（Culex quinquefasciatus）、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）]的Nrf2氨基酸序列進行序列比對。采用DNAman 9.0軟件進行序列比對，并同時構建不同昆蟲（螨）Nrf2基因的系統(tǒng)進化樹。利用在線網(wǎng)站https：//web.expasy.org/ protparam/預測各個Nrf2基因的保守功能結構域。利用在線軟件Weblogo（http：//weblogo.berkeley. edu/logo.cgi）繪制Nrf2基因保守功能結構域。

1.2.3 ?RNAi介導的六點始葉螨EsNrf2基因沉默 ?以六點始葉螨EsNrf2基因CDS全長序列為模板，利用在線引物設計軟件E-RNAi（http：//www. dkfz.de/signaling/e-rnai3/idseq.php）設計引物合成雙鏈RNA（dsRNA）用于EsNrf2的基因沉默。設計好的引物5端添加T7啟動子序列（表1），以綠色熒光蛋白（GFP）序列為模板合成雙鏈RNA dsGFP，并以此作為RNAi介導的六點始葉螨EsNrf2基因沉默的對照，dsRNA的合成方法參照MEGAscript? RNAi試劑盒說明書。參照Shi等[11]建立的飼喂法對六點始葉螨飼喂dsRNA（dsEs Nrf2和dsGFP）進行基因沉默，dsEsNrf2飼喂的濃度設置為50、100和200 ng/?L，dsGFP飼喂的濃度為200?ng/?L，分別于飼喂24、48、96?h后采集六點始葉螨樣品用于RNA提取，隨后采用RT-qPCR分析EsNrf2表達量的變化（引物參見表1），以確定最佳的dsRNA飼喂?jié)舛群蜁r間。每個處理設置3個重復，每個重復約50頭螨。

1.2.4 ?沉默EsNrf2對六點始葉螨死亡率的影響 ?根據(jù)1.2.3中確定的dsRNA最佳飼喂?jié)舛群蜁r間沉默六點始葉螨EsNrf2，并觀察EsNrf2基因沉默對六點始葉螨取食抗螨橡膠樹種質‘IRCI12和感螨橡膠樹種質‘IAN2904對死亡率的影響，連續(xù)觀察7?d，以明確EsNrf2基因沉默對死亡率影響不顯著的臨界時間點。

1.2.5 ?沉默EsNrf2對六點始葉螨SOD和CAT基因表達和酶活性的影響 ?根據(jù)1.2.4確定的對害螨死亡率影響不顯著的時間范圍，分析沉默EsNrf2對六點始葉螨取食抗、感橡膠樹種質后EsSOD和EsCAT基因表達量、SOD和CAT酶活性的影響。采用RT-qPCR進行EsSOD和EsCAT基因表達量分析，以六點始葉螨actin基因作為內(nèi)參（引物參見表1），重復3次，每個重復50頭螨，PCR反應條件為：95?℃預溫育1 min后，以40個循環(huán)完成如下程序：95?℃變性15?s，60?℃退火15?s，72?℃延伸20?s。根據(jù)Pfaffl的2?ΔΔCt方法計算基因的相對表達量[12]。SOD和CAT酶的活性測定分別參照Lu等[13]的方法，重復3次，每個重復200頭螨。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件中的Duncans新復極差法進行數(shù)據(jù)間的多重比較以及差異顯著性分析，顯著性水平α=0.05。RT-qPCR分析相對表達量的變化情況，以對照或處理前的表達量設置為1.0，處理后的表達量以相對對照或者處理前的倍數(shù)或者百分率表示。

2 ?結果與分析

2.1 ?六點始葉螨EsNrf2基因的克隆

由5和3RACE-PCR分別獲得2條大小約為1500?bp的基因片段（圖1），測序結果表明這2個片段可能分別為六點始葉螨EsNrf2基因的5和3端序列，序列經(jīng)測序拼接后得到六點始葉螨EsNrf2 cDNA全長。采用CDS引物進一步通過PCR擴增、測序得到全長為1719?bp的六點始葉螨EsNrf2基因（圖2）。

2.2 ?六點始葉螨EsNrf2基因與不同昆蟲（螨）Nrf2基因的序列比對

序列比對結果表明，盡管不同昆蟲（螨）之間的Nrf2氨基酸序列總體相似度不高，但蛋白質結構預測分析結果表明，Nrf2轉錄因子特有的保守序列即DNA結合域（DNA binding domain）（圖3，圖4）與不同昆蟲（螨）的相似度在90.2%～96.7%之間（圖4B）。功能域注釋結果表明克隆獲得的六點始葉螨EsNrf2同樣具有該保守功能區(qū)，并且與二斑葉螨TuNrf2（XP_015783848.1）的序列相似度最高，達到96.7%，在進化上聚類于同一分支（圖4A）。上述序列比對結果表明克隆得到的基因序列確定為六點始葉螨EsNrf2基因。

2.3 ?不同dsRNA飼喂?jié)舛群蜁r間對六點始葉螨EsNrf2基因沉默效率的影響

圖5結果表明，dsEsNrf2分別以濃度為50、100、200 ng/?L飼喂六點始葉螨24 h后，EsNrf2的基因表達量與飼喂dsGFP對照的相比顯著降低，分別為對照的36.4%、34.6%和24.0%，而飼喂48?h和96?h后EsNrf2表達量進一步降低，僅分別為對照的9.4%、7.9%、7.8%和10.3%、8.5%、8.7%，對應的沉默效率達到90.6%、92.1%、92.2%和89.7%、91.5%、91.3%，并顯著低于對照和飼喂不同濃度dsEsNrf2 24 h后的表達水平。由于飼喂不同濃度dsEsNrf2 48 h和96 h后各處理間的沉默效率無顯著差異，因此飼喂50?ng/?L的dsEsNrf2黑框部分序列為不同物種Nrf2的DNA結合區(qū)域。

2.4 ?沉默EsNrf2對六點始葉螨死亡率的影響

圖6結果表明，無論轉錄因子EsNrf2沉默與否，六點始葉螨取食感螨橡膠樹種質‘IAN29041～3 d內(nèi)，死亡率始終維持在低于10%的水平，而3 d后沉默了EsNrf2的害螨死亡率急劇升高，到7?d時達到78.9%。而盡管EsNrf2未被沉默，六點始葉螨取食抗螨橡膠樹種質‘IRCI127?d后，死亡率依然到達48.8%，EsNrf2沉默后取食‘IRCI121～7?d內(nèi)死亡率持續(xù)升高，7?d后達到100%。由于在取食抗、感螨橡膠樹種質2?d（48 h）內(nèi)，六點始葉螨死亡率均低于10%，因此，為保證足夠的害螨來源用于分析EsNrf2沉默后六點始葉螨取食抗、感螨種質對體內(nèi)SOD和CAT基因表達量和酶活性的影響，分析的時間點選擇取食后48 h。

2.5 ?沉默六點始葉螨轉錄因子Nrf2對抗氧化酶基因表達的影響

沉默六點始葉螨轉錄因子EsNrf2前，六點始葉螨取食感螨橡膠樹種質‘IAN290448?h后EsSOD和EsCAT的基因表達量和取食前相比均無顯著差異，而取食抗螨感橡膠樹種質‘IRCI12后這2個基因的表達量顯著分別降至取食前的0.53倍和0.48倍。沉默EsNrf2后，六點始葉螨取食‘IAN2904后EsSOD和EsCAT的基因表達量分別顯著降至取食前的0.45倍和0.46倍，取食‘IRCI12后這2個基因的表達量降低幅度與取食前相比差異更為顯著，分別為取食前的0.24倍和0.26倍（圖7）。上述結果表明沉默轉錄因子EsNrf2后會對EsSOD和EsCAT基因產(chǎn)生顯著的抑制作用。

2.6 ?沉默六點始葉螨轉錄因子Nrf2對抗氧化酶活性的影響

沉默六點始葉螨轉錄因子EsNrf2前，六點始葉螨取食感螨橡膠樹種質‘IAN290448 h后SOD和CAT酶活性和取食前相比均無顯著差異，分別為85.2 U/mg和38.6 U/mg，而取食抗螨感橡膠樹種質‘IRCI12后這2個抗氧化酶的活性分別顯著降至38.1 U/mg和23.1 U/mg。沉默EsNrf2后，六點始葉螨取食‘IAN2904后SOD和CAT酶活性分別顯著降至46.2 U/mg和19.6 U/mg，取食‘IRCI12后這2個酶活性降低幅度與取食前相比差異更為顯著，僅分別為26.4?U/mg和12.3?U/mg（圖8）。上述結果表明，沉默轉錄因子EsNrf2后會對SOD和CAT酶活性產(chǎn)生顯著的抑制作用，這與其對應的基因表達量的變化趨勢表現(xiàn)一致。

3 ?討論

六點始葉螨轉錄因子EsNrf2的基因表達量與抗氧化酶基因的表達量、抗氧化酶酶活變化趨勢相一致，從分子水平初步證實了EsNrf2對抗氧化酶具有調(diào)控功能。前期研究表明，六點始葉螨取食抗螨橡膠樹種質‘IRCI12后SOD和CAT酶活受到顯著抑制，而取食感螨橡膠樹種質后這2個酶活性無顯著變化[4， 13]。本研究在前期研究基礎上進一步采用RNAi沉默EsNrf2，發(fā)現(xiàn)六點始葉螨取食‘IRCI12后SOD和CAT酶活性受抑制程度與未沉默對照相比還能進一步顯著提高，而取食‘IAN2904后這2個酶活性也被顯著抑制，這進一步證實了EsNrf2對SOD和CAT的調(diào)控功能。此外，前期針對朱砂葉螨轉錄因子TcNrf2的研究表明，抑制劑、激活劑處理能夠顯著降低或提高TcNrf2的基因表達水平，并進而抑制或誘導抗氧化酶SOD和CAT的基因表達和酶活性[14]，本研究結果表明EsNrf2和TcNrf2在進化上屬于同一分支，而研究結果進一步證實Nrf2基因調(diào)控抗氧化酶的功能在這2種害螨上具有一致性。事實上，Nrf2基因調(diào)控抗氧化酶基因表達的功能已經(jīng)在多個模式生物中被驗證，研究者采用特異性化合物處理、RNAi、基因敲除等手段干預Nrf2基因從而影響了下游抗氧化酶基因表達水平，這在小鼠[15-17]、果蠅[18-19]、斑馬魚[20-21]等研究中已有多個成功案例，本研究進一步拓展了Nrf2基因功能的適用物種范圍。

研究轉錄因子Nrf2對抗氧化酶的調(diào)控功能，能夠為害蟲（螨）的綠色防控策略的制定提供新的思路。Nrf2作為應對外界應激和脅迫的中央轉錄因子，除了能夠調(diào)控抗氧化酶，同時也能調(diào)控解毒酶，例如細胞色素P450酶、谷胱甘肽轉移酶，以及其他一些保護蛋白的表達[18]，是潛在的害蟲防控的新靶點。通過對轉錄因子Nrf2進行干預，破壞其對保護性酶和蛋白的調(diào)控功能，能夠最大限度削弱害蟲對氧化損傷的修復能力以及對有毒物質的解毒能力。在果蠅的Nrf2研究中，已有學者提出該基因可能在害蟲抗藥性治理中具有較大應用前景[22-23]，但目前該理論尚缺乏實踐基礎。本研究僅從轉錄水平證實抑制和激活轉錄因子EsNrf2的表達對下游抗氧化酶基因表達的影響，后續(xù)研究應進一步證實EsNrf2對解毒酶等其他相關酶系的調(diào)控功能，以期為將來把EsNrf2作為害蟲（螨）防治靶標提供理論依據(jù)。

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責任編輯：謝龍蓮