周東月 關(guān)敬 付博 孫群宙 趙美雅 劉露 張國斌 姜爽

摘要 [目的]考察黃精多糖的制備工藝及體外抗氧化作用。[方法]采用水提醇沉法提取黃精多糖，以多糖提取率為評價指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用正交試驗優(yōu)化最佳提取工藝。測定黃精多糖對DPPH、超氧陰離子、羥基自由基的清除能力，以及黃精多糖對三價鐵的還原能力。[結(jié)果]最佳提取工藝條件為黃精藥材粒度80目、料液比1∶25、pH 9、提取時間3.0 h。黃精多糖對DPPH、超氧陰離子、羥基自由基均有較強的清除能力，且清除能力隨多糖濃度的升高而增大;黃精多糖對三價鐵的還原能力與濃度成正相關(guān)。[結(jié)論]確定了水提醇沉法的最佳工藝參數(shù)，證明了黃精多糖具有較強的體外抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 黃精多糖;提取工藝;正交試驗;體外抗氧化

中圖分類號 R-284? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）13-0180-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.045

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on Extraction Technology and Antioxidant Activity in vitro of Polygonatum Polysaccharide

ZHOU Dong yue， GUAN Jing， FU Bo et al

（Changchun University of Chinese Medicine，Changchun， Jilin 130117）

Abstract [Objective] To investigate the preparation technology of Polygonatum polysaccharide and its anti oxidant effect in vitro. [Method]Using water extraction and alcohol precipitation method to extract polysaccharides from Polygonatum odoratum， using Polygonatum odoratum polysaccharide extraction rate as an evaluation index， and using orthogonal experiment to optimize process conditions based on single factor experiment to determine the best process. The scavenging ability of Polygonatum polysaccharide on DPPH， superoxide anion and hydroxyl radical， and the reducing ability of Polygonatum polysaccharide on trivalent iron were determined. [Result] The optimal process conditions were that the particle size of Polygonatum medicinal material was 80 mesh， the ratio of material to liquid was 1∶25， pH 9， and the extraction time was 3.0 h. Polygonatum polysaccharides had strong scavenging ability for DPPH， superoxide anion and hydroxyl radical， and the scavenging ability varied with the concentration of polysaccharides. The reduction ability of Polygonatum polysaccharides to trivalent iron was also positively related to the concentration. [Conclusion] The optimal process parameters of the water extraction and alcohol precipitation method were determined， and Polygonatum polysaccharide had strong antioxidant activity in vitro.

Key words Polygonatum polysaccharide;Extraction process;Orthogonal test;In vitro antioxidant

黃精（Rhizom polyonati）為百合科植物滇黃精（Polyonatum kingianum Coil et Hemsl）、黃精（Polyonatum sibiricum Redoute）、多花黃精（Polyonatum cyrtonem Hua）的干燥根莖，味甘、性平，歸脾肺腎經(jīng)，在我國南方分布廣泛[1]。黃精草藥同源，在我國當(dāng)前的大流行緊急情況下作為治療COVID-19的替代藥物成分，但其機制尚不清楚[2]。隨著黃精在藥理學(xué)、藥物化學(xué)和臨床研究方面的應(yīng)用，其活性部位和有效成分成為新藥研究和開發(fā)的熱點。黃精含有多種化學(xué)成分，包括多糖、生物堿、甾體皂苷、三萜、木脂素、類黃酮、植物甾醇等[3-6]。其中，黃精多糖是黃精主要生物學(xué)活性成分之一，應(yīng)用廣泛，具有增強免疫力、抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)血脂和改善內(nèi)皮功能等作用[7-9]。該研究采用水提、醇沉法提取黃精多糖，優(yōu)化提取工藝，探討其體外抗氧化作用，旨在為黃精多糖的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材和試劑

黃精藥材、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海源葉生物科技有限公司;苯酚、三氯化鐵，購自西隴科學(xué)股份有限公司;濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇，購自北京化工廠;pH試紙，購自鄭州市津北化工有限公司;DPPH、硫酸亞鐵，購自上海麥克林生化科技有限公司;VC，購自天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司;過氧化氫，購自天津市福晨化學(xué)試劑廠;水楊酸，購自天津百倫斯生物技術(shù)有限公司;Tris，購自上?？蒲派锟萍加邢薰?鄰苯三酚，購自西安天茂化工有限公司;鐵氰化鉀，購自天津市興復(fù)科技發(fā)展有限公司;三氯乙酸，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;磷酸鹽緩沖液，購自上海力辰儀器科技有限公司。

1.2 主要儀器

藥篩，購自安平縣拓通絲網(wǎng)制品有限公司;粉碎機，購自浙江紅景天工貿(mào)有限公司;恒溫水浴鍋，購自常州市國旺儀器制造有限公司;紫外分光光度計，購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;電子天平，購自德國賽多利斯公司;烘箱，購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司;離心機，購自長沙湘智離心機儀器有限公司;凍干機，購自東京理化器械株式會社。

1.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)品100 mg，定容至100 mL。取出1 mL定容于10 mL容量瓶中，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至具塞試管中，分別加蒸餾水至2 mL，每管加入5%苯酚1 mL、濃硫酸5 mL，振蕩混勻后置于沸水浴中加熱15 min，取出后在流動自來水中冷卻至室溫，于紫外可見光分光光度計490 nm處測吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=6.700 0X-0.004 2，R2=0.999 2（圖1）。

1.4 黃精多糖的提取工藝

黃精藥材55 ℃干燥→粉碎→過篩→精密稱取藥材粉末→加水浸提→抽濾→濾液調(diào)整醇沉濃度為80%→4 000 r/min離心10 min→凍干→配制待測溶液→苯酚-濃硫酸法測定吸光度→計算粗多糖提取率。

1.5 單因素試驗

精密稱取黃精藥材粉末5 g于100 ℃水浴回流提取，趁熱抽濾，將濾液調(diào)整至醇濃度為80%，混勻，4 000 r/min離心10 min，沉淀凍干，得黃精粗多糖。適當(dāng)稀釋樣品，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算粗多糖濃度，從而算出多糖提取率。分別考察不同粒度（10、14、50、80、100目）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、pH（3、5、7、9、11）、提取時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對黃精多糖提取率的影響。

1.6 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果進行L9（34）正交試驗，因素水平設(shè)計見表1。

1.7 體外抗氧化試驗

1.7.1 DPPH自由基清除能力測定。

取2.0 mL不同濃度（0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL）的黃精多糖溶液于試管中，分別加入0.1 mmol/L DPPH溶液2.0 mL，充分混勻后避光反應(yīng)20 min，在517 nm處測定吸光度Ai。VC作陽性對照;對照組以無水乙醇代替DPPH，測定吸光度Aj;以蒸餾水代替多糖溶液作為空白組，測定吸光度為Ao。

DPPH自由基清除率=（Ao-Ai+Aj）/Ao×100%

1.7.2 羥基自由基清除能力測定。

取2.0 mL不同濃度（0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL）的黃精多糖溶液于試管中，依次加入6 mmol/L硫酸亞鐵2.0 mL、6 mmol/L雙氧水2.0 mL，混勻后靜置10 min，各加入6 mmol/L水楊酸-無水乙醇2.0 mL，混勻后再靜置30 min，于510 nm處測吸光度Ai;以無水乙醇代替水楊酸測吸光度Aj;VC作陽性對照;以蒸餾水代替黃精多糖溶液作為空白組，測定吸光度Ao。

羥基自由基清除率=（Ao-Ai+Aj）/Ao×100%

1.7.3 超氧陰離子清除能力測定。

取4.5 mL Tris-HCl（pH 8.2）緩沖液，25 ℃水浴20 min后，分別加入1.0 mL不同濃度（0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL）的黃精多糖溶液，再加入25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.4 mL，充分混勻后，于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，然后加入1 mL 8 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，最后在299 nm處測定吸光度Ai;空白組以蒸餾水代替多糖溶液，測定吸光度Ao;樣品對照組用蒸餾水代替鄰苯三酚、鹽酸，測定吸光度Aj;VC作陽性對照;用蒸餾水做空白調(diào)零。

超氧陰離子自由基清除率=（Ao-Ai+Aj）/Ao×100%

1.7.4 還原能力測定。

分別取2.5 mL不同濃度（0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL）的黃精多糖溶液于試管中，依次加入pH 6.6磷酸鹽緩沖液2.5 mL、1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻，50 ℃恒溫20 min后加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，然后以3 000 r/min離心10 min，取上層清液5 mL，再依次加入蒸餾水5 mL、0.1%三氯化鐵溶液1 mL，于700 nm處測定吸光度;VC作陽性對照。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±方差（±s）表示，采用Sigma Plot 13軟件作圖，SPSS Statistics 24軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

由圖2a可知，當(dāng)黃精藥材粒度為80目時，黃精多糖提取率最高，因此選擇50、80、100目3個水平。由圖2b可知，當(dāng)料液比為1∶25時，黃精多糖提取率最高，因此選擇料液比1∶20、1∶25、1∶30 3個水平。由圖2c可知，當(dāng)pH為9時，黃精多糖提取率最高，因此選擇pH為7、9、11。根據(jù)圖2d可知，當(dāng)提取時間為2.5 h時，黃精多糖提取率最高，因此提取時間選擇1.0、2.0、3.0 h。

2.2 正交試驗結(jié)果

由表2可知，影響水提醇沉法提取黃精多糖提取率的主次因素依次為提取時間（D）、粒度（A）、料液比（B）、pH（C），其中因素D具有極顯著影響，因素A、B對提取過程有顯著影響，因素C對試驗影響較小，最終確定最佳工藝條件為A2B2C2D3，即黃精藥材粒度80目、料液比1∶25、pH 9、提取時間3.0 h。

2.3 體外抗氧化試驗結(jié)果

2.3.1 對自由基的清除能力。

從圖3可見，黃精多糖對DPPH、羥基自由基、超氧陰離子的清除率具有濃度依賴性，清除率隨濃度的升高而增加。當(dāng)黃精多糖濃度為6.0 mg/mL時，對DPPH的清除能力為（38.24±0.14）%，且隨著濃度的升高，清除率無明顯變化;當(dāng)黃精多糖濃度為4.0 mg/mL時，對超氧陰離子的清除能力為（16.93±0.11）%，且隨著黃精多糖濃度的升高，清除率無明顯變化;當(dāng)黃精多糖濃度為6.0 mg/mL時，對羥基自由基的清除能力為（37.98±0.12）%，且隨著劑量增加，清除率無明顯變化;但與VC相比，黃精多糖對氧化自由基的清除能力仍有較大差距。

2.3.2 對三價鐵的還原能力。由圖4可知，黃精多糖對三價鐵具有一定的還原能力，且隨著黃精多糖濃度的升高，對三價鐵的還原能力逐漸增大，但其還原能力明顯弱于Vc。

3 討論

（1）相關(guān)研究表明，細(xì)胞[10]和組織的氧化損傷[11]在人類病理生理中廣泛涉及，其中，癌癥[12-13]、衰老[14-15]等疾病大多與產(chǎn)生過量自由基有關(guān)。人類飲食中含有重要的微量營養(yǎng)素，例如VC[16]、VE[17]和類胡蘿卜素[18]，對維持人類健康至關(guān)重要。其中，VC廣泛分布于水果和蔬菜中，它們是飲食攝入的主要來源，因此，飲食途徑是調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗氧化劑保護的有效手段。然而，在全球食品工業(yè)中，目前使用的抗氧化劑主要是人工合成。合成抗氧化劑都有一定的毒性，這使得天然抗氧化劑越來越受歡迎。天然抗氧化劑來源于天然中草藥，不僅能保護身體組織免受氧化損傷，還能延緩衰老，預(yù)防與衰老有關(guān)的疾病。多糖類化合物是人類飲食中的重要成分和體外清除自由基的有效物質(zhì)，其體內(nèi)抗氧化活性不同于其體外自由基清除能力[19-27]。

（2）筆者研究了黃精多糖的提取工藝及體外抗氧化活性，為黃精多糖開發(fā)利用研究提供理論依據(jù)。鑒于黃精多糖較廣泛的藥用價值，研究合理的純化工藝并應(yīng)用批量生產(chǎn)，使黃精多糖更廣泛地發(fā)揮作用具有重要意義。

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