華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的克隆及表達*

康曉彤 陳 輝

(華南農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院 廣州 510642)

華山松(Pinusarmandi)是中國特有的針葉樹種，在秦巴林區(qū)的森林生態(tài)系統(tǒng)中起著十分重要的作用，但秦巴林區(qū)的華山松長期遭受華山松大小蠹(Dendroctonusarmandi)的危害，導致大量華山松死亡(Chenetal.,2006)。華山松大小蠹主要危害30年以上的華山松，造成寄主樹木迅速衰弱，后期引發(fā)多種次期性小蠹聯(lián)合入侵(Chenetal.,2007;2010)。華山松大小蠹所攜帶的藍變真菌秦嶺細粘束孢(Leptographiumqinlingensis)在華山松大小蠹入侵之時就開始破壞華山松樹脂分泌系統(tǒng)，分解寄主樹木木質(zhì)部樹脂道泌脂細胞，隨著菌絲在寄主樹木樹脂道內(nèi)大量繁殖，樹木的薄壁細胞被分解，在華山松大小蠹的協(xié)同作用下，導致寄主樹木的迅速死亡(唐明等，1999)。

萜類化合物(Terpenoids)是針葉樹樹脂的主要成分，由單萜類(C10)、倍半萜類(C15)和二萜類(C20)化合物組成，寄主植物分泌的萜類化合物不僅可以作為趨避劑或毒素對抗植食性昆蟲和致病菌，還可以作為昆蟲識別寄主植物的主要途徑或寄主植物的引誘劑(Bohlmannetal.,1999;Phillipsetal.,1999;Trappetal.,2001;Martinetal.,2002；2003)。針葉樹釋放的單萜類揮發(fā)物可作為小蠹蟲的寄主識別信號，小蠹蟲入侵寄主樹木可誘導寄主揮發(fā)性物質(zhì)變化，進而吸引天敵(Hilkeretal.,2002;Mummetal.,2003)。霍燕等(2010)研究發(fā)現(xiàn)不同被害階段華山松韌皮部釋放的單萜類揮發(fā)物中α-蒎烯相對含量最高，檸檬烯含量則呈增加趨勢。北美云杉(Piceasitchensis)在受到象甲危害后，alpha-pinene synthase基因開始上調(diào)，木質(zhì)部樹脂道α-蒎烯含量也隨之升高；用鉆孔的方式模擬象甲取食，發(fā)現(xiàn)(-)-limonene synthase基因轉(zhuǎn)錄水平升高，檸檬烯含量也相應增加(Byun-McKayetal.,2003,2006)。大量研究表明alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因是松科植物與防御相關重要的單萜合酶基因，且萜類化合物合成與代謝受萜類合酶(terpene synthases，TPS)基因調(diào)控(Byun-McKayetal.,2003；2006;Keelingetal.,2011;Chenetal.,2019)。目前松科(Pinaceae)植物關于TPS的研究主要集中于大冷杉(Abiesgrandis)、挪威云杉(Piceaabies)和北美云杉，火炬松(Pinustaeda)、海岸松(Pinuspinaster)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、馬尾松(Pinusmassoniana)也有部分研究報道。

在針葉樹木萜類化合物生化和分子防御研究中通常采用機械性創(chuàng)傷(Gijzenetal.,1992;Bohlmannetal.,1997;Steeleetal.,1998)或茉莉酸甲酯(MeJA)處理模擬昆蟲的入侵危害(Richardetal.,2000;Martinetal.,2002；2003;F?ldtetal.,2003)。大量研究表明MeJA引起的創(chuàng)傷性樹脂與針葉樹木受到昆蟲和病原體入侵的反應非常相似(Croiséetal.,1993;Franceschietal.,2002;Martinetal.,2002)。

華山松大小蠹主要危害30年以上健康華山松(李臻等，2009)，華山松大小蠹成蟲入侵寄主華山松后，在藍變真菌的協(xié)調(diào)作用下，產(chǎn)生抵御寄主華山松萜烯類化合物等生理生化抗性(唐明等，1999;Daietal.,2019；2020)，但由于華山松大小蠹和藍變真菌誘導寄主華山松萜類合酶相關基因研究的滯后，成為制約揭示華山松大小蠹發(fā)生機制的關鍵因素之一。本研究針對華山松大小蠹入侵危害的特異性，以2年生華山松幼苗為試驗材料，利用MeJA處理和接種秦嶺細粘束孢模擬華山松大小蠹和藍變真菌的入侵危害，克隆受華山松大小蠹和藍變真菌危害后寄主華山松萜類合酶中alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因cDNA的全長，分析alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的表達特性，為深入了解華山松大小蠹和藍變真菌抵御華山松抗性的分子機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑 試驗材料為2年華山松幼苗；Plant RNA Kit植物總RNA提取試劑盒購于Omega Bio-Tek公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastKing RT Kit(With gDNase)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于天根生物有限公司；EasyPure?Quick Gel Extraction Kit購于北京全式金生物技術有限公司；pMD?18-T載體購于北京全式金生物技術有限公司；Trans5α Chemically Competent Cell購于北京全式金生物技術有限公司；2×EasyTaq?PCR SuperMix購于北京全式金生物技術有限公司；Trans2K?Plus DNA Marker購于北京全式金生物技術有限公司；RACE試劑盒SMARTer RACE cDNA Amplification Kit購于TaKaRa公司；茉莉酸甲酯(純度≥95%)購于Sigma-Aldrich公司；秦嶺細粘束孢分離自秦嶺火地塘林區(qū)被害華山松藍變韌皮部和木質(zhì)部組織。

1.2 華山松韌皮部總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成 切取健康的華山松韌皮部組織，放入液氮中充分研磨，使用Plant RNA Kit植物總RNA提取試劑盒提取華山松韌皮部總RNA。提取的總RNA使用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量，NanoDrop超微量分光光度計測定總RNA的濃度和OD值。cDNA第一鏈合成利用FastKing RT Kit(With gDNase)反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成。

1.3 華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因保守區(qū)cDNA片段的擴增 根據(jù)NCBI已報道其他松科植物alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的序列(Trindadeetal.,2016;Halletal.,2013;Byun-McKayetal.,2006;Martinetal.,2004)，使用DNAMAN進行比對，根據(jù)保守區(qū)設計簡并引物(表1)，擴增alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因片段。引物由上海生物工程有限公司合成，產(chǎn)物的反應體系為20 μL，包括1 μL cDNA模板，上下游引物各0.5 μL，10 μL 2×EasyTaq?PCR SuperMix和8 μL RNase-free H2O。PCR反應條件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的條帶，將目的條帶連接到pMD?18-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆子送往生工生物工程(上海)公司測序。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.4 alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的3′RACE擴增 根據(jù)保守片段的測序結果，設計基因特異性上游引物(表1)，并分別與3′RACE試劑盒中對應引物3′RACE Outer Primer和3′RACE Inner Primer組合，進行巢式PCR，以獲得alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的3′非翻譯區(qū)。第一輪PCR擴增反應體系與程序同上，以第一輪擴增的PCR產(chǎn)物為模板進行第二輪擴增。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的條帶，將目的條帶連接到pMD?18-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆子送往生工生物工程(上海)公司測序。將測序所得的片段用DNAMAN進行拼接，獲得含有3′末端的alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的部分序列。

1.5 alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的5′RACE擴增 根據(jù)DNAMAN的拼接結果，設計基因特異性下游引物(表1)，并分別與5′RACE試劑盒中的對應引物5′RACE Outer Primer和5′RACE Inner Primer組合進行巢式PCR，以獲得alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的5′非翻譯區(qū)。第一輪PCR擴增反應體系與程序同上，以第一輪擴增的PCR產(chǎn)物為模板進行第二輪擴增。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的條帶，將目的條帶連接到pMD?18-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆子送往生工生物工程(上海)公司測序。將測序所得的片段與3′RACE的拼接序列用DNAMAN進行拼接，獲得華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的cDNA序列。

1.6 華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因基因序列分析 對克隆獲得的基因進行序列分析，在NCBI上對華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因序列同源性比對，使用在線工具ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)推導基因編碼蛋白質(zhì)的分子量及理論等電點，通過SWISS-MODEL進行同源建模，構建三級結構模型。選取蛋白同源性較高的植物的蛋白序列，利用MEGA7.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 MeJA處理 將MeJA溶于0.1%(體積分數(shù))吐溫20(Tween 20)溶液中，配置成體積分數(shù)有0.01%的MeJA溶液，取100 mL溶液，在20 min內(nèi)均勻噴灑于華山松幼苗上，以0.1%(體積分數(shù))的Tween 20溶液為對照。每個處理重復15株，共處理30株。在處理的0 (未處理)、2、4、8和16 天取樣，于-80 ℃保存。

1.8 秦嶺細粘束孢處理 在華山松幼苗距地面15 cm處用直徑5 mm打孔器鉆孔，將秦嶺細粘束孢接種于各孔中，用保鮮膜包裹，對照組幼苗只打孔，不接種真菌，每個處理重復15株，共處理30株。在處理的0(未處理)、2、4、8和16天取樣，于-80 ℃保存。

1.9 實時熒光定量PCR反應 用實時熒光定量PCR分析華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因，選用18S RNA為內(nèi)參基因(Phametal.,2016)，用Primer Premier 6.0設計熒光定量PCR的引物(表1)。分別提取MeJA和秦嶺細粘束孢處理后0、2、4、8、16天的華山松韌皮部和對照組總RNA?？俁NA提取和第一鏈cDNA合成方法同上。以合成的cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR分析。生物學重復為3次，技術性重復為2次。采用log22-ΔΔCt法計算基因相對表達量。用SPSS 26.0進行顯著性分析，GraphPad 8.0.2作圖。

2 結果與分析

2.1 華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因全長 利用PCR與RACE技術從華山松中克隆出alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因全長cDNA。華山松alpha-pinene synthase基因編碼區(qū)長度為1887 bp，共編碼628個氨基酸，其編碼蛋白的分子量為71.59 kDa，理論等電點(pI)為5.86，該基因序列已提交至GenBank，登錄號為MW234460。Expasy Protscale對alpha-pinene synthase基因蛋白的親水性分析，表明該蛋白是親水性蛋白。華山松(-)-limonene synthase基因編碼區(qū)長度為1 905 bp，共編碼634個氨基酸，其編碼蛋白的分子量為73.01 kDa，理論等電點(pI)為5.97，該基因序列已提交至GenBank，登錄號為MW234461。在線軟件Expasy Protscale對(-)-limonene synthase基因蛋白的親水性進行分析，表明該蛋白是親水性蛋白。通過SWISS-MODEL的Automated Mode華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因進行同源建模，構建三級結構模型(圖1)。

圖1 華山松TPS基因三級結構預測Fig.1 Tertiary structure analysis of TPS gene in P. armandi

2.2 華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因編碼氨基酸序列分析 利用NCBI中的Blastx比對alpha-pinene synthase基因編碼的氨基酸序列，結果顯示華山松alpha-pinene synthase基因與馬尾松的相似度分別為84.90%，與海岸松的相似度分別為84.10%，與北美云杉的相似度為82.96%；華山松(-)-limonene synthase基因與挪威云杉的相似度為82.39%，與北美云杉的相似度為82.39%。

TPS根據(jù)其蛋白序列的相關性分為6類，即Tpsa、Tpsb、Tpsc、Tpsd、Tpse和Tpdf(Bohlmannetal.,1998;Keelingetal.,2006;Trappetal.,2001)，其中裸子植物的TPS基因與被子植物親緣關系較遠，形成了相對獨立的家族(Bohlmannetal.,1998)，即Tpsd，該基因家族又被分為單萜合成酶(Tps-d1)、倍半萜合成酶(Tps-d2)和二萜合成酶(Tps-d3)3類(Keelingetal.,2006;Byun-McKayetal.,2006)。根據(jù)alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因編碼氨基酸序列的比對結果，選取裸子植物其他物種的TPS基因編碼的氨基酸序列，通過MEGA7.0構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖2)，結果表明華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因均屬于Tpsd-1家族，并且華山松alpha-pinene synthase基因與松屬的alpha-pinene synthase基因在同一分支上，華山松(-)-limonene synthase基因與云杉屬的(-)-limonene synthase基因在同一分支上。

圖2 華山松TPS與其他裸子植物TPS基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree based on amino acid sequences of TPS gene from P. armandi and other gymnosperm

2.3 MeJA處理下華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的表達特性 華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因均受MeJA誘導表達(圖3)，MeJA處理后alpha-pinene synthase基因表達量在第2、4 天顯著增加，分別是對照的4.51、2.83倍，第2 天達到極顯著水平。MeJA處理后(-)-limonene synthase基因表達量也呈上調(diào)趨勢，在第2、4天比對照分別增加2.1、2.35倍。說明MeJA處理可以誘導華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的表達。

圖3 MeJA處理下華山松TPS基因表達分析Fig.3 Expression analysis of TPS gene of P. armandi in MeJA treatedt檢驗結果Student’s t-test：*，P<0.05；**，P<0.01.下同。The same below．

2.4 接種秦嶺細粘束后華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的表達特性 華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因均受秦嶺細粘束孢誘導表達，在處理后不同時間的表達量有不同程度的增加(圖4)，接種秦嶺細粘束孢后alpha-pinene synthase基因表達量在第4、8和16天達到顯著水平，分別提高1.87、3.98和10.30倍，其中第16 天達到極顯著水平。(-)-limonene synthase基因表達量在第4、16 天差異顯著，分別提高4.55、8.88倍，并且在第16 天基因表達量達到極顯著水平。說明華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在接種秦嶺細粘束孢后均有不同程度的上調(diào)表達，但在接種后不同時間的表達強度存在差異。

圖4 接種秦嶺細粘束孢后華山松TPS基因表達分析Fig.4 Expression analysis of TPS gene of P. armandi in L. qinlingensis post inoculation

3 討論

針葉樹木抵御病蟲害的防御體系包括原生性防御和誘導性防御(Tomlinetal.,1997;Huberetal.,2004)，在這2種防御中樹脂起著十分重要的作用(Phillipsetal.,1999;Trappetal.,2001;Huberetal.,2004;Martinetal.,2005)。針葉樹木樹脂是由單萜，倍半萜和二萜樹脂酸組成的混合物(Phillipsetal.,1999;Martinetal.,2002)，眾多研究表明樹脂是針葉樹木抵御小蠹蟲和共生藍變真菌入侵危害重要抗性物質(zhì)，特別是以樹脂為主的揮發(fā)性萜類物質(zhì)在抵御小蠹蟲和藍變真菌入侵寄主樹木時發(fā)揮著更為重要的作用(Christiansenetal.,1987;Paineetal.,1997;Franceschietal.,2005)。華山松大小蠹是秦嶺健康華山松的優(yōu)勢先鋒害蟲，攜帶的藍變真菌是華山松大小蠹成功入侵的必要條件，當華山松遭受華山松大小蠹和藍變真菌的侵害時，其體內(nèi)的揮發(fā)性物質(zhì)在種類和含量上發(fā)生改變，從而抵御華山松大小蠹和藍變真菌的進一步傷害(Phametal.,2014)。

大量研究表明，通常用MeJA處理模擬昆蟲或病原體的入侵危害，MeJA處理挪威云杉后能夠誘導復雜的外傷性樹脂反應，包括木質(zhì)部中外傷性樹脂導管的分化，單萜和二萜的積累增加，以及誘導酶活性、單萜合酶和二萜合酶的基因表達(Franceschietal.,2002;Martinetal.,2002;F?ldtetal.,2003)。Milleretal(2005)研究發(fā)現(xiàn)，象甲和MeJA能在北美云杉中誘導出相似的萜類防御反應。本研究用MeJA模擬華山松大小蠹入侵，研究華山松大小蠹危害后華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的表達，結果表明華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在MeJA處理后韌皮部的表達量顯著增加，并且alpha-pinene synthase基因在2天時轉(zhuǎn)錄水平達到最高峰，這與北美云杉MeJA處理后(-)-alpha-pinene synthase基因反應基本一致(Milleretal.,2005)。(-)-limonene synthase基因在4天時轉(zhuǎn)錄水平達到最高峰，與北美云杉(-)-limonene synthase基因在受傷后4～7天達到峰值的研究結果基本一致(Byun-McKayetal.,2006)，這進一步說明alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在針葉樹木抵御有害生物危害中發(fā)揮著非常重要的作用。

Pham等的(2014)研究表明，接種秦嶺細粘束孢可以誘導華山松幼苗韌皮部和木質(zhì)部中單萜和倍半萜含量的升高，隨藍變真菌的入侵誘導寄主華山松分泌更多的樹脂，以抵御菌絲生長和蔓延，從而使韌皮部和木質(zhì)部萜類物質(zhì)積累。Tholl(2006)研究表明針葉樹木產(chǎn)生的萜類化合物受萜類合酶基因調(diào)控，其中alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的調(diào)控作用最為顯著。本研究在秦嶺細粘束孢接種華山松后，華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在不同時間均有明顯的響應，且在處理后不用時間變化存在顯著差異，這說明華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的上調(diào)表達是秦嶺細粘束孢誘導的結果，華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因是抵御華山松大小蠹和藍變真菌入侵的主要因素之一。

4 結論

本研究克隆了華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因，alpha-pinene synthase基因cDNA編碼區(qū)全長為1 887 bp，編碼628個氨基酸，編碼蛋白的相對分子質(zhì)量為71.59 kDa，理論等電點為5.86，屬于親水性蛋白；(-)-limonene synthase基因cDNA編碼區(qū)全長為1905 bp，編碼634個氨基酸，編碼蛋白的相對分子質(zhì)量為73.01 kDa，理論等電點為5.97，屬于親水性蛋白。華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在MeJA處理和秦嶺細粘束孢接種后表達量上調(diào)，是寄主華山松響應華山松大小蠹和藍變真菌入侵危害的關鍵基因，也在寄主華山松抵御華山松大小蠹和藍變真菌入侵危害中發(fā)揮著重要作用，這一研究結果對進一步解析秦嶺巴山林區(qū)華山松大小蠹的發(fā)生機制具有重要的理論價值。