張曉強(qiáng),李孟芳,劉品莉

(1.山西省中醫(yī)院,山西 太原 030012;2.山西省太原市迎澤區(qū)郝莊中心衛(wèi)生院,山西 太原 030025)

過(guò)敏性紫癜又稱(chēng)亨諾-許蘭紫癜(henoch-schonlein purpura,HSP),是一種常見(jiàn)的自身免疫參與的血管炎性疾病,臨床表現(xiàn)為皮膚紫癜、關(guān)節(jié)痛、腹痛及腎臟損害等[1]。過(guò)敏性紫癜性腎炎(henoch-schonlein purpura nephritis,HSPN)是其較嚴(yán)重的后遺癥[2]。本課題組前期采用中西醫(yī)結(jié)合方法建立了HSP大鼠模型[3]。近年有學(xué)者提出糖基化缺陷Ig A1(Gd-Ig A1)與HSP發(fā)病有關(guān),而在HSP的病因中感染占第1位?；诖?筆者對(duì)Gd-Ig A1在HSP大鼠模型發(fā)病中的可能機(jī)制進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料與方法

(1)動(dòng)物與分組 選取健康SD大鼠60只,清潔級(jí),體質(zhì)量(180±20)g,6周齡,雌雄各半,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司動(dòng)物室供應(yīng)[使用許可證:SCXK(湘)2019-0004,質(zhì)量合格證:1100111911008834],飼養(yǎng)于云南一同實(shí)驗(yàn)教育科技有限公司中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房。適應(yīng)喂養(yǎng)1周后將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和GABHS感染組,每組30只,依據(jù)分組不同分別飼養(yǎng)于具有獨(dú)立通氣的消毒飼養(yǎng)箱內(nèi),室溫恒定,過(guò)濾空氣,濕度50%～65%,光照10～12 h/d,自由攝取特殊飼料(標(biāo)準(zhǔn)飼料由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司有限公司提供,在標(biāo)準(zhǔn)飼料中加入小麥、花生、奶粉、雞蛋、黃豆、蝦、帶魚(yú)、榛子等混合粉)及純凈水(由深圳宏博水處理設(shè)備有限公司生產(chǎn)的HBⅡ-C型純水機(jī)制備)。注:鏈球菌屬于第4類(lèi)病原微生物,通常情況下不會(huì)引起人類(lèi)或動(dòng)物疾病。

(2)主要試劑和藥物 胡椒、干姜、蓽茇中藥配方顆粒劑(批號(hào)分別為1908098、1911058、1907020,江陰天江藥業(yè)有限公司);A組β型溶血性鏈球菌(GABHS)標(biāo)準(zhǔn)菌株(批號(hào)BNCC338425,蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司);大鼠Gd-Ig A1酶聯(lián)免疫分析試劑盒(貨號(hào):ml059544-1,上海酶聯(lián)生物科技有限公司);大鼠C-反應(yīng)蛋白(CRP)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):ml002010-1,上海酶聯(lián)生物科技有限公司);ASO檢測(cè)試劑盒(多種屬)(貨號(hào):ml059905-1,上海酶聯(lián)生物科技有限公司);Anti-Gd-Ig A1免疫組化試劑盒(貨號(hào):ab212330,Abcam);蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(貨號(hào):G1120,Solarbio);山羊血清(貨號(hào):S9070,Solarbio);DAB顯色試劑盒(20x)(貨號(hào):DA1010,Solarbio);其他常規(guī)試劑由云南一同實(shí)驗(yàn)教育科技有限公司中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 模型建立及方法

(1)血熱證動(dòng)物模型建立 GABHS感染組大鼠采用熱性藥物灌胃建立血熱證動(dòng)物模型,熱性藥物濃度為0.15 g/m L(現(xiàn)用現(xiàn)配,每次灌胃稀釋至2 m L),每日2次。對(duì)照組給予等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃,自由飲食,不做其他處理。共灌胃3周。注:熱性藥物成人(按60 kg計(jì))每日處方量為干姜5 g,蓽茇5 g,胡椒5 g;動(dòng)物給藥量的換算公式為dB＝d A×KB/KA,dB為大鼠每日每kg灌藥量,d A為成人每日每kg用藥量,KB＝0.71,KA＝0.11,為常數(shù)。

(2)GABHS感染及過(guò)敏(炎性)反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 血熱證模型建立后,應(yīng)用在TSB液體培養(yǎng)基恒溫環(huán)境中培養(yǎng)好的GABHS菌株液,待其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,3 500 r/min離心10 min,PBS液洗滌2次,調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度為1010CFU,保存在4℃冰箱中。血熱證模型大鼠連續(xù)5 d經(jīng)口、鼻腔滴注GABHS菌株液,0.5 m L/只,觀察14 d。造模的最后3 d,再次應(yīng)用上述方法激發(fā)過(guò)敏(炎性)反應(yīng)。

1.3 模型觀察與指標(biāo)檢測(cè)

(1)一般狀況 在造模前后觀察大鼠一般狀況,包括體溫、精神狀況、進(jìn)食進(jìn)水量、毛被、活動(dòng)量、舌苔、口唇、結(jié)膜、耳郭、糞便顏色和硬軟度、尿的顏色和氣味等。

(2)指標(biāo)和觀察病理變化 ①尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。造模后兩組大鼠收取12 h尿液,靜置片刻,分別取5 m L放入尿液檢查塑料管中,采用全自動(dòng)尿沉渣分析儀測(cè)定尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。②血細(xì)胞分析、血清免疫相關(guān)指標(biāo)(ASO、CRP)及Gd-Ig A1指標(biāo)。兩組隨機(jī)取20只大鼠,分別于造模前后晨起空腹抽取下腔靜脈血約3 m L,置EDTA抗凝管中,1 h內(nèi)取20μL,用獸用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血細(xì)胞計(jì)數(shù);其余血液在室溫下放置2 h后,4 000 r/min離心15 min,取血清400μL,分裝于3個(gè)EP管中,置入－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎妹嘎?lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清ASO、CRP及Gd-Ig Al水平,操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。③皮膚、腎臟病理檢查。造模后兩組隨機(jī)選取20只大鼠,摘取左右后肢皮膚及雙側(cè)腎臟,用10%中性福爾馬林溶液固定24 h,梯度乙醇(70%、80%、90%、95%、無(wú)水乙醇)脫水,二甲苯透明,石蠟包埋切片,厚度為3μm,分別進(jìn)行HE染色和免疫組化染色,并在光鏡下觀察并拍片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布時(shí)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn),組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);指標(biāo)之間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 對(duì)照組大鼠精神、攝食均較正常。GABHS感染組大鼠造模后出現(xiàn)不同程度喜飲、煩躁、呼吸頻率增高、搔抓、口唇發(fā)干、耳郭赤紅、眼結(jié)膜充血、糞便干燥、小便發(fā)黃、偶見(jiàn)鼻衄等現(xiàn)象,4只大鼠在實(shí)驗(yàn)期間有皮膚紫癜出現(xiàn)。

2.2 尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù) 對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程均未出現(xiàn)明顯尿紅細(xì)胞升高。GABHS感染組大鼠造模后尿紅細(xì)胞較造模前明顯升高,且高于對(duì)照組(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組與GABHS感染組大鼠造模前后尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(個(gè)/m L,±s)

表1 對(duì)照組與GABHS感染組大鼠造模前后尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(個(gè)/m L,±s)

注:1.GABHS,A組β型溶血性鏈球菌。2.與本組造模前比較,△P＜0.01;與對(duì)照組造模后比較,▲P＜0.01。

組別 只數(shù) 造模前 造模后GABHS感染組 30 4.47±2.22 26.73±9.67△▲對(duì)照組 30 4.17±1.76 3.50±1.80

2.3 血液檢查

(1)血細(xì)胞分析 對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程均未出現(xiàn)明顯白細(xì)胞計(jì)數(shù)、N計(jì)數(shù)升高。造模后,GABHS感染組大鼠白細(xì)胞、N計(jì)數(shù)較造模前及對(duì)照組造模后顯著升高(P＜0.01)。見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照組與GABHS感染組大鼠造模前后血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(±s)

表2 對(duì)照組與GABHS感染組大鼠造模前后血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(±s)

注:1.GABHS,A組β型溶血性鏈球菌。2.與本組造模前比較,△P＜0.01;與對(duì)照組造模后比較,▲P＜0.01。

組別 只數(shù)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109/L)中性粒細(xì)胞(×109/L)造模前 造模后 造模前 造模后GABHS感染組 20 4.71±0.57 12.81±3.26△▲ 0.46±0.08 0.79±0.06△▲對(duì)照組 20 4.92±0.70 4.76±0.64 0.46±0.09 0.46±0.08

(2)血ASO、CRP、Gd-Ig A1水平 對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程均未出現(xiàn)明顯血ASO、CRP、Gd-Ig A1升高。GABHS感染組大鼠造模前血ASO、CRP、Gd-Ig A1水平基本處于正常范圍,造模后血ASO、CRP、Gd-Ig A水平明顯升高。造模后,GABHS感染組大鼠血ASO、CRP、Gd-Ig A1水平較造模前及對(duì)照組造模后顯著增高(P＜0.01)。見(jiàn)表3。

表3 對(duì)照組與GABHS感染組大鼠造模前后抗鏈球菌溶血素O、C-反應(yīng)蛋白及糖基化缺陷IgA1水平比較(±s)

表3 對(duì)照組與GABHS感染組大鼠造模前后抗鏈球菌溶血素O、C-反應(yīng)蛋白及糖基化缺陷IgA1水平比較(±s)

注:1.ASO,抗鏈球菌溶血素O;CRP,C-反應(yīng)蛋白;Gd-Ig Al,糖基化缺陷Ig A1;GABHS,A組β型溶血性鏈球菌。2.與本組造模前比較,△P＜0.01;與對(duì)照組造模后比較,▲P＜0.01。

組別 只數(shù) ASO(IU/m L)CRP(μg/m L)Gd-Ig A1(μg/m L)造模前 造模后 造模前 造模后 造模前 造模后GABHS感染組 20 51.95±25.11 204.20±135.15△▲ 1.73±1.43 43.58±26.70△▲ 4.25±1.01 18.43±5.26△▲對(duì)照組 20 51.00±33.21 60.50±34.24 2.07±1.43 1.51±1.23 3.56±1.59 4.21±2.06

2.4 指標(biāo)相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson相關(guān)分析后,血白細(xì)胞計(jì)數(shù)與血Gd-Ig A1水平呈正相關(guān)(r＝0.61,P＜0.01),血ASO與Gd-IgA1水平呈正相關(guān)(r＝0.46,P＜0.05)。

2.5 皮膚、腎臟病理檢查

(1)大鼠后肢皮膚HE染色及免疫組化 大鼠后肢皮膚切片HE染色比較:對(duì)照組皮膚組織光鏡下觀察可見(jiàn)表皮、真皮與皮下組織分界清晰,未見(jiàn)明顯病理變化(圖1見(jiàn)本期第125頁(yè));GABHS感染組皮膚組織光鏡下觀察可見(jiàn)真皮層小血管擴(kuò)張,內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,紅細(xì)胞滲出至血管外組織,血管周?chē)休^多的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2見(jiàn)本期第125頁(yè)),可見(jiàn)GABHS感染組皮膚存在炎性反應(yīng)。大鼠后肢皮膚切片Gd-Ig A1免疫組化比較:對(duì)照組皮膚組織無(wú)Gd-Ig A1的表達(dá)(圖3見(jiàn)本期第125頁(yè));GABHS感染組皮膚組織偶可見(jiàn)輕微棕黃色的Gd-Ig A1的表達(dá)(圖4見(jiàn)本期第125頁(yè))。

圖1 對(duì)照組大鼠后肢皮膚HE染色(×200)

圖2 GABHS感染組大鼠后 肢皮膚HE染色(×200)

圖3 對(duì)照組大鼠后肢皮膚Gd-IgA1免疫組化(×200)

圖4 GABHS感染組大鼠后肢 皮膚Gd-IgA1免疫組化(×200)

(2)大鼠腎臟HE染色及免疫組化 大鼠腎臟HE染色比較:對(duì)照組腎組織結(jié)構(gòu)基本正常,未見(jiàn)明顯病理變化(圖5見(jiàn)本期第125頁(yè));GABHS感染組大鼠腎小球內(nèi)分葉不明顯,系膜區(qū)略增寬,呈彌漫的輕中度的系膜細(xì)胞數(shù)量增多和基質(zhì)增生,腎小球毛細(xì)血管內(nèi)紅細(xì)胞瘀滯,系膜區(qū)和間質(zhì)區(qū)有單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖6見(jiàn)本期第125頁(yè))。大鼠腎臟Gd-Ig A1免疫組化比較:對(duì)照組腎小球系膜區(qū)未見(jiàn)明顯Gd-Ig A1的表達(dá)(圖7見(jiàn)本期第125頁(yè));GABHS感染組腎小球系膜區(qū)有較強(qiáng)的呈棕黃色團(tuán)塊狀或顆粒狀的Gd-Ig A1的表達(dá),或圍繞血管壁呈環(huán)狀沉積(圖8見(jiàn)本期第125頁(yè))。

圖5 對(duì)照組大鼠腎臟HE染色(×200)

圖6 GABHS感染組大鼠 腎臟HE染色(×200)

圖7 對(duì)照組大鼠腎臟Gd-IgA1免疫組化(×200)

圖8 GABHS感染組大鼠腎臟Gd-IgA1腎臟免疫組化(×200)

3 討論

HSP的發(fā)病與感染、食物、環(huán)境污染、藥物、疫苗等導(dǎo)致的免疫損傷有關(guān),其中感染占第1位[4]。A族鏈球菌(GAS)特別是GABHS的感染與HSP發(fā)病關(guān)系密切[5-6],約1/4的HSP患兒腎小球系膜有GABHS抗原沉積[7]。經(jīng)抗感染治療后,HSP的復(fù)發(fā)率顯著降低[8]。

GAS是鏈球菌中致病性較強(qiáng)的一種,當(dāng)人或動(dòng)物感染GAS后,其菌體及內(nèi)部結(jié)構(gòu)、代謝產(chǎn)物可刺激B淋巴細(xì)胞(BC)產(chǎn)生大量ASO。M蛋白(MP)是GAS的主要致病因子,含MP的鏈球菌具有抵抗吞噬的作用。MP與心肌、腎小球基底膜有共同的抗原,可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。GAS可分泌多種胞外酶,這些酶能與淋巴細(xì)胞受體的特定區(qū)域結(jié)合,導(dǎo)致淋巴細(xì)胞增殖;還能與很多血漿蛋白結(jié)合,誘導(dǎo)交叉免疫反應(yīng);還可破壞吞噬細(xì)胞,刺激多形核白細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞,阻止粒細(xì)胞移入,導(dǎo)致血管損傷[1]。本研究發(fā)現(xiàn)HSP大鼠造模前ASO水平基本處于正常范圍,造模后ASO水平明顯升高?？紤]與GABHS感染后,其菌體及內(nèi)部結(jié)構(gòu)、M蛋白片段作為抗原和其釋放的多種胞外酶結(jié)合或刺激BC產(chǎn)生大量ASO及相關(guān)抗體,并產(chǎn)生級(jí)聯(lián)免疫炎性反應(yīng),從而損傷內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)而造成血管炎。

CRP是機(jī)體受到微生物入侵或組織損傷等炎癥性刺激時(shí)肝細(xì)胞合成的急性相蛋白。CRP通過(guò)與配體(如入侵細(xì)菌的磷酰膽堿)結(jié)合,激活補(bǔ)體和單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)導(dǎo)致炎性反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠造模前CRP水平基本處于正常范圍,GABHS感染造模后CRP水平明顯升高,考慮GABHS感染后,CRP可能與GABHS的磷酰膽堿結(jié)合激活補(bǔ)體,進(jìn)而造成免疫炎癥。

HSP的病理是由Ig A介導(dǎo)的,尤其是以Ig A1為主的自身抗體形成和大量Ig A1免疫復(fù)合物(IC)沉積于血管壁造成的小血管炎[9],Ig A1對(duì)HSP的發(fā)生、發(fā)展具有重要的作用[10]。Ig A1一部分是由呼吸道黏膜組織合成,而HSP與呼吸道感染有關(guān)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)GABHS感染組腎小球系膜區(qū)有較強(qiáng)的Gd-Ig A1的表達(dá),考慮與GABHS感染后,呼吸道黏膜產(chǎn)生大量的Ig A1相關(guān)。

正常情況下Ig A1分子可以正常糖基化,其N(xiāo)-乙酰半乳糖胺(Gal NAc)在N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶(Gal NAc T2)的催化下,與Ig A1分子鉸鏈區(qū)絲氨酸或蘇氨酸的羥基相結(jié)合構(gòu)成O-聚糖結(jié)構(gòu),然后在1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(C1Gal T1)的催化下,以1,3鍵將半乳糖連接至Gal NAc上。唾液酸在唾液酸轉(zhuǎn)移酶的催化下,以2,3或2,6鍵與Gal NAc鏈接形成延長(zhǎng)的糖鏈,并使O-聚糖帶負(fù)電荷。然后通過(guò)與肝臟去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)結(jié)合而被清除。而一些原因所致的糖基化缺陷的Ig A1(Gd-Ig A1)由于O-聚糖鏈末端的半乳糖缺失,不能被肝細(xì)胞識(shí)別而被清除。研究發(fā)現(xiàn),GAS表面含有GalNAc結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)可能模擬了Gd-Ig A1的多糖表位,刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,與Gd-Ig A1或GABHS菌體本身交叉反應(yīng)形成Ig A1-IgG-IC沉積于血管壁,導(dǎo)致免疫復(fù)合物性小血管炎,造成體內(nèi)Gd-Ig A1蓄積,Ig A1-IgG-IC與HSPN的發(fā)病密切相關(guān)[12]。因此,GABHS感染為上述免疫復(fù)合物形成的始動(dòng)因素[11]。研究證實(shí),HSP血清及毛細(xì)血管袢、腎小球系膜區(qū)、消化道黏膜組織等沉積的Ig A1均為Gd-Ig A1[11],是引發(fā)腎臟免疫炎性反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)[13]。Ig A1分子的異常糖基化水平高低不同可導(dǎo)致自身抗原暴露程度的差異,決定了自身免疫反應(yīng)強(qiáng)度[14]。本研究證實(shí)GABHS感染組血清Gd-Ig A1水平顯著升高,皮膚及腎臟Gd-Ig A1免疫組化陽(yáng)性表達(dá),提示Gd-Ig A1參與了HSP發(fā)病。

本研究結(jié)果顯示,血白細(xì)胞計(jì)數(shù)與血Gd-Ig A1、ASO與Gd-Ig A1水平呈正相關(guān),可推測(cè)HSP的感染發(fā)病機(jī)制如下:①病原體感染機(jī)體后,其菌體及內(nèi)部結(jié)構(gòu)、代謝產(chǎn)物均可使機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,炎性因子增多,機(jī)體處于BC活化狀態(tài)。②病原體表面含有的Gal NAc結(jié)構(gòu)可能模擬了Gd-Ig A1的多糖表位,刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,與Gd-Ig A1或病原體本身交叉反應(yīng)形成Ig A1-IgG-IC沉積于血管壁,導(dǎo)致免疫復(fù)合物性小血管炎。③上述免疫反應(yīng)會(huì)釋放炎性因子及過(guò)敏介質(zhì),累及多器官及系統(tǒng),出現(xiàn)HSP多變的臨床癥狀和并發(fā)癥。

綜上所述,Gd-Ig A1參與了HSP發(fā)病,感染為上述免疫炎癥形成的始動(dòng)因素。Gd-Ig A1可作為HSP發(fā)病一種重要標(biāo)志,并可作為一種簡(jiǎn)便的臨床檢測(cè)指標(biāo)。血清Gd-Ig A1滴度可隨臨床癥狀的加重(減輕)而升高(降低),而Gd-Ig A1腎臟免疫組化檢測(cè)亦能對(duì)疑難病例進(jìn)行確診或病情評(píng)估。筆者認(rèn)為,長(zhǎng)期或反復(fù)的病原菌感染使機(jī)體處于BC活化狀態(tài)是HSP發(fā)病的體質(zhì)基礎(chǔ)。臨床上對(duì)于有感染征象的HSP患者,應(yīng)常規(guī)進(jìn)行相關(guān)病原體抗體檢查或病原菌培養(yǎng),針對(duì)性地應(yīng)用抗生素治療,可有效縮短HSP病程,降低復(fù)發(fā)率,減輕臟器損傷;緩解期主動(dòng)預(yù)防病原菌感染,可對(duì)其過(guò)敏體質(zhì)進(jìn)行調(diào)治,實(shí)現(xiàn)“體質(zhì)脫敏”及治未病。