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      基于MALDI-TOF-MS的羊絨羊毛蛋白定量法及其應用

      2021-08-09 09:25:07費靜謝璐蔓吳娟陳曉
      現(xiàn)代紡織技術 2021年4期
      關鍵詞:羊絨羊毛

      費靜 謝璐蔓 吳娟 陳曉

      摘 要:山羊絨與綿羊毛理化性質(zhì)相近,外觀形態(tài)相似,傳統(tǒng)的檢測方法主要是借助顯微鏡或者電鏡,依據(jù)兩者的外觀形態(tài)進行判別,受限于檢測人員的經(jīng)驗,結(jié)果較為主觀。研究從ISO 20418—2提供的MALDI-TOF-MS多肽分析法入手,建立羊絨羊毛定量模型,實現(xiàn)儀器客觀檢測。使用不同產(chǎn)地、不同品種的羊絨以及一些特殊處理的樣品,對該方法的適用性進行驗證;使用不同種類的羊絨產(chǎn)品對方法的準確性進行驗證。結(jié)果表明:該方法對不同產(chǎn)地、不同品種的羊絨有普適性,可用于羊絨制品的定量檢測;但經(jīng)剝色處理的羊絨不適用該定量方法。

      關鍵詞:羊絨;羊毛;蛋白組學分析;MALDI-TOF-MS

      中圖分類號:TS137 文獻標志碼:A

      文章編號:1009-265X(2021)04-0076-05

      Abstract:Cashmere and wool have great similarity in physical and chemical properties, and morphological appearance. Cashmere and wool are mainly identified by microscopic or electron microscope examination according to their morphological appearance. The method is subject to the experience of the examiners, thus leading to subjective test results. In this research, we established a cashmere and wool quantitative model based on MALDI-TOF-MS polypeptide analysis method provided in ISO 20418-2 to achieve objective instrument test. The feasibility of this method was verified by using cashmere from different producing areas and of different varieties as well as some samples with special treatment. The accuracy of this method was verified by using cashmere products of different varieties. Results showed that the method was generally applicable to all types of cashmere from different producing areas and of different varieties. The method could be used for quantitative detection of cashmere products. But this quantitative method was not applicable to the cashmere processed by stripping color.

      Key words:cashmere; wool; proteomic analysis; MALDI-TOF-MS

      山羊絨以其纖細、柔軟、保暖的特點,一直以來都是秋冬季節(jié)御寒保暖的寵兒。山羊絨產(chǎn)自山羊,是山羊身上隱藏于粗毛根部的底絨。每年春季天氣轉(zhuǎn)暖的時候,羊絨會自然脫落,牧民趕在羊絨脫落之前通過抓絨這種傳統(tǒng)的方式將羊絨收集起來。一頭成年絨山羊平均每年產(chǎn)絨200~300g,山羊絨因其珍貴稀有而被稱為纖維界的“軟黃金”[1]。

      中國是山羊絨的主要生產(chǎn)國,產(chǎn)量占全球羊絨產(chǎn)業(yè)的75%,出口創(chuàng)匯可觀。山羊絨和直徑相近的綿羊毛,存在著5~10倍的價格差,不良商販常常利用兩者外觀形態(tài)相似,理化性質(zhì)相近的特點,以次充好,謀取暴利[2]。這種欺詐的行為,不僅擾亂了市場的正常秩序,坑害了消費者,也有損中國羊絨生產(chǎn)大國的形象。

      傳統(tǒng)的山羊絨綿羊毛定量檢測方法,無論是ISO標準還是中國的國家標準,均依據(jù)兩種纖維的外觀形態(tài)進行判定,檢測人員的經(jīng)驗成了準確度的最大決定因素。染色環(huán)節(jié)更增加了判定的難度,而其他復雜的加工工藝,使鱗片密度厚度等關鍵指標更加模糊化,進一步增加了檢測難度[3-4]。羊絨羊毛的定量檢測成了檢測行業(yè)的難點,市場的焦點,消費者的痛點。

      缺乏客觀、統(tǒng)一的標準也給貿(mào)易公平公正帶來了不利影響,羊絨出口屢屢受阻。國際山羊絨與駝毛制造商協(xié)會(CCMI)連續(xù)多年在全球市場進行產(chǎn)品質(zhì)量抽查,多次公開指責中國市場羊絨摻假嚴重。

      近年來,DNA檢測法,包括PCR定性檢測方法和基于熒光定量PCR的定量檢測方法,提供了相對客觀的儀器檢測方法[3-5]。眾所周知,纖維的主要成分是角蛋白,而蛋白是由DNA翻譯而來,DNA的差異最終也能體現(xiàn)在表達的蛋白上。日本和意大利在研發(fā)蛋白檢測法方面走在了世界前列。ISO20418—2提供了一種蛋白儀器分析法解決特種動物纖維的定性定量檢測[6]。MALDI-TOF-MS,基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜,作為一種新型的軟電離生物質(zhì)譜技術,越來越多的被用于蛋白質(zhì)、多肽、核酸、寡糖等生物大分子質(zhì)量測定,高通量的蛋白質(zhì)表達譜研究等領域,具有靈敏度高,準確度高,易于實現(xiàn)自動化等優(yōu)點[7]。本研究從MALDI-TOF-MS多肽分析法入手,建立了羊絨羊毛定量檢測標準曲線,使用不同產(chǎn)地,不同品種的羊絨進行方法驗證,并將該定量方法應用于實際樣品的檢測中。

      1 材料與方法

      1.1 供試材料

      用于制作標準曲線的羊絨購自內(nèi)蒙古自治區(qū),羊毛購自國際毛紡組織(IWTO)。不同產(chǎn)地、品種以及經(jīng)特殊處理的羊絨、羊毛樣品購自國際山羊絨與駝毛制造商協(xié)會(FiberBox,edition I, 2013)。羊絨成品由內(nèi)蒙古鄂爾多斯集團,江蘇陽光集團提供。

      1.2 標準混合樣和標準曲線的制備

      使用直徑相近的100%的山羊絨、100%的綿羊毛纖維自制標準混合樣。分別稱取羊絨含量為10%,30%,50%,70%,90%,總質(zhì)量為0.5g山羊絨、綿羊毛絨混合物,將它們用液氮冷凍研磨儀(spex 6870,美國)粉碎,用以提取蛋白。按步驟1.3提取純化蛋白,按步驟1.4酶解角蛋白,按步驟1.5進行MALDI-TOF-MS多肽分析。

      對儀器采集到的針對綿羊毛、山羊絨的特征峰2664m/z、2691m/z,求得峰強度比值(2664m/z/(2664m/z+2691m/z))為橫坐標,以綿羊毛的含量為縱坐標,進行曲線擬合,建立山羊絨綿羊毛定量標準曲線。

      1.3 蛋白提取和分離純化

      將樣品混勻,用液氮冷凍研磨儀粉碎纖維,無條件的也可以用剪刀將標準樣細細剪碎,注意保證樣品均一性和穩(wěn)定性。

      取12.5mg纖維混合物置于1.5mL的離心管中,在離心管中加入0.5mL的提取液(50mM DTT;4%SDS;0.1M磷酸緩沖液pH 7.8),使用旋渦振蕩器混均勻;將離心管置入熱蓋溫控裝置或者水浴鍋于95℃反應30min。取出至室溫后,加入碘乙酰胺(IAA)使溶液濃度調(diào)整至100mM。室溫反應15min后,加入10μL 25mM的DTT溶液終止反應。室溫7 500 g離心5min。上清液即為蛋白溶解液,將其轉(zhuǎn)移置另一個離心管待用。

      使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對提取的蛋白進行分離純化。恒壓120 V,約20 min??捡R斯亮藍染色,蛋白條帶集中在上部、中部、下部3個區(qū)域,切割回收中間約47 KD左右條帶。具體過程可參見ISO20418-2:2018。

      1.4 膠條的酶解

      使用50%乙腈/50 mM碳酸氫胺溶液洗滌膠條以除去考馬斯亮藍。將凝膠置于96微孔板,等凝膠干了以后,加入30 μL的胰蛋白酶溶液(含約150 ng胰蛋白酶),在50 ℃水浴孵育1 h。

      1.5 質(zhì)譜檢測分析

      取1 μL溶液點于MALDI-TOF-MS的耙板上。待溶液干后再點上1 μL HCCA基質(zhì)溶液(25 mg HCCA溶于5 mL的乙腈/0.1%TFA(7∶3))。

      質(zhì)譜檢測。使用MALDI-TOF-MS(Microflex,Bruker,德國)的反射模式分析多肽。設置激光至閾值水平以產(chǎn)生信號,加速電壓20 kV。質(zhì)譜掃描頻率至少50次,每個樣品在不同的部位重復測3次以保證重復性。動物物種特征峰出現(xiàn)在m/e=2 450~2 750處。其中,山羊絨的特征峰出現(xiàn)在2 691m/z;綿羊毛的特征峰出現(xiàn)在2 664 m/z。根據(jù)步驟1.2中描述,確定每個混合含量的橫、縱坐標,建立定量標準曲線。對任意未知樣品,可利用特征峰的強度,對照標準曲線,最終計算得到混合物的含量[6]。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 標準曲線

      對標準混合物進行蛋白檢測分析,每個混合比例3個獨立的樣品。根據(jù)步驟1.5測定特征峰強度。取特征峰比值的平均值確定每個含量的橫坐標,以綿羊含量的百分比為縱坐標,確定混合標樣每個點的位置,對5個點進行曲線擬合,得一直線(圖1),且R2>0.99。

      對山羊絨綿羊毛混合物的未知樣品,對山羊絨,綿羊毛蛋白進行檢測,對照標準曲線即可計算出樣品中羊毛和羊絨的含量。

      2.2 特征樣品的驗證

      使用CCMI fiberbox的山羊絨,綿羊毛樣品對該定量方法進行驗證。樣品的混合比例均為50%/50%,1—4號的山羊絨均產(chǎn)自中國,分別為阿拉善山羊絨、阿爾巴斯山羊絨、遼寧山羊絨、中國紫絨?;旌吓浔鹊木d羊毛為制作標準曲線使用的綿羊毛。每個樣品兩個獨立樣品,最終結(jié)果取平均值,檢測結(jié)果如表1。不同品種的山羊絨檢測值均可以回溯到山羊絨投入量,可見利用兩物種的特征峰強度可以實現(xiàn)混合物的定量。

      為了進一步驗證該定量標準曲線是否適用于不同產(chǎn)地的山羊絨,如表2所示,山羊絨分別產(chǎn)自阿富汗、吉爾吉斯斯坦、土耳其、澳大利亞山羊絨,以及蒙古?;旌媳壤詾?0%/50%。

      由結(jié)果可知,國外不同產(chǎn)地的山羊絨,均在2 664 m/z、2 691 m/z有特征峰,且可以使用2 664 m/z的峰強度與2 691 m/z的峰強度進行定量檢測。檢測的結(jié)果均可以回溯到山羊絨的初始投入量。

      考慮到市場上有更為復雜的樣品,例如拉伸、脫鱗羊毛冒充山羊絨,欺騙消費者,針對這類樣品,也進行了一系列實驗?;旌吓浔热詾?0%/50%,1號羊毛為中國脫鱗羊毛、2號樣品為澳洲拉伸羊毛,3號樣品為中國剝色羊絨(紫絨剝色為白色),另50%為制作標準曲線的山羊絨或綿羊毛。脫鱗羊毛經(jīng)脫鱗處理后與常規(guī)羊毛相比,鱗片密度降低,拉伸羊毛經(jīng)拉伸后鱗片密度和厚度均大為降低,更具迷惑性。3種特殊樣品的定量檢測結(jié)果如表3。

      使用脫鱗羊毛、拉伸羊毛制備的特種樣品檢測結(jié)果基本可以回溯到投入值,表明檢測結(jié)果不受這些處理的影響。檢測過程中發(fā)現(xiàn)剝色紫絨的羊絨檢測數(shù)值偏低,又經(jīng)多次實驗,平均值為35.1%,可見該方法不適用剝色絨。

      2.3 方法應用

      從各大羊絨制品企業(yè)收集了不同比例、不同風格的羊絨制品,包括了散絨、紗線、針織機織面料,其羊絨含量也盡量覆蓋0~100%,使用該方法對各類樣品進行定量檢測,具體樣品的檢測的數(shù)據(jù)如表4。

      3 結(jié)論和討論

      本研究采用了蛋白組學分析的方法,借助MALDI-TOF-MS多肽檢測,通過構建山羊絨/綿羊毛定量標準曲線,建立了綿羊毛含量及與之相對應的特征峰2 664 m/z,2 691 m/z峰強度之間的對應關系,從而實現(xiàn)了未知羊絨、羊毛的定量檢測。

      通過一系列不同品種、不同產(chǎn)地的山羊絨的定量檢測結(jié)果來看,該方法具有很好的廣譜適用性。剝鱗處理,拉伸處理均對其結(jié)果無影響,也表明該方法可用于打擊以次充好。但使用該方法檢測剝色紫絨時發(fā)現(xiàn),山羊絨檢測結(jié)果偏低,推測剝色的氧化劑對角蛋白有破壞作用。

      對散絨、紗絨、針織和機織面料的檢測,表明該方法可用于處于不同階段的羊絨制品的定量檢測。與傳統(tǒng)的顯微鏡法相比,該方法步驟較復雜,但結(jié)果可靠準確,不受檢測人員經(jīng)驗的影響,且可實現(xiàn)批量操作,大大提高了檢測效率。與DNA檢測方法相比,同為儀器檢測,該方法受染料和色素的影響小,聚丙烯酰胺凝膠電泳可一次實現(xiàn)蛋白的分離和純化。對于深色染料和含有色素的樣品,由于PCR反應受色素和其他雜質(zhì)的抑制,DNA必須先經(jīng)過純化步驟才能進行后續(xù)的檢測。而樣品經(jīng)多次染色后,DNA完整性遭破壞,也無法進行DNA定量。但值得一提的是,DNA檢測的靈敏度要優(yōu)于蛋白分析法,低至1%的摻比也能檢測得到。該方法在本實驗室的儀器上,檢測靈敏度經(jīng)多次實驗在5%左右,2%羊絨混合物的羊絨特征峰非常微弱,儀器無法給出確定的峰強度。

      該方法作為又一種新的儀器檢測法,為特種動物纖維定性定量檢測提供了新的思路,對毛紡產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)督檢驗、保護消費者的合法權益具有重要意義。特種動物纖維,尤以羊毛羊絨為代表在定量檢測,還沒有一種方法可以一勞永逸,未來人工智能,圖像識別技術的發(fā)展,或許可以進一步提高圖像識別的準確度。目前看來,只有綜合運用顯微鏡法,DNA法,蛋白分析法,才能得到相對準確的結(jié)果。

      參考文獻:

      [1] KERKHOFF K, CESCUTTI G, KRUSE L, et al. Development of a DNA-analytical method for the identification of animal hair fibers in textiles[J].Textile?Research Journal,2009,79(1):69-75.

      [2] 費靜,唐敏峰,楊娟,等.DNA檢測技術在天然動物纖維鑒別中的應用[J].紡織導報,2012(5):90-91.

      [3] TANG M F, ZHANG W P, ZHOU H, et al. A real time PCR method for quantifying mixed cashmere and wool based on hair mitochondrial[J].Textile Research Journal,2014,84(15):1612-1621.

      [4] SUBRAMANIAN S, KARTHIK T, VIJAYARAAG-HAVAN N N . Single nucleotide polymorphism for animal fibre identification[J].Journal of Biotechnology,2005,116(2):153-158.

      [5] JI W, BAI L, JI M, et al. A method for quantifying mixed goat cashmere and sheep wool[J].Forensic Science International,2011,208(1-3):139-142.

      [6] Textiles-Qualitative and Quantitative proteomic analysis of some animal hair fibers-Part2: Peptide detection using MALDI-TOF-MS.ISO 20418-2:2018[S].Switzerland: ISO copyright office,2018.

      [7] 劉振波,夏蘇蘇,康琳,等.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜在病原微生物鑒定中的應用[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志,2019(3):225-228.

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