陶愛群，姜小文

（湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院，湖南 衡陽 421005）

湖南地處亞熱帶南部，氣候溫暖濕潤，適于柑橘的生長，是中國柑橘重要產(chǎn)地之一。柚（Citrus maxima）是蕓香科柑橘屬植物，其果實營養(yǎng)豐富，富含維生素C，耐儲藏，有“天然罐頭”的美譽。但湖南1 月驟然的降溫、極端低溫或周期性大凍害的襲擊，常導致柚園發(fā)生凍害，影響柚樹生長，繼而影響柚果產(chǎn)量和品質(zhì)。已有的柚類低溫脅迫研究[1-3]結(jié)果表明，柚類越冬期耐寒性存在差異且受外源PP333 調(diào)控。為了解柚的抗寒性差異，筆者選取湖南廣泛栽培的沙田柚、琯溪蜜柚與新品系泉口冰雪柚為試材，研究低溫脅迫后相關生理指標的變化，以期為柚類抗寒育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料選衡陽縣泉口村常規(guī)管理水平的柚園5年生沙田柚、琯溪蜜柚和泉口冰雪柚3 個品種，砧木均為酸柚。

1.2 試驗方法

2018 年12 月下旬—2019 年2 月下旬，每月1 次從正常結(jié)果、樹冠外圍無病蟲害的樹體采取健康生長、長勢基本一致的春梢上第三或第四片葉。將葉片帶至實驗室后，用直徑為1 cm 的打孔器打出葉圓片，分別置于1、-1、-3、-5、-7、-9 和-11℃可調(diào)溫冰箱中（溫度波動±0.5℃）處理12 h 后取出備用,以不經(jīng)低溫處理的材料作對照。

用DDS-312 型精密電導儀測定電導率，參照章文才[4]的方法計算出相對電導率；MDA 含量、SOD活性的測定用氮藍四唑（NBT）法；CAT、POD 活性測定參照李玲等[5]的方法。每個指標測定5 次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010 進行數(shù)據(jù)分析和作圖。

1.3.1 細胞傷害率計算細胞傷害率按相對電導率計算即：細胞傷害率（%）=（R-CK）/（R0-CK）×100%，其中R為低溫處理材料的電導率，R0為低溫處理材料經(jīng)煮沸后的電導率，CK 為對照的電導率。

1.3.2 半致死溫度計算先轉(zhuǎn)化細胞傷害率yi=ln[（k-y）/y]，將Logistic 方程y=（1+ae-et）轉(zhuǎn)化為ln[（k-y）/y]=lna-bt，將細胞傷害率（yi）轉(zhuǎn)變成與處理溫度（t）的直線方程，通過一元回歸方法求出方程參數(shù)a、b 值及相關系數(shù)R。半致死溫度 LT50 即拐點溫度t=lna/b。其中y為實測細胞傷害率，t 為冷凍處理溫度，k 為細胞傷害率的飽和量（本研究中k=100）[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理對電導率的影響

2.1.1 低溫處理對相對電導率的影響3 個柚品種的相對電導率均隨著處理溫度的下降而上升，變化曲線呈S 形，但上升幅度因品種而異（見表1）。當處理溫度由1℃降至-3℃時，3 個品種的相對電導率均低于10%，尤其是泉口冰雪柚僅為5.2%，在此低溫范圍內(nèi)，細胞膜雖因低溫處理產(chǎn)生了一定的傷害，但影響不大；當處理溫度由-3℃下降到-5℃時，3 個品種相對電導率的上升幅度開始增大，琯溪蜜柚的電導率由7.8%上升至19.4%，沙田柚由9.0%上升至25.5%，泉口冰雪柚由5.2%上升至11.2%；當處理溫度由-5℃下降至-9℃時，3 個品種的相對電導率上升幅度進一步增大，琯溪蜜柚由19.4%上升至65.2%，沙田柚由25.5%上升至70.6%，泉口冰雪柚由11.2%上升至46.8%；而當處理溫度由-9℃下降到-11℃時，琯溪蜜柚和沙田柚的相對電導率均呈下降趁勢，分別由65.2%下降至60.3%和由70.6%下降至65.8%，而泉口冰雪柚的相對電導率仍繼續(xù)上升，由46.8%上升至57.3%，但上升幅度有所減緩。

表1 不同低溫處理對3 個柚品種相對電導率的影響 （%）

2.1.2 不同柚品種的半致死溫度由于3 個柚品種的相對電導率變化趨勢呈S 曲線，可以利用Logistic曲線方程進行擬合，3 個柚品種的擬合值系數(shù)均大于0.978 8，呈極顯著水平。琯溪蜜柚、沙田柚和泉口冰雪柚的半致死溫度分別為-8.70、-8.04 和-9.66℃（見表2）。植物半致死溫度的高低能反映植物對低溫的耐受能力。因此3 個柚品種的抗寒能力由弱到強依次為沙田柚、琯溪蜜柚和泉口冰雪柚。

表2 Logistic 方程擬合方程參數(shù)及半致死溫度

2.2 低溫處理對MDA 含量的影響

MDA 是植物遭受低溫脅迫后細胞膜膜脂過氧化形成的產(chǎn)物，其含量的高低代表細胞膜過氧化程度的大小。不同低溫處理后3 個柚品種的MDA 含量均呈上升趨勢，但增長幅度因品種而異（見表3），說明3 個柚品種經(jīng)低溫處理后細胞膜均會發(fā)生過氧化作用，但過氧化程度因品種而不同。在同一低溫處理下，以泉口冰雪柚的MDA 含量最低，即在同一低溫處理下泉口冰雪柚的膜脂過氧化程度低于琯溪蜜柚和沙田柚。

表3 不同低溫處理后3 個柚品種的MDA 含量 （μmol/g）

2.3 低溫處理對CAT、SOD、POD 含量的影響

植物在遭受凍害時體內(nèi)會產(chǎn)生大量的自由基，導致自由基過氧化反應與自由基清除反應失去動態(tài)平衡而使植物產(chǎn)生凍害。植物的氧化系統(tǒng)如抗氧化保護酶主要包括氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）可抵御因低溫脅迫產(chǎn)生的過氧化反應，因此測定抗氧化保護酶的活性可用來確定植物抗寒能力的大小[6]。

SOD 是植物細胞中清除自由基的酶之一，它能催化生物體內(nèi)分子氧活化的中間產(chǎn)物超氧陰離子自由基（·）發(fā)生歧化反應，生成O2和H2O2，從而減輕（·）對植物體的毒害作用[7]，其活性高低是植物抗寒性的重要指標之一。由表4 可知，琯溪蜜柚和沙田柚的SOD 活性在-9～1℃的范圍內(nèi)均隨著溫度的下降而上升，當溫度由-9℃下降到-11℃時則SOD活性下降，說明這2 個品種在-9～1℃的溫度范圍內(nèi)，清除自由基的能力均呈上升趨勢，但隨著溫度的繼續(xù)下降，則酶活性降低，植物的細胞活性也下降。泉口冰雪柚的SOD 活性則隨著溫度的下降一直呈上升趨勢，說明泉口冰雪柚的自由基清除能力隨著溫度的下降一直呈上升趨勢。在溫度為-3～1℃時，SOD 活性是琯溪蜜柚高于泉口冰雪柚，泉口冰雪柚高于沙田柚；而溫度為-11～-3℃時，SOD 活性則是泉口冰雪柚高于琯溪蜜柚，琯溪蜜柚高于沙田柚。

表4 不同低溫處理后3 個柚品種的SOD 活性 [μ/(mg·min)]

CAT 是植物體內(nèi)清除H2O2的酶之一，也是植物應對低溫的防御系統(tǒng)之一，是細胞徹底清除活性氧的關鍵酶，其活性大小與植物的抗寒性有一定關系?，g溪蜜柚和沙田柚的CAT 活性在-7～1℃范圍內(nèi)均隨著溫度的降低呈上升趨勢，而當溫度為-11～-7℃時則隨著溫度的降低而呈下降趨勢；泉口冰雪柚的CAT 活性在溫度為-9～1℃時隨著溫度的降低而上升，在-11～-9℃時隨著溫度的降低而下降；在同一低溫下，CAT 活性是琯溪蜜柚高于泉口冰雪柚，泉口冰雪柚高于沙田柚（見表5）。

表5 不同低溫處理后3 個柚品種的CAT 活性[μ/(mg·min)]

POD 是植物體內(nèi)普遍存在的活性較高的一種酶，也是植物體內(nèi)重要的保護酶之一，與CAT 一起分解由SOD 作用產(chǎn)生的H2O2，生成無害的水，其活性高低與植物的抗逆境能力密切相關。從表6 可知，琯溪蜜柚與沙田柚POD 活性在-7～1℃范圍內(nèi)均隨著溫度的降低而上升，而后隨著溫度的繼續(xù)降低而呈下降趨勢；泉口冰雪柚則是在-9～-1℃范圍內(nèi)隨溫度降低呈上升趨勢，從-9 降至-11℃略有下降；在同一低溫下，POD 活性表現(xiàn)為泉口冰雪柚高于琯溪蜜柚，琯溪蜜柚高于沙田柚。

表6 不同低溫處理后3 個柚品種的POD 活性 [μ/(mg·min)]

3 小 結(jié)

柚的抗寒性高低可通過測定膜透性大小、游離脯胺酸含量、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖含量[8]等指標衡量，也可用半致死溫度和田間表現(xiàn)等指標衡量[9]。該研究通過測定細胞膜的相對電導率和Logistic 方程擬合得出沙田柚、琯溪蜜柚和泉口冰雪柚的半致死溫度分別為-8.04、-8.70 和-9.66℃，這種半致死溫度的排序與3 個品種的田間表現(xiàn)一致。

該研究結(jié)果還表明：在同一低溫處理下泉口冰雪柚的MDA 含量最低；溫度為-11～-3℃時，SOD 活性是泉口冰雪柚高于琯溪蜜柚，琯溪蜜柚高于沙田柚；CAT 活性是琯溪蜜柚和沙田柚在溫度為-11～-7℃時隨著溫度的降低呈下降趨勢，而泉口冰雪柚則是當溫度為-11～-9℃時才隨著溫度的降低而下降；琯溪蜜柚與沙田柚的POD 活性在-7～1℃范圍內(nèi)隨著溫度的降低而上升，而后隨著溫度的繼續(xù)降低而呈下降趨勢，泉口冰雪柚則是在-9～-1℃范圍內(nèi)隨溫度降低呈上升趨勢，從-11～-9℃才略有下降，且在同一低溫下，POD 活性表現(xiàn)為泉口冰雪柚高于琯溪蜜柚，琯溪蜜柚高于沙田柚；沙田柚的3 種酶活性在各低溫處理下均低于琯溪蜜柚和沙田柚。因此，MDA 含量和SOD、CAT、POD 酶活性經(jīng)低溫處理后的變化也證明了泉口冰雪柚最抗寒，琯溪蜜柚居中，沙田柚最不抗寒。