蔡金峰 楊曉明 郁萬文 汪貴斌 曹福亮

(南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210037)

苦楝(Meliaazedarach)為楝科(Meliaceae)楝屬(Melia)落葉喬木，在亞洲熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛分布，是速生、多功能、可綜合利用的樹種(鄭萬鈞，2004)?？嚅匀环植紖^(qū)廣，分布區(qū)地理氣候因子差異較大，加之苦楝長期處于野生未改良狀態(tài)，生態(tài)環(huán)境和自然選擇對(duì)其影響較大，形成了具有豐富遺傳基礎(chǔ)的多種地理生態(tài)類型(程詩明等，2007)。

目前，國內(nèi)外學(xué)者先后采用RAPD、AFLP、ISSR、SRAP等分子標(biāo)記方法對(duì)苦楝遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究(Olmosetal.，2002；程詩明，2005；夏海濤，2009；陳羨德等，2010；Anoshiyaetal.，2016；廖柏勇等，2016)，但與其他物種相比，苦楝在分子生物學(xué)方面的研究進(jìn)展相對(duì)緩慢，特別是苦楝基因組和轉(zhuǎn)錄組的研究數(shù)據(jù)相對(duì)比較缺乏。另外，對(duì)苦楝分子標(biāo)記的開發(fā)也較為滯后，尚未有具體針對(duì)苦楝自身開發(fā)的SSR引物的相關(guān)報(bào)道，僅有王芳等(2016)參考楝科其他近緣樹種SSR分子標(biāo)記設(shè)計(jì)并篩選出15對(duì)適用于苦楝的SSR引物。因此，目前缺乏適宜的分子標(biāo)記開展苦楝種質(zhì)遺傳多樣性分子評(píng)價(jià)研究，一定程度上影響了苦楝遺傳改良。

近年來，隨著高通量測(cè)序等分子生物學(xué)相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的表達(dá)序列開發(fā)分子標(biāo)記具有明顯的優(yōu)勢(shì)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序不存在物種選擇性，具有高的測(cè)序靈敏度，且無需特異性探針，特別是對(duì)尚未公布基因組測(cè)序信息的物種，可以快速高效地呈現(xiàn)出覆蓋面廣、準(zhǔn)確度高的轉(zhuǎn)錄組信息(應(yīng)東山等，2018)。由此開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記具有共顯性遺傳、多態(tài)性高、重復(fù)性好、條帶清晰、統(tǒng)計(jì)方便、節(jié)約成本等特點(diǎn)，而且由于EST-SSR來源于表達(dá)的基因區(qū)域，可以直接反映相關(guān)基因的多樣性，因此，被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳育種、種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)等領(lǐng)域(陳全求等，2008；徐楊等，2016；李秀宇等，2019)。為進(jìn)一步豐富苦楝SSR分子標(biāo)記，本研究利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)苦楝進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，統(tǒng)計(jì)并分析了轉(zhuǎn)錄組序列中SSR位點(diǎn)的分布特征，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了引物批量設(shè)計(jì)，開發(fā)出16對(duì)多態(tài)性引物，以期為苦楝遺傳多樣性評(píng)價(jià)和遺傳改良提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料為采自南京林業(yè)大學(xué)樹木園4年生苦楝植株的復(fù)葉頂端幼葉，液氮冷凍后-80 ℃超低溫冰箱保存，干冰運(yùn)至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

SSR引物篩選與驗(yàn)證材料采自江蘇、山東、河南、浙江、安徽、江西、湖北、湖南、廣東、廣西10個(gè)省(區(qū))15個(gè)苦楝天然種源的106個(gè)單株(表1)，取樣單株要求生長健壯、無明顯病蟲害，單株間隔200 m以上，采集其復(fù)葉頂端幼嫩葉片，用硅膠迅速干燥，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

表1 苦楝各種源樣本數(shù)量Tab.1 Sample number of 15 Melia azedarach provenances

1.2 SSR位點(diǎn)鑒別和引物設(shè)計(jì)

采用MISA軟件(Scottetal.，2000)對(duì)轉(zhuǎn)錄組序列中的簡單重復(fù)序列進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)SSR不同類型及其分布情況。參數(shù)設(shè)置為：單、二、三、四、五、六核苷酸最少重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5、5次。

用Primer 3軟件(Rozenetal.，2000)對(duì)所篩選的SSR進(jìn)行批量設(shè)計(jì)，隨機(jī)挑選100對(duì)引物(預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度為100～400 bp)，由南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行合成。

1.3 基因組DNA提取及檢測(cè)

采用百泰克植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)進(jìn)行苦楝葉片DNA提取。然后用NanoDrop 2000C分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，同時(shí)用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所提取DNA原液進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。最后統(tǒng)一將DNA原液稀釋到50 ng·μL-1。

1.4 SSR引物篩選與驗(yàn)證

從江蘇南京、山東東營、廣東汕頭、廣西南寧、湖北荊州、浙江樂清6個(gè)種源中，每個(gè)種源選擇1個(gè)單株的DNA為模板，對(duì)100對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增后，分別用2%瓊脂糖凝膠電泳和PAGE凝膠電泳進(jìn)行初步篩選和多態(tài)性篩選，利用來自15個(gè)種源共106個(gè)單株DNA模板對(duì)篩選出的多態(tài)性引物進(jìn)行驗(yàn)證。

PCR反應(yīng)體系：共20 μL，包括2 μL模板DNA(50 ng·μL-1)，1 μL正向引物(10 μmol·L-1)，1 μL反向引物(10 μmol·L-1)，14 μL 2×T5 Super PCR Mix，2 μL雙蒸水。

PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；72 ℃復(fù)延伸5 min，PCR終產(chǎn)物于4 ℃保存。

1.5 遺傳多樣性分析

構(gòu)建原始數(shù)據(jù)矩陣，利用GenAlEx 6.5軟件(Peakalletal.，2012)計(jì)算觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon信息指數(shù)(I)；利用Popgene 1.32軟件計(jì)算多態(tài)性信息含量(PIC)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已提交到美國國家生物信息技術(shù)中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(登錄號(hào)：PRJNA680228)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝

苦楝轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共得到56 373 816條原始序列(raw reads)，去除質(zhì)量低、帶有接頭及N的比例大于10%的reads，共獲得有效序列(clean reads)55 805 916條，Q30高質(zhì)量序列占94.89%，Q20序列占98.06%，GC含量占總堿基44.42%，堿基錯(cuò)誤率為0.01%，說明通過Illumina HiSeqTM2500平臺(tái)測(cè)序得到的苦楝數(shù)據(jù)質(zhì)量比較高，可滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析。

利用Trinity軟件進(jìn)行組裝，去除重復(fù)拼接序列，共獲得20 077條Unigenes，總長度為47 805 499 bp，其中最小拼接長度為201 bp，最大拼接長度為9 487 bp，平均長度為1 431.82 bp，N50長度為1 955 bp。由表2可知，隨著序列長度的增加Unigenes序列數(shù)量呈現(xiàn)逐步遞減趨勢(shì)，表明對(duì)苦楝測(cè)序結(jié)果以及組裝效果較好，此數(shù)據(jù)可用于基因功能相關(guān)分析。

表2 Unigenes長度分布Tab.2 Length distribution of Unigenes

2.2 轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)的數(shù)量與分布

利用MISA軟件，對(duì)苦楝轉(zhuǎn)錄組的20 077條Unigenes序列進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)4 116條Unigenes序列中含有5 469個(gè)SSR位點(diǎn)，763條Unigenes含有2個(gè)及以上的SSR位點(diǎn)，SSR的發(fā)生頻率為20.50%，出現(xiàn)頻率為27.24%，平均距離為8.74 kb，即轉(zhuǎn)錄組序列中平均8.74 kb就可以發(fā)現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)。

苦楝轉(zhuǎn)錄組中單核苷酸至六核苷酸重復(fù)均存在，單核苷酸重復(fù)最多，所占比例超過50%，其次是二核苷酸和三核苷酸重復(fù)。此外，不同重復(fù)類型間SSR序列長度有一定差異，總體長度變化范圍為10～227 bp，平均長度為19.41 bp(表3)。苦楝轉(zhuǎn)錄組序列長度以10 bp為最多，為914個(gè)SSR，占總SSR數(shù)量的16.71%，其次是15 bp(812個(gè)，占14.85%)(圖1)。

表3 苦楝轉(zhuǎn)錄組SSR各重復(fù)類型的分布特點(diǎn)Tab.3 Distribution characteristics of SSR repeat type in Melia azedarach transcriptome

圖1 苦楝轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)長度分布Fig.1 Distribution of SSR loci length in Melia azedarach transcriptome

2.3 轉(zhuǎn)錄組SSR類型和分布特征

在考慮堿基互補(bǔ)的情況下，苦楝轉(zhuǎn)錄組中6種核苷酸重復(fù)類型共存在90種重復(fù)基元。由表4可知，A/T是出現(xiàn)最多的重復(fù)基元，占SSR總數(shù)的50.03%；在二核苷酸重復(fù)中，AC/GT和AT/TA分別占總數(shù)的12.78%和9.09%；在三核苷酸重復(fù)中，AAG/CTT占6.49%，是最主要的重復(fù)基元；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)的SSR重復(fù)基元分布較為分散，出現(xiàn)頻率低。

表4 苦楝轉(zhuǎn)錄組SSR各重復(fù)基元類型及數(shù)量Tab.4 The type and number of SSR repeat motifs in Melia azedarach transcriptome

由表5可知，SSR各重復(fù)類型重復(fù)次數(shù)以6～10次為主，占總數(shù)的51.27%，其次是11～15次重復(fù)，占總數(shù)的29.00%，主要分布在單、二、三核苷酸重復(fù)中，15次以上重復(fù)次數(shù)也主要分布在這3個(gè)重復(fù)類型中。

表5 苦楝轉(zhuǎn)錄組SSR各重復(fù)類型的重復(fù)次數(shù)Tab.5 The repeat number of SSR repeat type in Melia azedarach transcriptome

2.4 轉(zhuǎn)錄組SSR引物設(shè)計(jì)、篩選與多態(tài)性分析

采用Primer3.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共得到引物2 229對(duì)，隨機(jī)選擇100對(duì)引物對(duì)進(jìn)行合成。用6個(gè)苦楝DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)這些引物進(jìn)行初選，結(jié)果有72對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物顯現(xiàn)出單一條帶且條帶清晰，擴(kuò)增效率為72%；再用PAGE凝膠對(duì)這72對(duì)擴(kuò)增的引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，結(jié)果其中16對(duì)引物顯示出了多態(tài)性(圖2、表6)，引物多態(tài)性比率為22.22%，可用于苦楝所有樣本的遺傳多樣性分析。

圖2 部分引物在6份苦楝樣本中的多態(tài)性Fig.2 Polymorphism of partial primers in 6 samples of Melia azedarach1-6分別指江蘇南京、山東東營、廣東汕頭、廣西南寧、湖北荊州和浙江樂清。1 to 6 respectively refer to Nanjing in Jiangsu,Dongying in Shandong,Shantou in Guangdong,Nanning in Guangxi,Jingzhou in Hubei,and Yueqing in Zhejiang.

利用16對(duì)EST-SSR引物對(duì)106個(gè)苦楝個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證多態(tài)性引物的有效性(圖3)。由表6可知，16個(gè)SSR位點(diǎn)共檢測(cè)到56個(gè)等位基因(Na)片段，變幅在2～5個(gè)之間，平均有效等位基因數(shù)為2.31個(gè)；平均Shannon多樣性指數(shù)I為0.861，平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.507。

表6 苦楝16對(duì)多態(tài)性SSR引物信息Tab.6 Characteristics of 16 polymorphic SSR primers of Melia azedarach

圖3 多態(tài)性引物KL-P2-5對(duì)苦楝DNA擴(kuò)增的PAGE 凝膠電泳成像Fig.3 The PAGE gel electrophoresis imaging for amplification of Melia azedarach DNA by polymorphic primer KL-P2-5M：DNA marker；1-106:106個(gè)苦楝單株的DNA樣本 DNA samples from 106 individual plants.

3 討論

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可快速高效獲得數(shù)據(jù)，且數(shù)據(jù)的覆蓋面廣、準(zhǔn)確度高(應(yīng)東山等，2018)，這對(duì)于基因的表達(dá)水平研究、新基因發(fā)現(xiàn)、功能基因定位和分子標(biāo)記開發(fā)至關(guān)重要(李清瑩，2018)。與采用同一測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的其他木本植物(林雪瑩，2018；張文秀等，2019)相比，本研究所獲得的苦楝轉(zhuǎn)錄組序列中Unigenes平均長度或N50值均較大，說明Illumina高通量測(cè)序適合于苦楝轉(zhuǎn)錄組研究，可為苦楝分子標(biāo)記的開發(fā)及遺傳多樣性研究提供信息基礎(chǔ)。

對(duì)SSR位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，苦楝轉(zhuǎn)錄組SSR的發(fā)生頻率為20.50%，平均分布距離為8.74 kb，低于杜仲(Eucommiaulmoides)(26.13 kb)(黃海燕，2013)和紅松(Pinuskoraiensis)(17.38 kb)(張振等，2015)等，說明苦楝具有較高的SSR分布密度，數(shù)量更加豐富；與花椒(Zanthoxylumbungeanum)(7.2 kb)(李立新，2017)和水松(Glyptostrobuspensilis)(林雪瑩，2018)(7.59 kb)的SSR分布距離相近，但高于楠木(Phoebezhennan)(3.37 kb)(時(shí)小東等，2016)和茶樹(Camelliasinensis)(3.68 kb)(陳琪等，2016)等，物種基因組大小、測(cè)序部位及搜索條件等都可能造成這種差異(Varshneyetal.，2005)。研究結(jié)果顯示，除單核苷酸重復(fù)類型外，苦楝轉(zhuǎn)錄組序列中二核苷酸和三核苷酸重復(fù)最多，與楠木(時(shí)小東等，2016)和濕地松(Pinuselliottii)(易敏等，2020)的研究結(jié)果類似。其中AC/GT和AT/TA是二核苷酸重復(fù)中最主要的重復(fù)基元，在三核苷酸重復(fù)中出現(xiàn)頻率最高的是AAG/CTT和AAT/ATT，為SSR引物的篩選提供了重要的參考依據(jù)。研究表明，SSR長度達(dá)到20 bp時(shí)，多態(tài)性較高，是理想的標(biāo)記位點(diǎn)(Temnykhetal.,2001)。本研究表明，苦楝SSR序列平均長度為19.41 bp，其中12～20 bp的SSR數(shù)量為2 748個(gè)(50.25%)，說明苦楝轉(zhuǎn)錄組SSR大部分具有潛在的高多態(tài)性。

本研究中，隨機(jī)挑選的100對(duì)引物中有72對(duì)引物擴(kuò)增出清晰條帶，其余引物無法擴(kuò)增可能與測(cè)序誤差或引物設(shè)計(jì)差異等有關(guān)(李珊珊等，2017)。有研究指出，與基因組SSR相比，EST-SSR具有較好的擴(kuò)增效果，但多態(tài)性相對(duì)不高(胥猛等，2008；董黎等，2019)，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因除了選用試驗(yàn)材料和試驗(yàn)方法不同外，可能是EST-SSR來源于保守性較高的功能基因序列(Eujayletal.，2001)，也可能是EST-SSR來自基因的編碼區(qū)，不含有內(nèi)含子等相關(guān)信息，而基因組序列中本身存在內(nèi)含子造成基因組SSR多態(tài)性高(Vanetal.，2004)。本研究中，初步篩選出的72對(duì)引物中16對(duì)引物表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，在106個(gè)苦楝DNA樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證表明，16對(duì)引物平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.507，根據(jù)Botstein等(1980)標(biāo)準(zhǔn)，中度多態(tài)位點(diǎn)有9個(gè)，高度多態(tài)位點(diǎn)有7個(gè)，說明所選的16對(duì)SSR引物在苦楝上可檢測(cè)到較高的多態(tài)信息含量，為苦楝的遺傳多樣性等研究提供了基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)苦楝轉(zhuǎn)錄組SSR進(jìn)行初步分析，與基于熒光標(biāo)記的SSR毛細(xì)管電泳技術(shù)相比，靈敏度相對(duì)較低(劉歡等，2017)。為進(jìn)一步提高試驗(yàn)的檢測(cè)效率和精準(zhǔn)度，在本研究的基礎(chǔ)上，可以對(duì)開發(fā)設(shè)計(jì)的苦楝SSR分子標(biāo)記進(jìn)一步優(yōu)化，建立苦楝高通量熒光SSR標(biāo)記，以有效促進(jìn)和推動(dòng)苦楝種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)、分子標(biāo)記輔助育種、遺傳圖譜構(gòu)建和功能基因挖掘等研究。

4 結(jié)論

苦楝轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)具有較高的出現(xiàn)頻率和分布密度，基元類型和重復(fù)次數(shù)相對(duì)較高，具有高多態(tài)性的潛能?；谵D(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)篩選的16對(duì)SSR引物在苦楝上可檢測(cè)到較高的多態(tài)信息含量，進(jìn)一步豐富了楝科現(xiàn)有SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)庫資源，可為楝科植物在基因組水平上的遺傳多樣性分析和分子輔助育種等提供參考。