葉偉龍 趙鵬程 馬國(guó)武 孫 波

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤[1]，目前臨床上診斷OSCC時(shí)將組織病理作為金標(biāo)準(zhǔn)，但是技術(shù)上存在滯后性、創(chuàng)傷性、靜態(tài)性、偏倚性等局限。本實(shí)驗(yàn)對(duì)文獻(xiàn)中提到的幾種差異表達(dá)的miRNA，以實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)目標(biāo)miRNA在OSCC患者組和健康組之間，以及OSCC患者手術(shù)前后的表達(dá)差異，旨在探討miRNA作為OSCC患者術(shù)前的輔助診斷和術(shù)后療效評(píng)估的參考生物標(biāo)志物的應(yīng)用前景。

資料和方法

一、材料患者納入及主要試劑準(zhǔn)備

受試者：依照倫理委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)，從2017年5月到2018年11月，征得患方同意并收集共計(jì)17例口腔鱗癌患者術(shù)前的唾液，年齡分布為38～79歲，其中男性12例，女性5例。按發(fā)病部位分為5例舌部，4例唇部，4例口底，2例頰部，2例牙齦（表1）。所納入病例的TNM分類均為T2N0M0。作為對(duì)照組，收集11位40～80歲的健康志愿者的唾液。此外還提取了6例患者血液，以及7例患者術(shù)后1～3月的唾液，以檢測(cè)其細(xì)胞外囊泡miRNA表達(dá)變化。

表1 OSCC患者臨床特點(diǎn)

主要試劑：苯甲基磺酰氟、DNase/RNase-Free Water購(gòu)自北京索萊寶公司。廣譜蛋白酶抑制劑購(gòu)自瑞士Roche公司。RIPA裂解液、pH＝6.8和pH＝8.8的1mM Tris-HCL緩沖液、30%丙烯酰胺、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購(gòu)自中國(guó)碧云天公司。SDS L5750、過硫酸銨7727-54-0、TEMED17-1312-01購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。Total Exosome Isolation Kit購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司。PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR? Premix Ex TaqTMII、RNAiso Plus9108購(gòu)自Takara公司。miRNA檢測(cè)外參購(gòu)自中國(guó)天根公司。Cel-miR-39-3p的引物購(gòu)自廣州銳博公司。Hsa-miR-10b-5p、Hsa-miR-486-5p、Hsa-miR-512-3p、Hsa-miR-412-3p的引物購(gòu)自上海吉瑪公司。

表2 蛋白免疫印跡使用抗體及濃度

提取唾液細(xì)胞外囊泡：每日上午，受試者空腹平靜狀態(tài)下，無菌管吸取口內(nèi)唾液1～2mL于離心管，冰上放置。按照試劑盒說明書，向離心管內(nèi)加入等體積PBS溶液，移液器吹打均勻分裝，4℃離心取上清液，以樣本體積：試劑體積＝2∶1的比例加入提取試劑，4℃過夜后再4℃離心，棄上清液。加入PBS溶液溶解沉淀，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

透射電子顯微鏡（TEM）：取適量收集的細(xì)胞外囊泡樣品置于封口膜上，夾取銅網(wǎng)置其上，樣品沉降15min后用濾紙從銅網(wǎng)側(cè)邊輕輕吸干液體。取一定量3%磷鎢酸于封口膜上，將吸干液體的銅網(wǎng)再置于其上負(fù)染5min，濾紙輕輕吸干染液，晾干后行透射電子顯微鏡檢測(cè)。

總蛋白濃度測(cè)定：按照BCA試劑盒說明配制50：1工作液，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白用PBS溶液稀釋至0.5mg/ml。依次將0、1、2、4、8、12、16、20μL的梯度體積的標(biāo)準(zhǔn)蛋白分別加到96孔酶標(biāo)板中，統(tǒng)一用PBS溶液補(bǔ)足到20μL。另在一孔中加入5μL待測(cè)樣品與15μL PBS溶液。向每個(gè)酶標(biāo)孔中加入200μL BCA工作液，37℃孵化30min。冷卻后測(cè)量波長(zhǎng)在563nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，算得總蛋白濃度。

蛋白質(zhì)免疫印跡（WB）：用RIPA裂解細(xì)胞外囊泡，4℃離心取上清液，BCS法測(cè)得蛋白濃度，調(diào)整至2μg/μL，加入5倍的上樣緩沖液，100℃水浴10min。配制15%分離膠，5%濃縮膠，向每個(gè)梳孔中加2μL樣品或者彩虹Marker；設(shè)置電壓80V電泳至樣品到達(dá)濃縮膠與分離膠界限，調(diào)電壓至120V，電泳至溴酚藍(lán)遷移到達(dá)分離膠底部；設(shè)置電流250mA，時(shí)間1h，轉(zhuǎn)至PVDF膜。后將PVDF膜取出，用5%脫脂奶粉封閉1h；加入配制好的一抗，倒置孵育，4℃過夜；于搖床上TBST洗三次，每次10min；加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫下倒置孵育1h；TBST，搖床洗三次，每次15min。A液與B液按1∶1配制發(fā)光液，避光孵育2min，凝膠成像儀成像。

實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）：取一定量細(xì)胞外囊泡，Trizol法提取總RNA，測(cè)得濃度。以100ng總RNA，10μL的反應(yīng)體系行逆轉(zhuǎn)錄。用SYBR作為熒光指示行熒光定量檢測(cè)，反應(yīng)體系為：SYBR PREMIX EX TAQⅡ10μL，上下游引物各8μL，cDNA 2μL，RNAase Free ddH2O 6.4μL。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)樣，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)1次。PCR循環(huán)設(shè)置為：95℃30s循環(huán)1次；95℃5s，60℃30s循環(huán)40次；95℃15s，60℃30s，95℃15s循環(huán)1次。分析熔解曲線與CT值，以2-ΔΔCt法計(jì)算特定基因相對(duì)表達(dá)量。

數(shù)據(jù)分析：使用GraphPad.Prism.v5.0軟件制圖與統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，非參數(shù)t檢驗(yàn)比較差異，P＜0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.唾液細(xì)胞外囊泡的提取與鑒定：通過超高速離心和外泌體分離提取，得到OSCC患者組和健康志愿者組的唾液細(xì)胞外囊泡。TEM檢測(cè)結(jié)果示兩組均表現(xiàn)為典型的囊泡形態(tài)，呈圓形，茶托樣，直徑大小在40～100nm（圖1A）。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示常見的細(xì)胞外囊泡標(biāo)志物CD63、CD81、CD9、Hsp 70在兩組中均正常表達(dá)（圖1B）。

圖1 唾液細(xì)胞外囊泡的提取和鑒定

對(duì)提取的細(xì)胞外囊泡，用BCA蛋白定量法計(jì)算得出總蛋白濃度，可見患者組的蛋白濃度顯著高于健康組（圖2A）；而經(jīng)trizol法提取的總RNA濃度，患者組和健康組并無明顯差異（圖2B）。

圖2 唾液細(xì)胞外囊泡中總蛋白濃度和總RNA濃度

2.miRNA在唾液與血液源囊泡中的表達(dá)：從既往文獻(xiàn)中查找到，miR-21可作為OSCC診斷標(biāo)志物。本次實(shí)驗(yàn)中選擇miR-21作為目標(biāo)序列，對(duì)6例患者術(shù)前的唾液和血液提取總RNA后行RT-qPCR，進(jìn)而得到miR-21的相對(duì)表達(dá)量（圖3）。從柱狀圖中可見血液中miR-21的表達(dá)比唾液更高，而趨勢(shì)則基本一致。為了確定血液與唾液中表達(dá)的相關(guān)性，將miR-21的相對(duì)表達(dá)量繪制成散點(diǎn)圖，加入趨勢(shì)線后計(jì)算得R2＝0.6951，相關(guān)系數(shù)ρ＝0.886，P＜0.05，趨向于正相關(guān)。

圖3 唾液與血液細(xì)胞外囊泡miR-21-5p的相關(guān)性

3.miRNA輔助診斷OSCC：從既往文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，miR-21、miR-10b-5p、miR-486-5p、miR-412-3p、miR-512-3p，可以作為OSCC的診斷標(biāo)志。對(duì)患者組和健康組細(xì)胞外囊泡中5種miRNA的表達(dá)行RT-qPCR檢測(cè)和分析，非參數(shù)t檢驗(yàn)法比較差異。結(jié)果顯示，miR-21-5p和miR-10b-5p在患者組表達(dá)高于對(duì)照組，而miR-512-3p、miR-412-3p、miR-486-5p的表現(xiàn)則無明顯差異（圖4）。

圖4 患者組與健康組唾液細(xì)胞外囊泡中miR-21-5p、miR-10b-5p、miR-512-3p、miR-412-3p、miR-486-5p的相對(duì)表達(dá)量

為了評(píng)估m(xù)iR-21-5p和miR-10b-5p在診斷中的準(zhǔn)確性，根據(jù)各自RT-qPCR結(jié)果，在OSCC診斷中設(shè)置閾值，算得此時(shí)的靈敏度和1-特異度。進(jìn)而得到受試者工作特征曲線（ROC）、曲線下面積（AUC）及置信區(qū)間（CI）（圖5）。結(jié)果顯示AUC（miR-21-5p）＝0.936，95% CI＝（0.849-1.023），P＝0.0001。AUC（miR-10b-5p）＝0.807，95%CI＝（0.646-0.967），P＝0.0069。兩者AUC都大于0.5且接近1.0視為均具有較好的診斷意義。

圖5 miR-21-5p和miR-10b-5p在診斷中的準(zhǔn)確性

4.miRNA輔助OSCC患者術(shù)后判斷：對(duì)7例患者收集術(shù)前及術(shù)后1月的唾液樣本，提取細(xì)胞外囊泡，經(jīng)RT-qPCR測(cè) 試miR-21-5p、miR-10b-5p、miR-486-5p、miR-412-3p、miR-512-3p的 表 達(dá) 變化，并以此繪制柱狀圖。結(jié)果顯示后四種miRNA在術(shù)后3個(gè)月時(shí)未表現(xiàn)出規(guī)律的差異性（圖6B～E）。而對(duì)于miR-21-5p，7例患者中的6例在1月后表現(xiàn)出表達(dá)的下降，1例變化不明顯（圖6A）。對(duì)第7例術(shù)后3月再次提取唾液，測(cè)得miR-21-5p的表達(dá)相對(duì)術(shù)前有顯著的下降。因此，認(rèn)為唾液細(xì)胞外囊泡中的miR-21-5p的表達(dá)，在OSCC術(shù)后療效判斷中具有一定的參考價(jià)值。

圖6 患者手術(shù)前后唾液細(xì)胞外囊泡中miR-21-5p、miR-512-3p、miR-486-5p、miR-412-3p和miR-10b-5p的相對(duì)表達(dá)量

討 論

miRNA是一類有內(nèi)源性基因編碼的、核苷酸鏈長(zhǎng)大概20～24個(gè)的非編碼類RNA，被證實(shí)與多種腫瘤的惡性發(fā)展、轉(zhuǎn)移、抗藥有關(guān)[2]。目前OSCC的病理輔助診斷方法有甲苯胺藍(lán)染色法、組織活檢法、熒光成像法、分子學(xué)檢測(cè)法等[3～7]。在分子學(xué)檢測(cè)中，Ki-67、p53、IV型膠原是報(bào)道較多的OSCC的生物標(biāo)志物[8]。唾液中的主要成分有水，無機(jī)物，以及多種有機(jī)物，其中多種小分子具有輔助臨床診斷的潛能，并且唾液相比血液或者組織取材更容易、安全。但是唾液中的分子具有多源性（口腔內(nèi)為有菌環(huán)境），復(fù)雜性（唾液的分泌受多種調(diào)控），不穩(wěn)定性（唾液中的酶使得蛋白質(zhì)易降解）等問題。

既往研究表明，腫瘤組織會(huì)釋放細(xì)胞外囊泡、循環(huán)腫瘤細(xì)胞及游離核酸進(jìn)入體液循環(huán)[9]。其中細(xì)胞外囊泡的數(shù)量比循環(huán)腫瘤細(xì)胞更多且更易富集，膜的存在也使得相比游離核酸更穩(wěn)定，因而近年來成為相關(guān)研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)[10]。因此提出一個(gè)設(shè)想，以細(xì)胞外囊泡為液體活檢對(duì)象，檢測(cè)細(xì)胞外囊泡來源的miRNA，可以顯著降低實(shí)驗(yàn)復(fù)雜性和受干擾性，提高待測(cè)因子穩(wěn)定性及檢測(cè)結(jié)果可靠性。

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)OSCC患者來源的唾液提取細(xì)胞外囊泡，進(jìn)行TEM和WB檢驗(yàn)，從形貌和表面標(biāo)志物兩個(gè)方向?qū)?xì)胞外囊泡作定性。在細(xì)胞外囊泡的總蛋白質(zhì)與總RNA定量中，發(fā)現(xiàn)OSCC患者組總蛋白濃度相比健康對(duì)照組顯著升高，而總RNA濃度則無明顯差異，表明蛋白質(zhì)表達(dá)過程中存在差異。為探究蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)生變化的原因，對(duì)患者組和健康組唾液細(xì)胞外囊泡中的miR-21-5p、miR-10b-5p、miR-512-3p、miR-412-3p和miR-486-5p這 五 種miRNA進(jìn)行RT-qPCR檢驗(yàn)，結(jié)果顯示在患者組miR-21-5p和miR-10b-5p的表達(dá)顯著增高，這表明miR-21-5p和miR-10b-5p可以作為輔助診斷OSCC的標(biāo)志物。相關(guān)研究表明，miR-21-5p通過拮抗PDCD4，PTEN等的活性，增強(qiáng)腫瘤的惡性行為，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)展；如果競(jìng)爭(zhēng)抑制miR-21-5p的作用，則可相對(duì)抑制OSCC的發(fā)展[11～13]。對(duì)于miR-10b，多種腫瘤的報(bào)道認(rèn)為其促進(jìn)了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)血管生成、抑制凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、抵抗免疫監(jiān)視等，而當(dāng)miR-10b表達(dá)被抑制時(shí)，腫瘤的轉(zhuǎn)移也得以控制，預(yù)后更佳[14～16]。此處分別對(duì)比miRNA在患者組或健康組中的ROC，AUC后，認(rèn)為miR-21-5p和miR-10b-5p在輔助診斷中具有很好的準(zhǔn)確性。此外，也檢測(cè)了唾液和血液中的細(xì)胞外囊泡，獲得miR-21的相對(duì)表達(dá)趨勢(shì)，結(jié)果顯示兩種來源的細(xì)胞外囊泡中，miR-21的表達(dá)近似正相關(guān)，這證實(shí)了唾液源細(xì)胞外囊泡作為診斷指標(biāo)具有很好的可靠性。還采集了OSCC患者術(shù)前術(shù)后唾液行RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果術(shù)后患者唾液中的miR-21的表達(dá)都表現(xiàn)出明顯的下降。