王亞茹, 田寶玉, 張碧堯, 范競文, 戈 峰, 王國紅,*

1 福建師范大學生命科學學院,細胞逆境響應與代謝調控福建省高等學校重點實驗室, 福州 350108 2中國科學院動物研究所,農業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室, 北京 100101

昆蟲腸道中定殖著大量的微生物,在昆蟲食物消化和營養(yǎng)代謝中發(fā)揮著重要的功能,是調控宿主生物學性狀和生態(tài)適應性的重要因素[1- 2]。大量的研究結果表明,昆蟲腸道微生物數量和組成與宿主的食物密切相關。一方面,腸道微生物是宿主食物分解和消化的主要參與者,為宿主提供碳水化合物、維生素、氨基酸等營養(yǎng)和能量；另一方面,食物的結構和化學組成又影響腸道微生物的群落結構和功能[2]。采用桑葉飼養(yǎng)的家蠶(Bombyxmori),其腸道微生物種群比較一致,而采用不同人工飼料飼養(yǎng)的家蠶的腸道優(yōu)勢菌群有差異；相比于人工飼料,桑葉飼養(yǎng)的家蠶腸道微生物菌群更為豐富[3]。取食人工飼料和不同植物的小菜蛾(Plutellaxylostella)腸道細菌群落存在顯著差異,小菜蛾腸道菌群在群落結構和代謝功能兩方面均能協助宿主昆蟲適應不同的食物[4]。因此,食物是決定昆蟲腸道微生物種類和組成的重要因素之一[4- 6]。

蟑螂是雜食性昆蟲,不同種類的蟑螂食性有一定的差異,食物的成分和含量對蟑螂的引誘、腸道菌群、營養(yǎng)和代謝產生影響[2,5,7- 8]。在發(fā)展蟑螂餌劑的研究中發(fā)現：餌料的營養(yǎng)組分是影響蟑螂取食量的重要因素, 蟑螂優(yōu)先選擇蛋白含量較高的餌劑[9]。本文前期研究也表明：餌料的蛋白含量影響德國小蠊雄成蟲氮素營養(yǎng)利用效率。取食含25%—45%蛋白的餌料時,有利于雄成蟲氮素營養(yǎng)利用；而高蛋白含量(65%)餌料增加德國小蠊代謝負擔,不利于對食物的利用[7]。餌料蛋白水平過高也導致德國小蠊腸道菌群多樣性、交配成功率和繁殖能力的下降[6, 8]。Yun 等發(fā)現野生德國小蠊與實驗室喂養(yǎng)的德國小蠊相比,其腸道細菌具有更豐富的多樣性,原因可能在于野生蟑螂食物高度多樣化,多樣化的食物能夠提供蟑螂腸道細菌代謝所需的不同底物[10]。眾所周知,蛋白質和氨基酸是昆蟲食物的主要氮素營養(yǎng),是影響宿主腸道微生物的主要因素[11- 12]。利用人工飼料飼養(yǎng)美洲大蠊(Periplanetaamericana)有利于擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)細菌的生長；不同飼料組成可以調節(jié)腸道細菌的群落組成和物種多樣性；美洲大蠊取食高纖維食料時,厚壁菌門細菌數量顯著增加；而取食高蛋白食料時,則促進其他細菌種群數量的增加[13-14]。利用不同蛋白含量的餌料喂養(yǎng)德國小蠊(Blattellagermanica)的雌蟲,Pérez-Cobas 等發(fā)現菌群組成與特定的食物有關,腸道菌群在蟑螂氮源營養(yǎng)代謝中發(fā)揮重要的作用[6]。已有研究發(fā)現：昆蟲不同蟲態(tài)和性別間腸道菌群有差異[15-16]。如海灰翅夜蛾(Spodopteralittoralis)雌性成蟲腸道以腸球菌屬(Enterococcus)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)和泛菌屬(Pantoea)為主；雄性成蟲則不同,其腸道菌群幾乎全部由克雷伯氏桿菌屬構成[15]。但是,蟑螂食性復雜,導致其腸道菌群的可塑性強,食物對蟑螂腸道菌群的調控能力和機制還不清楚[17]。不同蛋白水平餌料的影響在德國小蠊雄、雌蟲之間是否有差異,以及影響的主要菌群及其代謝功能,目前并不清楚。

昆蟲的腸道環(huán)境特殊,微生物種群復雜,其中含有大量的目前難以培養(yǎng)的微生物。因此,傳統(tǒng)的體外純培養(yǎng)技術嚴重低估了腸道微生物的多樣性[18]?；诖?目前有關昆蟲腸道微生物的研究,大都采用基于高通量測序的技術手段,可以更詳盡深入地分析腸道微生物的種類、群落組成及變化[1- 2]。本研究采用高通量測序技術分析德國小蠊腸道細菌16S rRNA基因的V4區(qū),鑒定德國小蠊雄成蟲腸道菌群的多樣性,評估不同蛋白質水平餌料對德國小蠊雄成蟲腸道細菌群落結構和功能的影響,進一步探討德國小蠊雄成蟲腸道菌群功能,為蟑螂的誘捕和生物防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試蟲飼養(yǎng)

德國小蠊由廣東省疾病預防控制中心贈送。蟑螂的飼養(yǎng)參照張碧堯等[7]和Wang等[19]的方法進行。

1.2 餌料配置

蟑螂餌料的配制在Hamilton等[20]和張碧堯等[7]方法的基礎上加以修改?？上奶妓衔餅楹?將除含蛋白質成分外的所有干燥成分與 200 mL蒸餾水混合加熱直至沸騰。待冷卻至 50℃后加入酪蛋白和酵母(防止蛋白質變性),同時連續(xù)攪拌以防止凝結。將餌料倒入培養(yǎng)皿中,室溫冷卻數小時,在50℃下將餌料干燥一周,儲存在干燥器中。最終制成蛋白質含量分別為5%和65%的人工餌料。蟑螂種群繁殖餌料為鼠糧(粗蛋白含量為25%),購自江蘇省協同醫(yī)藥生物工程有限責任公司。

1.3 德國小蠊雄成蟲飼養(yǎng)

將剛羽化的德國小蠊雄成蟲單獨飼養(yǎng)試驗盒中(直徑50 mm,高250 mm)使用鼠糧25%蛋白(CD1)、5%蛋白(LP2)、65%蛋白(HP3)等不同的餌料連續(xù)飼喂 21 d后,饑餓 24 h以去除非常駐細菌[11, 21]。每個處理重復3次。

1.4 德國小蠊腸道基因組DNA的提取及檢測

取饑餓雄蟲用75%的酒精對蟲體表面消毒3次,每個重復3次,每次3 min,再用無菌生理鹽水清洗5遍。在無菌生理鹽水中解剖蟲體,仔細分離出腸道,置于一個已滅菌的1.5 ml的離心管中,保存于-80℃冰箱中待用。采用 CTAB方法提取樣本的基因組 DNA,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的大小和完整度,并保存于-80℃冰箱中用于下一步高通量測序[6]。

1.5 德國小蠊腸道細菌16S rDNA V4區(qū)的高通量測序

以提取的德國小蠊腸道基因組總DNA為模板,選擇融合測序引物和barcode序列的細菌通用引物(515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′；806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTC TAAT- 3′)擴增細菌16S rDNA V4可變區(qū)。利用New England Biolabs 公司的 Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR,確保擴增效率和準確性。PCR反應體系(30 μL)：Phusion Master Mix(2 x) 15 μL,正向引物1.5 μL,反向引物1.5 μL,基因組DNA(1 ng/μL)10 μL,H2O 2 μL。反應程序：98℃預變性1 min；30個循環(huán)包括(98℃,10 sec；50℃,30 sec；72℃,30 sec)；72℃,5 min。根據濃度將不同樣品PCR擴增產物進行等摩爾濃度混樣,充分混勻后使用1xTAE濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產物,選擇主帶大小在400—450 bp之間的序列,割膠回收目標條帶。使用Thermofisher公司的lon Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫試劑盒進行文庫的構建,構建好的文庫經過Qubit 定量和文庫檢測合格后,使用Thermofisher的lon S5TMXL進行上機測序。

1.6 生物信息學分析

1.6.1測序數據分析

使用Cutadapt(V1.9.1)[22]先對reads進行低質量部分剪切,再根據Barcode從得到的reads中拆分出各樣品數據,截去Barcode和引物序列,初步質控得到原始數據(Raw reads) 經過以上處理后得到的Reads需要進行去除嵌合體序列的處理,Reads序列通過vsearch(https://github.com/torognes/vsearch/)與物種注釋數據庫進行比對檢測嵌合體序列,并最終去除其中的嵌合體序列,得到最終的有效數據(Clean Reads)。

1.6.2OTU聚類和物種注釋

利用Uparse軟件(v7.0.1001)[23]對所有樣品的全部 Clean Reads 進行聚類,默認以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units),同時選取OTUs的代表性序列,依據其算法原則,篩選OTUs中出現頻數最高的序列作為OTUs的代表序列。 對OTUs序列進行物種注釋,用Mothur方法[24]與SILVA132的SSU rRNA數據庫[25]進行物種注釋分析(設定閾值為0.8—1),獲得分類學信息并分別在各個分類水平：kingdom(界),phylum(門),class(綱),order(目),family(科),genus(屬),species(種)統(tǒng)計各樣本的群落組成。使用MUSCLE(Version 3.8.31)軟件[23]進行快速多序列比對,得到所有OTUs序列的系統(tǒng)發(fā)生關系。最后對各樣品的數據進行均一化處理,以樣品中數據量最少的為標準進行均一化處理,后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數據。

1.6.3德國小蠊腸道細菌多樣性分析

基于得到的OTU表,使用VennDiagram包繪制Venn圖揭示樣品間共有的OTUs。使用Qiime軟件包(Version 1.9.1)計算各個樣品的Alpha多樣性并繪制OTU稀釋曲線。Alpha多樣性用來衡量樣品內的物種多樣性和豐度差異,主要通過Observed-OTUs,Chao1,Shannon,Simpson,ACE,Goods-coverage,PD-whole-tree等指標來表達。使用R軟件(Version 2.15.3)進行Alpha多樣性指數組間差異分析。采用QIIME進行基于unifrac距離矩陣的β-多樣性并繪制NMDS圖來評估樣本間的相似度及不同樣本群落組成相似性和差異。LEfSe分析使用LEfSe軟件,默認設置LDA Score的篩選值為4。

1.6.4功能注釋

基于微生物群落組成的功能預測參照Kakumanu等[26]和王天召等[27]的方法。測序樣品以SILVA數據庫序列為參考序列聚類出OTU,進而獲取功能注釋信息。利用BLASTN算法將其比對到SILVA SSU Ref NR 數據庫(BLAST bitscore >1500)建立相關矩陣,將通過UProC和PAUDA兩種方法注釋的KEGG數據庫原核生物全基因組功能信息對應到SILVA數據庫中,實現SILVA數據庫功能注釋。

2 結果

2.1 德國小蠊腸道細菌16S rDNA測序結果處理和統(tǒng)計

OTU是在系統(tǒng)發(fā)生學或群體遺傳學的研究中,給某一個分類單元(屬、種和分組等)設置的一個標志,通常相似度為97%以上可以分為一個 OTU。對不同蛋白水平處理組德國小蠊腸道細菌有效測序數據進行統(tǒng)計,總測序標簽為724954條,平均標簽數80550.4條,測序數目較大,可以充分保證數據的準確性。其中CD1.2的總標簽最多,為84195條(表1)。采用對測序序列進行隨機抽樣,以抽到的序列數與它們所代表的OTU數目構建德國小蠊腸道細菌高通量測序結果的稀釋性曲線(圖1)。從圖1可以看出物種稀釋曲線趨向于平行,表明目前獲得的測序數據量合理,能夠反映德國小蠊腸道細菌的多樣性。

表1 德國小蠊腸道細菌16S rDNA測序有效數據統(tǒng)計

圖1 德國小蠊腸道細菌物種稀釋曲線 Fig.1 Observed species rarefaction curves of the intestinal bacteria in B. germanicaCD1: 鼠糧飼喂德國小蠊組; LP2: 5%蛋白餌料飼養(yǎng)組; HP3: 65%蛋白餌料飼養(yǎng)組

2.2 德國小蠊腸道細菌的群落組成和豐度

基于OTUs注釋結果,所測樣本在門水平分布最多的優(yōu)勢菌為擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)。CD1組的優(yōu)勢菌門為擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門,相對豐度依次為46.61%、38.33%和8.43%。LP2組的優(yōu)勢菌門為擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門,相對豐度依次為71.39%、10.17%和13%。HP3組優(yōu)勢菌門為擬桿菌門、變形菌門、梭桿菌門和厚壁菌門,相對豐度依次為50.56%、18.4%、15.6%和9.75%。其中CD1組脫鐵桿菌門(Deferribacteres)豐度顯著低于LP2(df1,2=1,4,F=16.394,P<0.05),HP3組梭桿菌門豐度顯著高于其他兩組(df1,2=2,6,F=29.238,P<0.05)(圖2)。

在科的水平上,德國小蠊腸道菌群共檢測到可鑒定的細菌10個科。這些類群的細菌在3個處理的樣本中均有出現。CD1組相對豐度大于5%的優(yōu)勢菌科分別是黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)、(unidentified Bacteroidales)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)和(Tannerellaceae),相對豐度依次為27.94%、16.02%、7.04%、6.97%和6.71%。LP2組相對豐度大于5%的優(yōu)勢菌科是擬桿菌科、理研菌科(Rikenellaceae)和(Tannerellaceae),相對豐度依次為47.44%、5.87%和5.84%。HP3組相對豐度大于5%的優(yōu)勢菌科是擬桿菌科、黃單胞菌科、梭桿菌科(Fusobacteriaceae)和(unidentified Bacteroidales),相對豐度依次為23.97%、15.55%、6.44%和6.19%。其中CD1組擬桿菌科豐度顯著低于HP3組(df1,2=1,4,F=32.996,P<0.05),HP3組梭桿菌科豐度顯著高于其他兩組(df1,2=2,6,F=31.618,P<0.05)(圖3)。

圖 2 德國小蠊腸道細菌門水平上的物種相對豐度Fig.2 Histogram of relative abundance of the intestinal bacteria in B. germanica at the phylum level

圖3 德國小蠊腸道細菌科水平上的物種相對豐度Fig.3 Histogram of relative abundance of the intestinal bacteria in B. germanica at the family level

在屬的水平上,德國小蠊腸道菌群主要由擬桿菌屬(Bacteroides) 、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、營發(fā)酵單胞菌屬(Dysgonomonas)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、另枝菌屬(Alistipes)、蟑螂桿狀體屬(Blattabacterium)等組成。CD1組相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌屬為寡養(yǎng)單胞菌屬、營發(fā)酵單胞菌屬、擬桿菌屬、脫硫弧菌屬、另枝菌屬和塞巴魯德氏菌屬(Sebaldella),相對豐度依次為27.94%、11.15%、7.04%、6.85%、2.97%和1.21%。其他未鑒定的細菌占比38.97%。在LP2組中,擬桿菌屬占絕對優(yōu)勢,其相對豐度為47.44%。相對豐度大于1%的還有另枝菌屬、脫硫弧菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、營發(fā)酵單胞菌屬、(CandidatusSoleaferrea)、(Erysipelatoclostridium)和梭桿菌屬,相對豐度分別為4.75%、3.74%、3.39%、3.33%、1.93%。1.91%和1.76%；未鑒定的細菌占比為29.19%。HP3組相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬、梭桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、脫硫弧菌屬、另枝菌屬、營發(fā)酵單胞菌屬、蟑螂桿狀體屬、(unidentifiedBurkholderiaceae),其相對豐度依次為23.97%、15.54%、6.43%、4.37%、3.12%、2.91%、2.17%和1.47%。其他未鑒定的細菌占比為32.98%。CD1組與LP2組相比,營發(fā)酵單胞菌屬豐度顯著高于后者(df1,2=1,4,F=10.137,P<0.05)；CD1組擬桿菌屬豐度顯著低于HP3組(df1,2=1,4,F=32.996,P<0.05)；HP3組梭桿菌屬豐度極顯著高于其他兩組(df1,2=2,6,F=31.6,P<0.01)(圖4)。

圖4 德國小蠊腸道細菌屬水平上的物種相對豐度Fig.4 Histogram of relative abundance of the intestinal bacteria in B. germanica at the genus level

OTUs分析表明CD1組有814個 OTUs,LP2組有785個OTUs, HP3組有881 OTUs。維恩圖分析發(fā)現CD1組和LP2組共有657個的 OTUs,CD1組和 HP3組共有665個OTUs,LP2組和 HP3組共有655個OTUs,3組樣本共有的 OTUs數目為585個,三個處理組的菌群具有很高的相似性,表明盡管不同的蛋白質餌料飼育對腸道菌群有明顯影響,但主要菌群保持較高的穩(wěn)定性(圖5)。

圖5 德國小蠊腸道細菌venn圖Fig.5 Venn diagram of the intestinal bacteria in B. germanica圖中數字表示德國小蠊腸道細菌的數目

2.3 德國小蠊腸道細菌多樣性特征

Alpha 多樣性統(tǒng)計如表2,ACE指數和Chao1指數反映樣品中群落的豐富度,數值越大,群落豐富度越高; Shannon指數越高和Simpson指數越低反映群落的多樣性越高。該結果表明這三種餌料喂養(yǎng)德國小蠊腸道菌群具有高的物種多樣性和豐富度,但三組餌料之間沒有顯著差異。

表2 德國小蠊腸道細菌α多樣性指數

基于Bray-Curtis相似性系數的NMDS分析發(fā)現,3組處理的三個平行樣本分布較為離散,說明3組樣品組間物種群落相似性系數較低,但HP3組與另外兩組的距離更遠,表明高蛋白處理樣本與低蛋白處理(小于25%)樣本的腸道菌群組成具有較大的差異(圖6)。

圖6 德國小蠊腸道細菌的NMDS圖Fig.6 NMDS diagram of the intestinal bacteria in B. germanicaNMDS: 非度量多維尺度分析Non-metric multidimensional scaling

2.4 德國小蠊腸道細菌組間物種差異

LDA值分布柱狀圖展示了德國小蠊雄成蟲腸道細菌3組樣本中在豐度上具有明顯差異的物種。分析表明,在CD1組中豐度上有明顯差異的物種為變形菌門(Proteobacteria)和包西氏菌屬(Bosea)。LP2組在豐度上有明顯差異的物種為(Lamiaceae)、(unidentified Acidimicrobiia)和(Lamia)。HP3組豐度上有明顯差異的物種為梭桿菌科(Fusobacteriaceae)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、變異梭桿菌(Fusobacteriumvarium)；伯克霍爾德科(Burkholderiaceae)以及(unidentified Gammaproteobacteria)(圖7)。

圖7 LEfSe分析德國小蠊腸道細菌分類差異Fig.7 LEFSe analysis of the intestinal bacteria in B. germanica

2.5 德國小蠊腸道細菌的功能預測

運用Tax4Fun技術,在德國小蠊雄成蟲腸道樣品中共發(fā)現了44個基因簇。腸道細菌菌群功能基因和代謝途徑分析表明,KEGG代謝通路中德國小蠊腸道細菌編碼的大多數基因與其代謝功能有關。在發(fā)現的基因簇中,優(yōu)勢基因簇包括代謝(Metabolism)、遺傳信息處理(Genetic Information processing)和環(huán)境信息處理(Environmental information processing)(圖8)。選取豐度排名前35的功能及它們在每個樣品中的豐度信息繪制熱圖,并從功能差異層面進行聚類(圖9),HP3組腸道菌群能量代謝基因的相對豐度極顯著高于CD1組(df1,2=1,4,F=102.86,P<0.01),外源性物質代謝與降解基因的相對豐度極顯著高于LP2組(df1,2=1,4,F=19.973,P<0.01),其他氨基酸代謝基因的相對豐度顯著高于LP2 組(df1,2=1,4,F=16.564,P<0.05)。

圖8 KEGG通路Fig.8 KEGG pathway

圖9 Tax4Fun功能注釋聚類熱圖Fig.9 Tax4Fun functional annotation clustering heat map

3 討論

德國小蠊雄成蟲腸道菌群門水平上優(yōu)勢菌為擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)；科水平上優(yōu)勢菌主要屬于擬桿菌科、黃單胞菌科、梭桿菌科和脫硫弧菌科等。這與Pérez-Cobas等[6]、Kakumanu等[26]、Carrasco等[28]、Rosas等[29]和Chao等[30]對德國小蠊腸道菌群的研究結果相似,說明這些類群的細菌是德國小蠊腸道內的核心微生物(core microbes)。比較分析發(fā)現,德國小蠊雄成蟲腸道優(yōu)勢菌群與褐飛虱(Nilaparvatalugens)[27]、濱海油葫蘆(Teleogryllusoceanicus)[31]和印度谷蛾(Plodiainterpunctella)[32]腸道優(yōu)勢菌群相類似,一些昆蟲的腸道微生物在高級分類單元上可能存在一定的相關性。

相對于低蛋白(5%)餌料,高蛋白餌料(65%)飼養(yǎng)的德國小蠊雄蟲腸道細菌物種多樣性沒有顯著差異,這一結果支持Pérez-Cobas等[6]對德國小蠊雌蟲的研究結論。在德國小蠊研究中發(fā)現：與野生的蟑螂種群相比,實驗室種群的腸道細菌多樣性下降[6, 28]；飼養(yǎng)時間增長有利于細菌物種多樣性的增加[28]。野生蟑螂的腸道中含有數量眾多的低豐度細菌種群,這些低豐度種群在實驗室飼養(yǎng)過程中消失了[14, 33]。實驗室飼養(yǎng)蟑螂腸道細菌多樣性下降,可能與人工餌料成分比較固定、成分相對簡單有關。餌料蛋白含量對昆蟲腸道菌群的作用,在果蠅(Drosophilaspp)[34]、大頭金蠅(Chrysomyamegacephala)[35]和印度谷蛾[32]等昆蟲中也做過探討；高蛋白餌料飼養(yǎng)降低果蠅、大頭金蠅和印度谷蛾腸道菌群的物種多樣性。由于不同研究所使用的餌料(包括蛋白質來源、種類和質量)不同,昆蟲的飼養(yǎng)時間也不同,要作真正意義上有價值的比較,目前還存在困難。

不同蛋白質含量餌料飼養(yǎng)德國小蠊雄蟲后,腸道細菌中不同種群的相對豐度發(fā)生顯著的改變；高蛋白餌料飼養(yǎng)促進黃單胞菌科和梭桿菌科細菌富集,低蛋白飼料飼養(yǎng)則有利于擬桿菌科、理研菌科和(Tannerellaceae)細菌的生長。在美洲大蠊的研究中,Tinker和Ottesen沒有作昆蟲性別的區(qū)分,但發(fā)現不同餌料(包括高脂肪、高碳水化合物和高蛋白)對美洲大蠊腸道菌群的豐度沒有顯著的影響[14]。在德國小蠊雌蟲腸道菌群中,相對豐度變化最大的是紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)和梭桿菌科(Fusobacteriaceae)；無蛋白餌料飼養(yǎng)促進紫單胞菌科細菌的生長,其相對豐度為37%,高于正常蛋白和高蛋白飼料組(分別為29%和26%)；無蛋白餌料飼養(yǎng)不利于梭桿菌科細菌生長,其相對豐度為7%；顯著低于正常蛋白和高蛋白飼料組(分別為32%和23%)[6]。此外,德國小蠊雌蟲中沒有發(fā)現黃單胞菌科的細菌[6],而在本研究中卻發(fā)現黃單胞菌科細菌是德國小蠊雄成蟲腸道的優(yōu)勢菌群。這種雌、雄蟲之間細菌種群分布的差異是否與其性別分化有關,值得后續(xù)深入研究。

由不同蛋白水平餌料飼養(yǎng)而導致的德國小蠊雄蟲腸道細菌種群相對豐度發(fā)生改變,可能與餌料成分對不同類群細菌的選擇性相關。食物改變導致腸道細菌種群發(fā)生波動在德國小蠊和其他昆蟲均有發(fā)現[6,8, 13- 15, 35],但食物結構和組分影響昆蟲腸道菌群的具體機制目前不太清楚。在長期的進化過程中,不同的微生物類群適應各自的生長環(huán)境,進化出對不同有機質利用能力的差異[1, 5, 36]。野生蟑螂腸道微生物群落更為豐富,可能與野生蟑螂的食料更為多元化有關。野生蟑螂腸道中定殖著大量的低豐度細菌種群[33, 37],其中的變形菌門細菌大多數與生物固氮有關,在無氮或貧氮環(huán)境條件下,就需要這些菌群幫助宿主進行氮素的固定和循環(huán)[5, 11]。蛋白組分析結果顯示：大多數擬桿菌科細菌含有較多的分解多糖的酶蛋白,主要功能可能是幫助宿主降解復雜的碳水化合物,產生簡單而易于利用的糖類。因此,餌料中高比例的復雜碳水化合物有利于擬桿菌的生長[13, 28]。在人體腸道中,擬桿菌科細菌同樣適應于高蛋白食物；擬桿菌分解復雜多糖和蛋白質后產生的單糖和氨基酸,則促進腸道中梭桿菌的積累[38]。因此推測,在本研究設計的餌料中,低蛋白餌料中高水平的糊精(85%)有利于擬桿菌的生長,因而在低蛋白餌料飼養(yǎng)蟑螂腸道中擬桿菌科細菌占絕對優(yōu)勢(47.44%)；而在高蛋白餌料中,較高水平的糊精(13%)和高水平的蛋白(65%),則促進擬桿菌和梭菌的協同生長。菌群功能注釋顯示高蛋白組德國小蠊腸道里能量代謝、氨基酸代謝和物質分解相關的基因表達顯著提高(圖10),和梭桿菌屬細菌豐度升高同步,推測梭桿菌屬細菌可能與餌料中蛋白質降解和能量利用相關,緩解餌料中過多的蛋白質對德國小蠊的代謝負擔。但高蛋白餌料對德國小蠊雄蟲腸道細菌種群的調節(jié)作用由何種因素主導,以及梭桿菌屬細菌的富集在高蛋白水平條件下的作用有待于深入的研究。

不同蛋白質水平餌料飼養(yǎng)的德國小蠊其腸道菌群結構發(fā)生顯著的變化,這些變化可能與德國小蠊對食物的適應有關,提示腸道細菌在德國小蠊對環(huán)境和食物的生存適應上可能發(fā)揮著重要的作用。本文的研究結果有利于進一步將昆蟲腸道菌群與昆蟲的取食、代謝和發(fā)育聯系起來,揭示相關的作用機制,從而為利用腸道菌發(fā)展餌料,實現對包括德國小蠊在內的衛(wèi)生害蟲治理奠定基礎。

致謝：感謝福建農林大學植物保護學院夏曉峰副教授對文章寫作的幫助。