謝潤桂 劉勇軍 魏順娣 何曉旋 江建榮

1.廣東省東莞市婦幼保健院(523107) ；2.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

基于母體中胎兒游離DNA的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(NIPT)已廣泛用于臨床胎兒非整倍體篩查，對13-三體、18-三體和21-三體的檢測靈敏度和特異性較高[1-2]。NIPT提示非整倍體高風(fēng)險或其他異常核型，但胎兒染色體是正常的稱為NIPT假陽性。引起假陽性主要原因包括限制性胎盤嵌合、雙胎之一凋亡、母親染色體異常、DNA拷貝數(shù)異常、母體中胎兒DNA含量低以及母親罹患腫瘤等因素[3]。NIPT能夠準(zhǔn)確檢測母體總游離DNA的劑量變化，但無法分辨其變化來源[4]。有報道[5]在半導(dǎo)體測序核心算法基礎(chǔ)上，研發(fā)了一種新的數(shù)據(jù)分析方法，以DNA片段大小來區(qū)分游離DNA劑量變化，稱為胎兒DNA短片段富集法。該方法能夠準(zhǔn)確辨別母體染色體異常引起的游離DNA劑量變化，從而辨別母體來源的假陽性病例，臨床取得較好效果。本研究采用胎兒DNA全片段分析法和短片段富集分析法對已證實(shí)為母體來源和胎盤來源的NPIT假陽性樣本再檢測分析，評價胎兒DNA短片段富集法臨床應(yīng)用效果。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2016年10月-2017年10月本院產(chǎn)前診斷中心檢測發(fā)現(xiàn)并保存的21例NIPT假陽性樣本，所有病例均通過NIPT檢測胎盤及母親外周血確診來源，其中13例為母體染色體異常(4例47，XXX、4例45,X/46,XX嵌合體和5例母體攜帶CNV)，8例胎盤異常來源(2例單體和6例三體)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有孕婦簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①未確定母親外周血染色體核型的病例。②胎兒游離DNA平均讀長<120 bp。

1.2 檢測方法

1.2.1樣本采集按照檢測日期和實(shí)驗(yàn)編號將相應(yīng)的DNA樣本從-80℃中取出，先行DNA濃度和純度檢測，排除不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的樣本，然后采用半導(dǎo)體基因測序技術(shù)進(jìn)行測序。

1.2.2上機(jī)測序半導(dǎo)體基因測序按照晶芯胎兒染色體非整倍體T21、T18、T13檢測試劑盒(CFDA注冊許可證第0153400300號)說明進(jìn)行文庫構(gòu)建和質(zhì)量控制，使用Bioelectron Seq4000系統(tǒng)(CFDA注冊許可證第20153400309號)半導(dǎo)體測序儀進(jìn)行DNA測序。

1.2.3測序數(shù)據(jù)分析①Z值計算：測序數(shù)據(jù)分析的核心算法采用通用函數(shù)計算Z值，比對、過濾所得每個樣本唯一匹配unique Reads數(shù)，并計算每個樣本每條染色體unique Reads數(shù)占該樣本所有常染色體unique Reads數(shù)的百分比chrN，計算待測樣本染色體的Z值，Z值=(樣本的%chrN-參考樣本的%chrN)/參考樣本%chrN的標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)Z值大小判斷染色體是否異常。確定染色體比例，Z值≥3為增加，<3為減少。②染色體位置-劑量分布曲線：以染色體從短臂末端至長臂末端的對應(yīng)位置為橫坐標(biāo)，1M為單位，代表染色體的位置信息，以計算得到的Z值為縱坐標(biāo)，單位為1，代表染色體的劑量信息。③胎兒DNA全片段分析法(簡稱M法)：測序數(shù)據(jù)經(jīng)初步比對和過濾后，再通過GC校正和RUN內(nèi)校正去除干擾信息后，計算得到每條染色體的Z值，在染色體位置-劑量分布曲線上用黑線表示。④胎兒DNA短片段富集分析法(簡稱L法)：在M法基礎(chǔ)上，選擇性分析胎兒DNA短片段富集區(qū)域(游離DNA為片段長度<130 bp)，在染色體位置-劑量分布曲線上用紅線表示。

2 結(jié)果

2.1 母體來源標(biāo)本檢測

在母體來源的假陽性樣本中，當(dāng)母體染色體數(shù)目增加或存在片段重復(fù)時， Z值L法均低于M法；而當(dāng)母體染色體數(shù)目減少或存在片段缺失時，L法Z值為負(fù)值，其絕對值均小于M法。在染色體位置-劑量分布曲線上L方法線比M方法更接近于基線0，見表1和圖1(1080頁)。

表1 母體來源假陽性樣本產(chǎn)前診斷與兩種方法檢測情況

NIPT結(jié)果產(chǎn)前診斷 結(jié)果母親染色體 異常染色體Z值 M方法 L方法 紅線與黑線距基線0距離XO未見異常45,X4.9193.121紅線更靠近基線0X染色體微缺失未見異常46,XX,del(X).[GRCH37/hg19](032.44Mb)6.2484.927紅線更靠近基線0X染色體微缺失未見異常46,XX,del(Xq25q28).[GRCH37/hg19](128Mb153Mb)23.98920.413紅線更靠近基線013染色體微缺失未見異常46,XX,del(13q31.1q31.3)[GRCH37/hg19](83Mb90Mb)×18.3516.341紅線更靠近基線0X染色體微重復(fù)未見異常46,XX,dup(X).[GRCH37/hg19](112Mb120Mb)5.514.933紅線更靠近基線021號染色體微重復(fù)未見異常46,XN,dup(21q21.2).[GRCH37/hg19](25.50Mb26.38Mb)×34.3783.211紅線更靠近基線0

2.2 胎盤來源樣本檢測

在胎盤來源的假陽性樣本中，當(dāng)母體染色體數(shù)目增加或存在片段重復(fù)時，Z值L法均高于M法；而當(dāng)母體染色體數(shù)目減少或存在片段缺失時，L法Z值為負(fù)值，其絕對值均高于M法。在染色體位置-劑量分布曲線上代表L法線比代表M法線更遠(yuǎn)離基線0，見表2和圖2(1080頁)。

表2 胎盤來源假陽性樣本產(chǎn)前診斷與兩種方法檢測情況

3 討論

NIPT的對象是源自胎兒的游離核酸[6]。孕婦從妊娠第4周開始即可檢測到胎兒游離DNA，在最初3個月內(nèi)胎兒游離DNA含量每周增加約21%，且血漿中胎兒游離DNA分子的長度較母源性DNA分子短很多(99%小于313bp)[7]。母體外周血的游離DNA包括來源于胎盤滋養(yǎng)層的胎兒游離DNA和母體白細(xì)胞產(chǎn)生的游離DNA，這些DNA片段的大小分布具有對應(yīng)于核小體(約143bp)和染色質(zhì)(核小體+連接體組蛋白約166bp)的峰值[8]。2010年，Lo等發(fā)現(xiàn)胎兒游離DNA的長度分布與母體細(xì)胞的游離DNA不同，母體血漿中166bp的分子比例減少，<150bp分子比例增加，可能是由于細(xì)胞凋亡過程中不同的核體包裝所致，或核小體結(jié)合力的差異[9]。

由于孕婦外周血的胎兒游離DNA含量僅占血漿總游離DNA的19%，且與母體游離DNA混雜在一起，大量的母體血漿游離DNA會給胎兒游離DNA檢測和分析造成干擾，因此研究者們根據(jù)胎兒游離DNA分子與母體血漿游離DNA的差異，研發(fā)了多種用于分離和富集胎兒游離DNA的方法。2017年Yang等[10]報道了一種基于PCR的選擇性擴(kuò)增胎兒cfDNA的方法。同年Vong等[11]報道了用單鏈DNA文庫制備方法富集母體血漿中胎兒短cfDNA。此外，2014年Yu等[12]報道了用一種基于大小的方法取代了基于計數(shù)的方法檢測常見染色三體，結(jié)果表明這種方法很有應(yīng)用潛力。這些工作都集中在母體血漿中cffDNA的大小差異上，以期在NIPS中取得進(jìn)展。然而，對這些方法的可行性評估仍需要足夠的臨床樣本驗(yàn)證[5]。這些方法都是物理分離方法，增加了額外的實(shí)驗(yàn)成本。

最近，博奧木華公司研發(fā)團(tuán)隊(duì)在半導(dǎo)體測序核心算法的基礎(chǔ)上，研發(fā)了一種非物理分離的胎兒游離DNA富集分析方法。在NIPT檢測中，該方法不用增加額外的實(shí)驗(yàn)成本，只改變分析算法就能準(zhǔn)確辨別母體染色體異常引起的假陽性。該方法獲得測序數(shù)據(jù)后，先用通用函數(shù)核心算法計算Z值分析，根據(jù)在游離DNA片段更短的情況下，胎兒游離DNA比母體游離DNA的比例增加原理，再將母體游離DNA比例高的DNA長片段部分測序數(shù)據(jù)過濾掉，選擇性分析胎兒游離DNA比例高的DNA短片段部分的測序數(shù)據(jù)，稱為胎兒DNA短片段富集分析法。兩種算法分別得到每條染色體相應(yīng)的Z值和染色體位置-劑量分布曲線。應(yīng)用L方法需要注意，該方法將長片段過濾后，測序得到的unique Reads數(shù)量會減少，可能影響結(jié)果判斷。另外，一般NIPT測序的片段長度在165bp，如果DNA片段<120bp該方法失效。因?yàn)镈NA小片段的比例已經(jīng)很高，L方法無法再提高小片段胎兒游離DNA的濃度[5，13]。

相比于M方法，L方法分析時由于短片段DNA中胎兒游離DNA比例增加，如果胎兒游離DNA本身異常，則會將陽性信號放大，表現(xiàn)為Z值的絕對值增大，或者在染色體位置-劑量分布曲線上紅線距離基線0更遠(yuǎn)。相反，如果胎兒游離DNA本身正常，而母體游離DNA異常，則會將陽性信號縮小，表現(xiàn)為Z值絕對值變小，或在染色體位置-劑量分布曲線上紅線距離基線0更近。因此，根據(jù)兩種分析方法Z值絕對值的變化或紅黑線相對基線0的距離，準(zhǔn)確辨別母體來源的假陽性信號，有效減少NIPT假陽性[5，14-15]。盡管胎兒DNA短片段富集分析法可以有效降低假陽性率，但有很多因素影響Z值，比如孕婦體質(zhì)指數(shù)[16]及年齡、孕周、檢測平臺/公司等因素。所以，為了確保實(shí)驗(yàn)室間NIPT的信息交流和透明度，我們建議對不一致的NIPT結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)記錄，并通過外部質(zhì)量控制和認(rèn)證進(jìn)行質(zhì)量保證[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用M方法和L方法不僅能夠識別母體非整倍體異常引起的假陽性，也能夠識別母體本身攜帶CNV引起的假陽性。通過觀察染色體位置-劑量分布曲線上紅黑線相對位置，判斷陽性信號是否為母體染色體異常引起。DNA短片段富集分析法能夠放大胎兒游離DNA的陽性信號，或者縮小母體游離DNA的陽性信號，通過陽性信號的變化準(zhǔn)確判斷陽性信號來源，從而辨別母體來源的假陽性信號；且不增加額外實(shí)驗(yàn)成本。在NIPT檢測中胎兒DNA短片段富集分析法用于辨別母體來源的假陽性病例具有重要應(yīng)用價值。