向 陽，王天威，鐘金清，劉雪婷，胡 鯤

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海 201306；2. 上海海洋大學(xué) 國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，上海 201306；3. 上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

皮樂寶又名溴硝醇、布羅波爾，化學(xué)名為2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇，化學(xué)式見圖1，它是一種白色或淡黃色無味晶體粉末。作為一種低毒、價(jià)格低廉、水溶性好、使用濃度低的廣譜殺菌劑，溴硝醇在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、水處理和食品等領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用[1-3]。起初在造紙、化妝品等行業(yè)被作為防腐劑使用[4]，而后在農(nóng)藥方面用于水稻惡苗病[5]、獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病[6]和馬鈴薯黑脛病[7]等細(xì)菌性病害的防治，效果良好，且不易產(chǎn)生藥害。近年來，溴硝醇被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)以治療水霉病[8-9]。溴硝醇可直接作用于細(xì)胞膜表面的硫醇基，使之轉(zhuǎn)化為二硫化物，在細(xì)胞壁上形成一個(gè)巨大突起，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂、孢子失活[10]。González等[11]、Jantrakajorn等[12]和孫鵬等[13]研究發(fā)現(xiàn)，用一定濃度的溴硝醇處理克氏原螯蝦、羅非魚和虹鱒的受精卵時(shí)，可以有效提高其孵化率。

圖1 溴硝醇化學(xué)式Fig.1 Chemical formula of bronopol

藥物中的雜質(zhì)直接影響藥物的純度，同時(shí)也與藥物的質(zhì)量和安全性息息相關(guān)。溴硝醇在pH升高和溫度升高時(shí)，其穩(wěn)定性會(huì)下降并釋放甲醛[14]。此外，溴硝醇在某些條件下，會(huì)降解生成2-溴乙醇、溴代硝基甲烷等產(chǎn)物[15]。目前，工業(yè)上合成溴硝醇的方法主要是利用甲醛與硝基甲烷反應(yīng)生成2-硝基-1, 3-丙二醇，2-硝基-1, 3-丙二醇在NaOH的作用下生成醇鈉中間體，醇鈉中間體再進(jìn)一步與溴素反應(yīng)便可得到溴硝醇，具體反應(yīng)過程如圖2所示[16]。根據(jù)上述合成方法，溴硝醇中可能出現(xiàn)的有關(guān)物質(zhì)主要是2-硝基-1, 3-丙二醇。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于溴硝醇有關(guān)物質(zhì)檢查分析方法的報(bào)道較少，賈鳳聰[17]用薄層層析法成功分離出其主要雜質(zhì)且分離度良好。本課題組的胡鯤等[18]曾建立了一種溴硝醇有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜分析方法。除此之外，梁赤周等[19]利用高效液相色譜對(duì)20%溴硝醇可濕性粉劑進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)分析，取得較好的分析效果。隨著溴硝醇在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的廣泛使用，其安全性和藥物殘留也引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注[20-21]。本研究參照文獻(xiàn)[18]的研究方法并稍做改良，創(chuàng)建了一種溴硝醇有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜測(cè)定方法，開展了專屬性、檢測(cè)限、線性、精密度、再現(xiàn)性、穩(wěn)定性、耐用性等方法學(xué)研究。

圖2 溴硝醇合成路線[16]Fig.2 Synthesis route of bronopol[16]

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皮樂寶(溴硝醇)對(duì)照品，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer，CAS編號(hào)52-51-7(水含量0.3%，純度98.5%)。供試品：復(fù)方皮樂寶粉，長(zhǎng)沙拜特生物科技研究所有限公司；磷酸(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)；甲醇，德國(guó)默克公司；屈臣氏超純水，屈臣氏。

Agilent 1100液相色譜儀和色譜柱，RP-ODS(150 mm×4.6 mm；5 μm)，德國(guó)Bio-Tek 公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：RP-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，流速：1.0 mL/min，流動(dòng)相為磷酸水(磷酸與水的體積比為1∶1 000)和甲醇(體積比95∶5)。

1.3 溶液的配制

空白溶劑：根據(jù)制劑處方及工藝，制備空白輔料樣品。

供試品溶液：在100 mL容量瓶中，放入精確稱取的復(fù)方皮樂寶粉適量(約相當(dāng)于皮樂寶100 mg)，加流動(dòng)相稀釋，搖勻；精確量取1 mL，置于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻備用。

對(duì)照品溶液：在 100 mL容量瓶中，放入精確稱取的皮樂寶對(duì)照品(約10 mg)，加流動(dòng)相超聲使其溶解，自然冷卻至室溫，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。精確量取1 mL，置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻備用。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 專屬性試驗(yàn)

為考察本檢測(cè)方法的專屬性，對(duì)供試品進(jìn)行酸破壞、堿破壞以及氧化破壞試驗(yàn)，各破壞條件參照本課題組的研究[18]并做了適當(dāng)優(yōu)化。

精密稱取雜質(zhì) 2-硝基-1,3-丙二醇 5 mg，加磷酸水溶解作為雜質(zhì)定位溶液，以HPLC法進(jìn)行測(cè)定。

酸破壞試驗(yàn)：精確稱取溴硝醇20 mg，加入1 mol/L鹽酸溶液5 mL，在90 ℃水浴的條件下加熱30 min，取出冷卻至室溫后，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH，加流動(dòng)相稀釋制成每1 mL中含有2 mg的溶液，以HPLC法進(jìn)行測(cè)定。

堿破壞試驗(yàn)：精確稱取溴硝醇20 mg，加入1 mol/L NaOH 5 mL，在90 ℃水浴的條件下加熱30 min，取出冷卻至室溫后，用1 mol/L的鹽酸溶液中和，加流動(dòng)相稀釋制成每1 mL中含有2 mg的溶液，以HPLC法進(jìn)行測(cè)定。

電廠鍋爐在燃用無煙煤和劣質(zhì)煙煤的情況下，由于經(jīng)濟(jì)燃燒還存在一些技術(shù)上的困難，導(dǎo)致煤粉不能完全燃燒，粉煤灰的含碳量一般波動(dòng)于8%～20%。全國(guó)每年從電站粉煤灰中流失近千萬噸的煤炭，不但煤炭資源白白流失，造成極大的資源浪費(fèi)，而且因粉煤灰中含碳量的增加制約了粉煤灰后期的綜合利用。

氧化破壞試驗(yàn)：精確稱取溴硝醇20 mg，加30%過氧化氫5 mL，室溫下放置1 h，取出，再加流動(dòng)相稀釋制成每1 mL中含2 mg的溶液，以HPLC法進(jìn)行測(cè)定。另外精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品20 mg 按上述操作進(jìn)行測(cè)定，作為氧化破壞對(duì)照試驗(yàn)。

1.4.2 溴硝醇含量線性研究及檢測(cè)限、定量限研究

溴硝醇含量線性研究：取溴硝醇對(duì)照品的母液，分別吸取 40、20、10、5、2 mL置于100 mL的容量瓶中，用流動(dòng)相作梯度稀釋，分別制備質(zhì)量濃度為200、100、50、20和0.1 μg/mL的溴硝醇對(duì)照品溶液。以HPLC法進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以濃度和峰面積進(jìn)行線性回歸，擬合曲線。

檢測(cè)限與定量限研究：用信噪比法驗(yàn)證本方法的檢測(cè)限和定量限，稱取溴硝醇對(duì)照品適量，并逐級(jí)稀釋至樣品圖譜中主峰信噪比3∶1時(shí)的濃度為檢測(cè)限，信噪比10∶1時(shí)的濃度為定量限。

1.4.3 精密度與再現(xiàn)性研究

精密度研究：分別吸取 40、20、10、5和2 mL樣品置于100 mL的容量瓶中。用流動(dòng)相作梯度稀釋，分別制備質(zhì)量濃度為200、100、50、20和0.1 μg/mL的溴硝醇對(duì)照品溶液。

按照含量測(cè)定方法，系列梯度濃度的溴硝醇對(duì)照品溶液按照檢測(cè)方法檢測(cè)，日內(nèi) 5次，日間5次。

再現(xiàn)性研究：取樣品，按照供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣 6次，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。

1.4.4 供試品溶液穩(wěn)定性研究

樣品制備供試品溶液，分別在1、4、6、16 h進(jìn)樣分析，進(jìn)樣10 μL，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣2 針，記錄色譜圖峰面積，根據(jù)雜質(zhì)含量和峰面積來考量溶液穩(wěn)定性。

1.4.5 回收率研究

將對(duì)照品加入一定量的空白輔料中，按照含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。進(jìn)行進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，并計(jì)算回收率。

1.4.6 耐用性試驗(yàn)

為探討供試品溶液中主成分與雜質(zhì)的分離度狀況，按照HPLC的色譜條件，分別通過改變柱溫為20和40 ℃、改變流速為0.8和1.2 mL/min，對(duì)樣品(相對(duì)于溴硝醇100 μg/mL)進(jìn)行含量測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性試驗(yàn)結(jié)果

利用高效液相色譜法檢測(cè)得到2-硝基-1,3-丙二醇的保留時(shí)間為 4.0 min，按照面積歸一法測(cè)定純度為97.7%?？瞻兹軇┪窗l(fā)現(xiàn)峰，說明空白溶劑無干擾。各破壞性試驗(yàn)部分色譜圖如圖3～8所示，色譜圖中黑色箭頭標(biāo)識(shí)處即為溴硝醇的保留時(shí)間(約為 4.7 min)。圖4 和圖5 對(duì)比說明樣品在酸破壞的條件下比較穩(wěn)定，未出現(xiàn)降解產(chǎn)物。對(duì)比圖6發(fā)現(xiàn)，樣品在經(jīng)堿破壞后，有降解產(chǎn)物形成，其中已知的有關(guān)物質(zhì)為2-硝基-1,3-丙二醇在色譜圖中并未出現(xiàn)。對(duì)比圖7和圖8發(fā)現(xiàn)，樣品經(jīng)氧化破壞后，僅有少量溴硝醇保留，而氧化破壞對(duì)照組的色譜圖中并未出現(xiàn)溴硝醇，降解產(chǎn)物與主成分分離度良好，且主峰峰純度均大于0.99，物料平衡在102%～106%，符合物料平衡要求(90%～110%)，說明此方法專屬性較好。

圖3 空白溶劑HPLC圖Fig.3 HPLC diagram of blank solvent

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig.4 HPLC diagram of standard substance

圖5 酸破壞的HPLC圖Fig.5 HPLC diagram of acid destruction

圖6 堿破壞的HPLC圖Fig.6 HPLC diagram of alkali destruction

圖7 氧化破壞的HPLC圖Fig.7 HPLC diagram of oxidative damage

圖8 氧化破壞對(duì)照的HPLC圖Fig.8 HPLC diagram of oxidation damage control

由于溴硝醇在堿性(pH>8)條件下不穩(wěn)定，在堿破壞條件下的未知雜質(zhì)峰可能是溴硝醇在強(qiáng)堿作用下的分解產(chǎn)物，通過氧化破壞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，溴硝醇標(biāo)準(zhǔn)品在過氧化氫的作用下被完全氧化，其具體氧化產(chǎn)物還需進(jìn)一步考察，氧化破壞試驗(yàn)組保留部分溴硝醇可能是由于溴硝醇未氧化完全。

2.2 溴硝醇含量線性及檢測(cè)限、定量限研究結(jié)果

將濃度作為橫坐標(biāo)(X)，將峰面積作為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明溴硝醇在質(zhì)量濃度為2～40 μg/mL區(qū)間范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=8.819 3x+2.176 7(R2=0.999 9)。

根據(jù)信噪比法得出溴硝醇的檢測(cè)限為0.1 μg/mL，定量限為1 μg/mL。

2.3 精密度與再現(xiàn)性研究結(jié)果

樣品色譜圖峰面積的日內(nèi)精密度RSD為0.62%，日間精密度RSD為0.08%。從樣品的日內(nèi)精密度和日間精密度來看，本檢測(cè)方法精密度良好。

通過分析樣品的色譜圖，得到其再現(xiàn)性的RSD為0.06%，表明供試品溶液的再現(xiàn)性良好。

2.4 供試品溶液穩(wěn)定性研究結(jié)果

以主峰峰面積和雜質(zhì)含量為指標(biāo)考察溶液穩(wěn)定性，結(jié)果見表1。通過計(jì)算樣品色譜圖的平均峰面積，得到其溶液穩(wěn)定性的RSD為0.27%，表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 回收率研究結(jié)果

分析樣品色譜圖并計(jì)算其回收率，結(jié)果如表2所示，其回收率的RSD為1.79%，說明樣品的回收率良好。

表2 溴硝醇檢測(cè)方法的回收率

2.6 耐用性結(jié)果

不同柱溫和流速的保留時(shí)間和峰面積如表3所示。經(jīng)計(jì)算，不同柱溫的含量測(cè)定值，其RSD為0.35%，不同流速的含量測(cè)定值，其RSD為0.38%，其中證實(shí)通過改變流速、柱溫等參數(shù)基本不會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響，說明本測(cè)定方法的耐用性良好。

表3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

經(jīng)試驗(yàn)，筆者建立了一種簡(jiǎn)單高效、且專屬性良好的測(cè)定溴硝醇有關(guān)物質(zhì)的方法，為溴硝醇相關(guān)藥物的質(zhì)量研究提供了一種參考方案。