亢菊俠，蘭文學(xué)，楊 林

(1 楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程分院，陜西 楊凌 712100；2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護學(xué)院，陜西 楊凌712100)

在漫長的生物進化過程中，植物進化出一系列防御策略來應(yīng)對不良的環(huán)境條件。這些防御策略分為組成型防御機制和誘導(dǎo)型防御機制[1]。組成型防御機制一般是指植物本身具有的、能夠抵御外界病蟲危害的物理因子和化學(xué)因子，這些因子在植物的一生中都不會發(fā)生重大改變；而誘導(dǎo)型防御機制是指植物自身不會主動發(fā)生,必須有外界脅迫發(fā)生時植物經(jīng)過一段時間的適應(yīng)后才會發(fā)生的防御反應(yīng)。誘導(dǎo)型防御途徑主要有茉莉酸(jasmonic acid，JA)途徑、水楊酸(salicylic acid，SA)途徑、脫落酸(abscisic acid，ABA)途徑、乙烯(ethylene，Et)途徑等[2]。JA途徑是植物在創(chuàng)傷條件下激活的一類誘導(dǎo)防御反應(yīng)，植物內(nèi)部產(chǎn)生亞麻酸，在脂氧合酶(LOX)、丙二烯氧化物合成酶(AOS)等一系列酶促反應(yīng)的作用下最終生成JA和茉莉酸甲酯[3]。SA途徑在植物抗病原菌反應(yīng)中起著重要的作用，苯丙氨酸解氨酶(PAL)是該途徑的關(guān)鍵酶，催化合成SA前體物質(zhì)肉桂酸，且在SA下游受病程相關(guān)基因非表達子1(NPR1)的調(diào)控，從而最終建立誘導(dǎo)型防御[4]。

在自然界中，植物病毒-介體昆蟲-寄主植物三者間存在著復(fù)雜的相互聯(lián)系。植物病毒可導(dǎo)致寄主植物發(fā)生變色、組織壞死和畸形等形態(tài)特征的變化[5]，還能調(diào)節(jié)寄主體內(nèi)氨基酸、碳水化合物等營養(yǎng)成分以及揮發(fā)性物質(zhì)的種類與含量[6-8]。介體昆蟲的取食也能對寄主植物產(chǎn)生重要影響，如刺吸式昆蟲取食后，植物能夠閉塞篩管并產(chǎn)生和釋放次級代謝物[9-10]。目前，寄主植物對植物病毒和介體昆蟲產(chǎn)生上述防御反應(yīng)的機制尚不明確，前人曾報道寄主植物通過直接提高SA[11]、JA含量[12]來防御介體昆蟲的脅迫，還通過體內(nèi)重要保護酶和解毒酶活性的變化來應(yīng)對病毒的影響[13]，而有關(guān)植物病毒和介體昆蟲誘導(dǎo)防御反應(yīng)過程中寄主植物關(guān)鍵基因表達水平變化的報道不多。

小麥(TriticumaestivumL.)是世界上最主要的糧食作物。由大麥黃矮病毒(barley yellow dwarf virus，BYDV)所致的小麥黃矮病是小麥的重要病害，其中BYDV-GAV是我國主要流行的BYDV株系；麥二叉蚜Schizaphisgraminum(Rondani)和麥長管蚜Sitobionavenae(Fabricius)是小麥上的重要害蟲，且是BYDV-GAV的傳播介體。在田間，麥蚜和大麥黃矮病常?；旌习l(fā)生。由于SA和JA在寄主植物防御反應(yīng)中往往作為信號物質(zhì)，為探究植物病毒對介體昆蟲取食和植物防御反應(yīng)過程中SA和JA途徑關(guān)鍵基因表達水平是否有影響，本研究以BYDV-GAV為測試病毒，以麥長管蚜和麥二叉蚜為試蟲，設(shè)置無蚜蟲取食、無毒蚜蟲取食、有毒蚜蟲取食小麥，于取食后不同時間，檢測小麥葉片JA合成途徑中的關(guān)鍵基因LOX和AOS及SA途徑關(guān)鍵基因NPR1和PAL的表達水平，以期從寄主植物小麥的角度探討造成防御反應(yīng)差異的原因，為合理防治小麥蚜蟲及黃矮病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試小麥的種植

供試小麥品種為矮抗58。小麥種植前先用水浸泡種子24 h，然后將育苗基質(zhì)土裝入一次性塑料杯中，將土鋪平后在每個塑料杯中撒3粒種子，再蓋上一層土壤，用灑水壺噴水浸透。將所有處理的塑料杯集中放置在托盤上，將托盤放置在人工氣候室中(溫度為(20±1) ℃，相對濕度為60%±5%，光照時間為16 h/d)，待小麥出苗后，保留一株幼苗，待幼苗兩片葉片完全展開時用于試驗。

1.2 供試蚜蟲的飼養(yǎng)

無毒蚜蟲：無毒麥長管蚜、麥二叉蚜為試驗室前期自西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)試驗田(34°17′48.5″N，108°04′34.9″E)采集的單頭無翅成蚜，在上述小麥上飼喂，并于人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度為(25±1) ℃，相對濕度為75%±5%，光照時間為16 h/d。 飼養(yǎng)3代后形成單克隆系。

感染BYDV-GAV蚜蟲：在西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)試驗田中采集出現(xiàn)小麥黃矮病癥狀的小麥植株，進行RT-PCR鑒定，確認小麥僅含有BYDV-GAV，具體試驗方法同文獻[14]。將上述無毒麥長管蚜、麥二叉蚜放入其中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件同上。蚜蟲每代均進行BYDV-GAV檢測，確保成功感染。

1.3 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)5個組：無蚜蟲取食小麥(CK)、無毒麥長管蚜取食小麥(Mock-Sa)、無毒麥二叉蚜取食小麥(Mock-Sg)、感染BYDV-GAV麥長管蚜取食小麥(BYDV-Sa)和感染BYDV-GAV麥二叉蚜取食小麥(BYDV-Sg)。Mock-Sa、Mock-Sg、BYDV-Sa和BYDV-Sg處理：將單株種植的二葉期小麥一個葉片先用透明塑料薄膜包裹住，在另一個葉片上接10頭相應(yīng)的3齡無翅麥長管蚜或麥二叉蚜；CK處理不接蚜蟲。接蟲后用透明塑料罩子將小麥整體罩住，放入上述人工氣候箱中。于蚜蟲取食2 h(蚜蟲達到穩(wěn)定取食所需時間)，26，50，74和98 h時，用體積分數(shù)1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)噴灑葉片，促使蚜蟲口針從葉片中拔出，再用毛筆刷走蚜蟲，剪下葉片用液氮速凍，放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。每組重復(fù)3次。

1.4 LOX、AOS、NPR1和PAL基因的熒光實時定量PCR(qRT-PCR)分析

1.4.1 熒光實時定量引物設(shè)計 參考GenBank中LOX、AOS、NPR1和PAL序列(登錄號分別為GQ166692.1、AY196004、O0070069和AY00547-4)，并以26S基因為內(nèi)參(登錄號為Ta22845)，利用軟件Primer 5.0設(shè)計引物(表1)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。用PCR對設(shè)計的引物進行特異性檢測，各引物均可擴增出單一條帶且無引物二聚體，片段大小都在200 bp左右，可以滿足熒光實時定量PCR的引物設(shè)計要求。用qRT-PCR進一步確定引物特異性，從熔解曲線看，各引物均具有單一峰值，證明該引物具有特異性，可用于qRT-PCR試驗。

1.4.2 總RNA提取與檢測 將1.3的小麥葉片置于研缽中，加入液氮快速研磨后，按照50～100 mg/mL向研缽中加入Trizol Reagent試劑，然后按照試劑說明書提取各組小麥葉片的總RNA。對提取的總RNA進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，驗證提取總RNA的完整性。將獲得的RNA置于-80 ℃?zhèn)溆?，測定230，260和280 nm處的吸光值(OD230、OD260和OD280)，檢測提取組織RNA的濃度和質(zhì)量后，用反轉(zhuǎn)錄試驗獲得 cDNA 模板。

1.4.3 相關(guān)基因的熒光實時定量檢測 采用TB Green?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒和實時熒光定量PCR儀QuantStudio 3.0進行試驗。參照試劑盒說明書，配制20 μL PCR擴增體系:TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，PCR正向引物(10 μmol/L)0.8 μL，PCR反向引物(10 μmol/L)0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，DNA模板2 μL，滅菌水6 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次，反應(yīng)結(jié)束后收集循環(huán)閾值(Ct)，采用2-ΔΔCt法[15]進行相對表達量分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

相對表達量數(shù)據(jù)利用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，用Turkey法(P=0.05)進行多重比較,不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis test非參數(shù)檢驗(P=0.05)。利用Sigma Plot 10.0 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥葉片總RNA質(zhì)量檢測

使用Trizol提取各處理組小麥葉片總RNA，電泳結(jié)果見圖1。圖1顯示，在各處理組均可清楚地看到2條rRNA條帶(28 S和18 S)，說明獲得了完整性較好的RNA。對提取各處理組小麥葉片總RNA的質(zhì)量進行檢測，由檢測結(jié)果(表2)可知，各處理組總RNA的OD260/OD280和OD260/OD230值為1.94～2.18，總RNA質(zhì)量濃度為187～345 ng/μL，說明樣品總RNA的純度達到試驗要求。

表2 不同處理小麥樣品總RNA質(zhì)量檢測結(jié)果Table 2 Quality detection of total RNA in wheat under different treatments

2.2 攜帶BYDV蚜蟲取食對小麥JA途徑關(guān)鍵基因表達的影響

無BYDV-GAV和有BYDV-GAV蚜蟲取食對小麥LOX基因表達量的影響如圖2所示。由圖2可知，與CK相比，Mock-Sa和Mock-Sg處理小麥LOX基因的相對表達量在蚜蟲取食26 h均顯著下調(diào)，而在取食50和98 h均顯著上調(diào)，且Mock-Sg處理在74 h也顯著上調(diào)，結(jié)果表明隨著取食時間的加長，麥蚜取食能顯著提高小麥體內(nèi)LOX的表達水平。

圖柱上標不同小寫字母表示同一時間下不同處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05 level among treatments at the same time.The same below圖2 無BYDV-GAV和有BYDV-GAV蚜蟲取食對小麥LOX基因表達量的影響Fig.2 Relative expression of LOX in wheat plants after fed by virus-free or BYDV-GAV infected aphids

由圖2還可知，與Mock-Sa處理相比， BYDV-Sa處理小麥LOX基因的相對表達量在蚜蟲取食26，50，74和98 h均顯著下調(diào)；與Mock-Sg處理相比， BYDV-Sg處理小麥LOX基因的相對表達量表現(xiàn)出與BYDV-Sa處理一致的趨勢，即在蚜蟲取食26～98 h均顯著下調(diào)。上述結(jié)果表明，BYDV-GAV能顯著降低小麥體內(nèi)LOX的表達水平。

無BYDV-GAV和有BYDV-GAV蚜蟲取食對小麥AOS基因表達量的影響如圖3所示。由圖3可知，與CK相比，Mock-Sa和Mock-Sg處理小麥AOS基因的相對表達量在蚜蟲取食26 h均顯著下調(diào)，在取食50 h均顯著上調(diào)，取食74 h時Mock-Sa處理顯著下調(diào)；取食98 h時Mock-Sa處理小麥顯著上調(diào)，Mock-Sg處理小麥顯著下調(diào)。表明麥蚜取食對小麥體內(nèi)AOS基因的表達水平影響不一致，因蚜蟲種類而異。與Mock-Sa處理相比，BYDV-Sa處理小麥AOS基因的相對表達量在蚜蟲取食26，50，74和98 h均顯著下調(diào)；與Mock-Sg處理相比，BYDV-Sg處理小麥AOS基因的相對表達量在蚜蟲取食26和74 h均顯著下調(diào)。表明BYDV-GAV能顯著降低小麥體內(nèi)AOS的表達水平。

圖3 無BYDV-GAV和有BYDV-GAV蚜蟲取食對小麥AOS基因表達量的影響Fig.3 Relative expression of AOS in wheat plants after fed by virus-free or BYDV-GAV infected aphids

2.3 攜帶BYDV蚜蟲取食對小麥SA途徑關(guān)鍵基因表達的影響

無BYDV-GAV和有BYDV-GAV蚜蟲取食對小麥NPR1基因表達量的影響如圖4所示。由圖4可知，與CK相比，Mock-Sa處理小麥NPR1基因的相對表達量僅在蚜蟲取食50 h時顯著下調(diào)，而Mock-Sg處理小麥在取食26 h顯著下調(diào)，在50 h顯著上調(diào)；其他時間2個處理均與CK無顯著差異，表明麥蚜取食對小麥體內(nèi)NPR1基因的表達水平總體上無顯著影響。與Mock-Sa處理相比，BYDV-Sa處理小麥NPR1基因的相對表達量在蚜蟲取食74和98 h顯著下調(diào)；與Mock-Sg處理相比，BYDV-Sg處理小麥NPR1基因的相對表達量在蚜蟲取食26 h顯著上調(diào)，在取食50 h顯著下調(diào)。表明BYDV-GAV在一定的時間段可降低小麥體內(nèi)NPR1的表達水平。

圖4 無BYDV-GAV和有BYDV-GAV蚜蟲取食對小麥NPR1基因表達量的影響Fig.4 Relative expression of NPR1 in wheat plants after fed by virus-free or BYDV-GAV infected aphids

無BYDV-GAV和有BYDV-GAV蚜蟲取食對小麥PAL基因表達量的影響如圖5所示。由圖5可知，與CK相比，Mock-Sa和Mock-Sg處理小麥PAL基因的相對表達量在蚜蟲取食50 h均顯著上調(diào)，74 h時僅Mock-Sg處理小麥PAL基因顯著上調(diào)，98 h時僅Mock-Sg處理小麥顯著下調(diào)，表明麥蚜取食對小麥體內(nèi)PAL基因表達水平的影響在不同時間表現(xiàn)不一致。與Mock-Sa處理相比，BYDV-Sa處理小麥PAL基因的相對表達量在蚜蟲取食26，74和98 h均顯著下調(diào)，在50 h 顯著上調(diào)；與Mock-Sg處理相比，BYDV-Sg處理小麥PAL基因的相對表達量在蚜蟲取食26，50，74和98 h均顯著下調(diào)，表明BYDV-GAV能顯著降低小麥體內(nèi)PAL的表達水平。

圖5 無BYDV-GAV和有BYDV-GAV蚜蟲取食對小麥PAL基因表達量的影響Fig.5 Relative expression of PAL in wheat plants after fed by virus-free or BYDV-GAV infected aphids

3 討論與結(jié)論

近年來，研究植物病毒-介體昆蟲-寄主植物三者間的交互作用來防治植物病毒和害蟲，受到了越來越廣泛的關(guān)注，而在寄主植物抵御外來脅迫的過程中，SA和JA防御途徑起著非常重要的作用。本研究表明，與無蚜蟲取食對照相比，麥蚜取食能顯著提高小麥體內(nèi)LOX的表達水平，對NPR1的表達水平無顯著影響，而對AOS和PAL表達水平的影響因麥蚜種類或處理時間的不同而變化。與無毒蚜蟲取食相比，攜帶BYDV-GAV蚜蟲取食總體上能降低小麥體內(nèi)LOX、AOS、NPR1和PAL的表達水平。史曉斌[16]研究發(fā)現(xiàn)，B型和Q型煙粉虱能顯著提高番茄體內(nèi)LOX基因的表達水平，這與本研究結(jié)果一致，但該研究還發(fā)現(xiàn)，攜帶番茄黃化曲葉病毒煙粉虱取食可致番茄體內(nèi)NPR1基因的表達水平顯著增加(B型)或無顯著影響(Q型)，這與本研究結(jié)果不一致，說明植物病毒對植物防御作用的影響具有種的特異性。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蚜蟲取食的小麥體內(nèi)LOX基因表達水平顯著升高，表明蚜蟲取食能提高增強JA途徑基因的表達。張弛等[13]研究發(fā)現(xiàn)，麥長管蚜取食后小麥體內(nèi)過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)活性分別提高83.88%，126.45%，91.21%，197.26%和468.82%。上述結(jié)果說明，昆蟲取食能顯著改變寄主植物體內(nèi)生理生化反應(yīng)，從而實現(xiàn)對昆蟲取食的防御作用。大多數(shù)刺吸式昆蟲在取食的時候會分泌膠狀和水狀唾液，其中膠狀唾液會在昆蟲取食早期分泌并形成唾液鞘，保護口針；而水狀唾液中包含了一系列的活性組分，如酚氧化酶、過氧化物酶、果膠酶、纖維素酶、堿性磷酸脂酶等[17]。筆者推測，唾液能幫助刺吸式昆蟲穿刺植物、消化食物、解毒次生物質(zhì)并破壞植物的防御反應(yīng)。

攜帶植物病毒的昆蟲取食寄主植物后，昆蟲的生長發(fā)育顯著加快[18]，繁殖力顯著提高[19-20]，種群內(nèi)稟增長率顯著增加[21]，取食行為顯著增強[22]，表明植物病毒能提高介體昆蟲對寄主植物的適應(yīng)能力，即植物病毒能協(xié)助介體昆蟲應(yīng)對寄主植物的防御作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與無毒蚜蟲取食處理相比，攜帶BYDV-GAV麥蚜取食處理小麥體內(nèi)LOX、AOS、NPR1和PAL的表達水平總體降低，表明BYDV-GAV能顯著降低小麥的誘導(dǎo)型防御水平，這為前人得出的“植物病毒能協(xié)助介體昆蟲應(yīng)對寄主植物的防御作用”研究結(jié)果提供了一個合理的解釋。筆者推測出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能是BYDV-GAV在麥蚜體內(nèi)循環(huán)過程中激活了麥蚜體內(nèi)抑制小麥防御途徑的酶，或者麥蚜取食的過程中BYDV-GAV改變了麥蚜唾液的成分，從而對小麥防御途徑產(chǎn)生了抑制作用。

前人研究表明，JA介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是咀嚼式口器蟲害和創(chuàng)傷誘導(dǎo)的主要途徑，而SA介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是刺吸式口器蟲害和病原菌侵染的主要誘導(dǎo)途徑[23-24]，且一種激素的上升會導(dǎo)致另一種激素的下降[25]。蚜蟲屬刺吸式口器昆蟲，SA途徑應(yīng)是其主要誘導(dǎo)途徑。但本研究發(fā)現(xiàn)，與無蚜蟲取食對照相比，麥蚜取食不同時間段均能顯著提高小麥JA途徑中LOX基因的表達水平，而對SA途徑中NPR1基因的表達水平無顯著影響，說明JA可能在麥蚜取食過程中發(fā)揮了主要的防御作用；但與無毒蚜蟲取食相比，攜帶BYDV-GAV的麥蚜在取食不同時間段均能顯著降低JA途徑中LOX和AOS基因的表達水平，且均能降低SA途徑中NPR1和PAL基因的表達水平，這與前人的研究不一致，需進一步探究其原因。

本研究表明，BYDV-GAV和麥蚜之間的互利共生促進了麥蚜對植物防御反應(yīng)的抵抗作用，這可能是導(dǎo)致麥蚜大發(fā)生并造成BYDV-GAV病毒擴散的一個重要原因。但本研究只分析了攜帶BYDV蚜蟲取食對小麥JA和SA途徑重要基因表達水平的影響，其具體互作機理仍不明確，因此仍需要進一步利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)以及RNAi等方法深入研究，以明確植物病毒-介體昆蟲-寄主植物三者之間更深層的基因適應(yīng)機制。