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      甘薯抗草甘膦生理指標(biāo)及其相關(guān)基因EPSPS和AKR的表達

      2021-08-09 08:12:00柴沙沙李成陽王連軍劉巧林楊新筍
      關(guān)鍵詞:草甘膦草酸脯氨酸

      柴沙沙,李成陽,雷 劍,王連軍,劉巧林,楊新筍

      (湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a糧食作物研究所/湖北省甘薯工程技術(shù)研究中心/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點實驗室,b經(jīng)濟作物研究所,湖北 武漢 430064)

      甘薯是一種重要的糧食、飼料及工業(yè)原料作物,作為一種新型能源作物,其地位十分重要。甘薯在莖葉封壟之前,田間雜草嚴(yán)重影響其幼苗生長,可引起甘薯減產(chǎn)5%~15%,草害嚴(yán)重時減產(chǎn)達50%以上,給甘薯生產(chǎn)帶來重大損失[1]。在甘薯大規(guī)模生產(chǎn)中中耕除草耗費人力物力。目前選用合適的除草劑是最經(jīng)濟有效的除草方法[2]。草甘膦是一種非選擇性、葉面施用的除草劑,由于具有廣譜、低毒、低土壤殘留的特點,主要用于防治一年生、二年生和多年生雜草,如莎草和闊葉雜草,主要作用部位是植物的莖和葉片[3-5]。

      5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)是植物和大部分微生物體內(nèi)莽草酸途徑的一個關(guān)鍵酶,在芳香族氨基酸的生物體合成中至關(guān)重要[6]。草甘膦會專一抑制EPSPS活性,導(dǎo)致莽草酸大量積累,從而擾亂生物體正常的氮代謝而致其死亡。初步研究發(fā)現(xiàn),噴施草甘膦會加劇甘薯葉片膜脂過氧化程度,提高葉片的CAT活性和MDA含量[2]。醛酮還原酶(aldo-ketoreductase,AKR)是一個包括14個家族共40個成員的超家族,廣泛分布于原核生物和真核生物中[7-9]。AKR成員均屬于單體胞質(zhì)蛋白,以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作為其輔酶,將醛酮類化合物還原成相應(yīng)的醇類,在生物體中發(fā)揮重要作用[10-13]。Pan等[14]研究發(fā)現(xiàn),水稻愈傷組織和幼苗對草甘膦的抗性表現(xiàn)為EcAKR4-1過表達和AKR活性增強。研究表明,AKR及其同工酶可能參與細(xì)胞生長和分化調(diào)控[15],以及調(diào)節(jié)滲透作用、細(xì)胞中有毒物質(zhì)的代謝等[6,16]。脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),在植物體內(nèi)具有重要的滲透調(diào)節(jié)作用。在逆境條件下植物體內(nèi)脯氨酸含量顯著增加[17]。原向陽等[18]研究表明,噴施草甘膦后,大豆脯氨酸含量升高,且脯氨酸含量與草甘膦劑量呈顯著正相關(guān)。甘薯耐草甘膦是否與EPSPS和AKR基因的過表達有關(guān)尚不清楚。為此,本研究選取對草甘膦敏感性不同的2個甘薯品種N3589(草甘膦敏感型品種)和鄂薯11(草甘膦抗性品種)為試驗材料,研究噴施草甘膦后甘薯莽草酸和脯氨酸含量及根系活力的變化,以及EPSPS與AKR基因的表達特點,為甘薯耐草甘膦分子機制研究提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 試驗材料

      試驗材料為草甘膦抗性甘薯品種鄂薯11和草甘膦敏感型甘薯品種N3589(親本為寧紫8號,集團雜交材料)。供試藥劑為41%草甘膦異丙胺鹽水劑(有效濃度2.16 mol/L,美國孟山都公司生產(chǎn))。

      1.2 試驗設(shè)計

      1.2.1 田間試驗 試驗于2019年5-10月在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所鄂州試驗基地進行。試驗地土壤質(zhì)地為壤土,0~20 cm土層土壤基礎(chǔ)肥力情況:有機質(zhì)含量26.3 g/kg,堿解氮含量185.06 mg/kg,速效磷(P)含量20.8 mg/kg,速效鉀(K)含量304.05 mg/kg。

      試驗采用裂區(qū)試驗設(shè)計,主區(qū)為不噴施草甘膦處理(A1)和噴施草甘膦處理(A2),其中A1為噴施清水對照;A2噴施21.6 mmol/L草甘膦,即將41%草甘膦異丙胺鹽水劑稀釋100倍。副區(qū)為草甘膦抗性甘薯品種鄂薯11和草甘膦敏感型甘薯品種N3589。每個處理設(shè)3次重復(fù),小區(qū)長5 m,寬4.8 m;株距25 cm,行距80 cm。栽插后20 d對甘薯進行噴施草甘膦處理,草甘膦溶液用量225 L/hm2,用噴霧器進行均勻噴霧,以葉面開始有液滴滑落時為準(zhǔn)。甘薯于2019年5月20日栽插,10月22日收獲,大田管理除了不進行中耕除草外,其他管理同田間生產(chǎn)。

      1.2.2 盆栽試驗 盆栽試驗為研究噴施草甘膦之后,甘薯生長前期根系特性的輔助試驗。盆栽試驗處理同田間試驗。選用高25 cm、上下內(nèi)直徑分別為23 cm和20 cm的硬塑料盆,填裝大田耕層土壤,每盆裝土6 kg。取3葉1心的甘薯幼苗,移栽于硬塑料盆中,每盆1株,每處理15盆。噴施清水對照和草甘膦處理的盆栽分開擺放,不同處理的盆栽排列間留一排為隔離。移栽后20 d,向甘薯葉面均勻噴施草甘膦除草劑,以葉面開始有液滴滑落時為準(zhǔn),草甘膦溶液濃度21.6 mmol/L,施用量為225 L/hm2。

      1.3 取樣方法

      田間試驗中設(shè)置專門的取樣區(qū), 分別于噴藥后第2,5,8,11天,在取樣區(qū)取3~5株,將整株植株分地上部與地下部2部分,其中地上部分將葉與莖分別稱質(zhì)量并留樣,地下部分將直徑≥0.5 cm的塊根稱質(zhì)量并留樣,110 ℃殺青,70 ℃烘干留樣用于脯氨酸含量的測定。同時, 每個處理取5片功能葉(頂5葉),液氮速凍,-20 ℃低溫保存,用于莽草酸含量的測定。

      盆栽試驗中,分別于噴藥后第2,5,8,11天沖根取樣, 每個處理沖根 6盆,共取 6株, 用于根系活力測定。同時, 每個處理取5片幼嫩葉片,液氮速凍,-80 ℃超低溫保存,用于實時熒光定量PCR(q-PCR)檢測基因表達。

      1.4 生理指標(biāo)和根系活力的測定

      莽草酸含量測定:采用分光光度法[19]并稍做改動:準(zhǔn)確稱取甘薯功能葉 0.1 g,剪碎于研缽中研磨,然后加入1 mL 0.25 mol/L HCl勻漿,4 ℃離心(12 000 r/min,15 min),上清液置冰上待測。取上清液200 μL,加入2 mL 1%過碘酸溶液,混勻,室溫靜置3 h后再加入2 mL 1 mol/L的NaOH溶液和1.2 mL 0.1 mol/L甘氨酸,混勻靜置5 min,于380 nm處測定吸光度(OD)。根據(jù)莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算甘薯葉片中莽草酸含量。

      脯氨酸含量測定:脯氨酸含量測定采用水浴浸提法[17]。

      根系活力測定:根系活力測定采用TTC法[20]。

      1.5 耐草甘膦相關(guān)基因表達檢測

      1.5.1 葉片總RNA的提取和cDNA合成 取凍存的幼嫩葉片經(jīng)液氮研磨后,選用TransZol Up試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司) 進行總RNA提取。選用全式金生物技術(shù)有限公司的目錄號為AT341-01的試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄后的cDNA保存在-20 ℃冰箱。

      1.5.2 引物設(shè)計 通過Sweetpotato GARDEN 網(wǎng)(http://sweetpotato-garden.kazusa.or.jp/)和Sweet-potato Genomics Resource網(wǎng)(http://sweetpotato.plantbiology.msu.edu/)獲得EPSPS和AKR基因序列,采用Premier3 Plus設(shè)計基因的實時熒光定量分析引物,目前已經(jīng)從甘薯中克隆到5條有序列差異的AKR基因(Itr_sc000139.1_g00024.1,Itr_sc000203.1_g00031.1,Itr_sc000691.1_g00020.1,Itr_sc000862.1_g00011.1,Itr_sc001070.1_g00006.1),為將基因表達完全,分別設(shè)計2條引物AKR-1(Itr_sc000112.1_g00002.1)和AKR-2(Itr_sc000387.1_g00025.1)(表1)。內(nèi)標(biāo)基因甘薯肌動蛋白基因(β-actin)的檢測引物參照楊元軍等[21]的方法合成。

      表1 試驗相關(guān)基因引物Table 1 Primers used in this experiment

      1.5.3 實時熒光定量分析 實時熒光定量PCR檢測的熒光染料為SYBR Green(廈門致善生物科技有限公司),PCR熱循環(huán)儀是Bio-Rad CFX 384,所用軟件為Bio-Rad CFX Manager。反應(yīng)體系為:cDNA模板1.0 μL,引物-F(10 μmol/L) 0.4 μL,引物-R (10 μmol/L) 0.4 μL,2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10.0 μL,Nuclease-free Water 8.2 μL,反應(yīng)體系總體積為20 μL。兩步法實時熒光定量PCR擴增反應(yīng)條件為:94.0 ℃預(yù)變性2 min,94.0 ℃變性5 s,60.0 ℃退火30 s,45個循環(huán);熔合曲線反應(yīng)溫度為65~95 ℃;每個樣品設(shè)3個重復(fù)及NTC對照。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)實時熒光定量PCR的擴增曲線和熔解曲線[14]。目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法進行相對定量[22]。

      1.6 數(shù)據(jù)分析

      試驗數(shù)據(jù)的方差分析采用DPS處理,用Excel制圖。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 噴施草甘膦對甘薯葉片莽草酸含量的影響

      由圖1可以看出,噴施草甘膦之后第2天和第5天,2個甘薯品種葉片的莽草酸含量處理A2均高于對照處理A1,與草甘膦敏感型品種N3589相比,草甘膦抗性品種鄂薯11 A2處理的葉片莽草酸含量升高不明顯。噴施草甘膦后第8天和第11天,草甘膦敏感型品種N3589處理A2的葉片莽草酸含量迅速下降,略高于處理A1;鄂薯11處理A2的莽草酸含量略有下降,但也略高于對照A1。由此可知,噴施草甘膦后,敏感型材料N3589的莽草酸迅速積累,而抗性品種鄂薯11的莽草酸積累較少。

      圖1 噴施草甘膦后甘薯葉片莽草酸含量的變化Fig.1 Changes of shikimic acid content in sweet potato leaves after spraying glyphosate

      2.2 噴施草甘膦對甘薯脯氨酸含量的影響

      由圖2和圖3可以看出,噴施草甘膦之后,草甘膦敏感型甘薯品種N3589葉片和塊根的脯氨酸含量先升高后降低,最大值出現(xiàn)在噴施后第5天;草甘膦抗性品種鄂薯11葉片和塊根的脯氨酸含量表現(xiàn)為先升高后降低又略微升高的趨勢,最大值也出現(xiàn)在噴施后第5天。無論是敏感型品種N3589還是抗性品種鄂薯11,噴施草甘膦之后,葉片和塊根中脯氨酸含量都顯著升高。由此可見,與對照相比,噴施草甘膦之后,甘薯葉片和塊根的脯氨酸含量均顯著升高。

      圖2 噴施草甘膦后甘薯葉片脯氨酸含量的變化Fig.2 Changes of proline content in sweet potato leaves after spraying glyphosate

      圖3 噴施草甘膦后甘薯塊根脯氨酸含量的變化Fig.3 Changes of proline content in sweet potato tuber after spraying glyphosate

      2.3 噴施草甘膦對甘薯根系活力的影響

      由圖4可以看出,噴施草甘膦之后,2個甘薯品種處理A2的根系活力都是先升高后降低,最大值都出現(xiàn)在噴施草甘膦之后第5天,與噴施清水對照處理A1的變化趨勢一致。與噴施清水對照處理A1相比,2個甘薯品種處理A2的根系活力均降低,一直到噴施草甘膦之后第11天,與對照A1相比,2個甘薯品種噴施草甘膦處理A2的根系活力差距減小。說明,無論敏感型還是抗性甘薯品種,噴施草甘膦之后,甘薯的根系活力均顯著降低;而噴施草甘膦11 d后根系活力有所恢復(fù)。

      圖4 噴施草甘膦后甘薯根系活力的變化Fig.4 Changes of sweet potato root vigor after spraying glyphosate

      2.4 甘薯耐草甘膦相關(guān)基因的表達

      2.4.1EPSPS基因的表達 由圖5可以看出,噴施草甘膦之后,草甘膦敏感品種N3589的EPSPS基因表達顯著下調(diào),而草甘膦抗性品種鄂薯11的EPSPS基因表達顯著上調(diào)。說明,噴施草甘膦后EPSPS基因是否上調(diào)表達,可以作為植物是否耐草甘膦的標(biāo)志。

      圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同Different lowercase letters indicate significant differences among treatments(P<0.05).The same below圖5 噴施草甘膦后甘薯葉片EPSPS基因相對表達水平Fig.5 Relative expression levels of sweet potato EPSPS gene after spraying glyphosate

      2.4.2AKR基因的表達 由圖6和圖7 可以看出,相較于對照(A1),噴施草甘膦處理(A2)的AKR-1和AKR-2基因的相對表達有較為相似的變化規(guī)律。在噴施草甘膦之后第2天,草甘膦敏感品種N3589的AKR基因均表達上調(diào);第5天,AKR-1基因下調(diào)表達,AKR-2基因上調(diào)表達;第8天以及第11天,AKR基因均顯著下調(diào)表達。對于草甘膦抗性品種鄂薯11,噴施草甘膦后第2天,AKR基因表達顯著下調(diào);之后,均上調(diào)表達。說明,噴施草甘膦之后,敏感品種的AKR基因先上調(diào)表達后下調(diào)表達,而抗性品種的AKR基因先下調(diào)表達后上調(diào)表達。

      圖6 噴施草甘膦后甘薯葉片AKR-1基因相對表達水平Fig.6 Relative expression levels of sweet potato AKR-1 gene after spraying glyphosate

      圖7 噴施草甘膦后甘薯葉片AKR-2基因相對表達水平Fig.7 Relative expression levels of sweet potato AKR-2 gene after spraying glyphosate

      3 討 論

      3.1 噴施草甘膦后甘薯生理指標(biāo)的變化

      脯氨酸在植物體內(nèi)起到重要的滲透調(diào)節(jié)作用。在逆境條件下,植物體內(nèi)的脯氨酸含量顯著增加,在一定程度上反映了植物的抗逆性[17]。原向陽等[18]研究表明,噴施草甘膦后大豆脯氨酸含量升高,且與草甘膦劑量呈顯著正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,噴施草甘膦后甘薯葉片和塊根的脯氨酸含量均升高,這與前人研究結(jié)果一致。草甘膦引起植物產(chǎn)生各種生理脅迫或氧化脅迫,其中最明顯的癥狀是抑制植物的生長。根系活力是指根的吸收和合成代謝能力,生長速度是根系活力的整體表現(xiàn)[23]。本研究結(jié)果顯示,噴施草甘膦后甘薯的根系活力均顯著降低,但噴施草甘膦11 d后根系活力有所恢復(fù)。

      3.2 草甘膦對甘薯EPSPS和AKR基因表達的影響

      EPSPS是莽草酸途徑中的關(guān)鍵酶[6]。草甘膦會專一抑制EPSPS活性,導(dǎo)致莽草酸大量積累,從而擾亂生物體正常的氮代謝而致其死亡。在草甘膦敏感型雜草中,草甘膦對EPSPS的抑制通常導(dǎo)致莽草酸大量積累,而在耐草甘膦或抗草甘膦雜草中莽草酸積累相對較少[24]。研究認(rèn)為,可以使用莽草酸積累作為區(qū)分草甘膦抗性的參數(shù)[25-27]。EPSPS基因擴增使EPSPS過量表達產(chǎn)生抗藥性[28],這一機制已在8種雜草中有報告[29]。本研究中,草甘膦敏感品種N3589的莽草酸含量遠(yuǎn)高于草甘膦抗性品種鄂薯11,同時噴施草甘膦后,草甘膦抗性品種鄂薯11的EPSPS基因上調(diào)表達,這與前人的研究結(jié)果[28]一致。在噴施草甘膦后,草甘膦敏感型甘薯品種N3589的EPSPS基因顯著下調(diào),而草甘膦抗性甘薯品種鄂薯11的EPSPS基因顯著上調(diào)。

      AKR在植物中主要參與醛基解毒、脅迫防御、滲透液生成及二次代謝和膜運輸[7,9]。在大腸桿菌中抗草甘膦品系的AKR基因表達量高于感病品系,表達的EcAKR4-1能代謝草甘膦產(chǎn)生氨甲基膦酸(AMPA)和乙醛酸[14]。水稻愈傷組織和幼苗對草甘膦的抗性表現(xiàn)為EcAKR4-1過表達和AKR活性增強。研究表明,擬南芥中AKR4C8和AKR4C9可以減少包含活性醛基的有毒化合物范圍[7]。玉米的AKR4C7可以催化山梨糖醇氧化為葡萄糖[30]。來自藍細(xì)菌魚腥藻的AKR17A1可以催化除草劑丁草胺代謝為二羧酸和苯酚[31]。本研究結(jié)果顯示,在噴施草甘膦后,草甘膦敏感型甘薯品種N3589的AKR基因先上調(diào)表達后下調(diào)表達;而草甘膦抗性甘薯品種鄂薯11的AKR基因先下調(diào)表達后上調(diào)表達。由此可推斷,受到草甘膦脅迫后,草甘膦敏感材料的AKR基因迅速啟動,但不能減少草甘膦的脅迫危害;而草甘膦抗性材料的AKR基因反應(yīng)較遲緩,噴施草甘膦5 d后一直處于上調(diào)表達狀態(tài),其具體的代謝機理還有待進一步研究。

      4 結(jié) 論

      本研究結(jié)果顯示,噴施草甘膦后,與敏感型甘薯品種N3589相比,草甘膦抗性品種鄂薯11的莽草酸積累較少,這是由于噴施草甘膦后抗性品種鄂薯11的EPSPS基因迅速上調(diào)表達,從而減少體內(nèi)莽草酸累積對植株造成的傷害;與此同時,在噴施草甘膦后第5天開始,AKR基因迅速上調(diào)表達,從而參與了甘薯體內(nèi)草甘膦的代謝,減少后期草甘膦對植株的危害。至于AKR基因如何參與草甘膦代謝,還有待于進一步研究。

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