早期股骨頭壞死動物模型的建立及評價

崔鎮(zhèn)海，金美英，李宗洋，谷 天，錢海峰，陶 悅，李馳坤，尹宏兵*，趙文海

(1.長春中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院，吉林 長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學 附屬第三臨床醫(yī)院，吉林 長春 130117；3.長春中醫(yī)藥大學 附屬醫(yī)院，吉林 長春 130021)

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是因股骨頭缺少血液供應，繼而導致股骨頭結構改變，股骨頭塌陷，引起髖關節(jié)疼痛和活動受限[1]。雖然在臨床上應用中藥治療股骨頭壞死已經(jīng)得到了一定的成效，但其機理尚未明確。為了深入研究ONFH的病因及防治方法，故需要可行、簡單、成功率較高的ONFH的動物模型。以往國內外很多學者選擇四足類動物(如大鼠、兔、犬、豬、羊)來建模，其中大鼠模型獲取方便、重復性高，且通過使用激素來建立激素性股骨頭壞死(steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH)動物模型相對可控，故此次選擇了SD大鼠。由于大鼠股骨頭直徑小，并盡可能模擬人類的站立行走，加大股骨頭負重，故建立直立+單純激素的模型，繼而通過影像學、生化血清實驗數(shù)據(jù)綜合評價出股骨頭壞死的病情變化，為早期股骨頭缺血性壞死的治療提供堅實的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物50只雄性SD大鼠(SPF級)，體質量100～130 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司(許可證號：SCXK(遼)2015-0001)。動物分籠飼養(yǎng)，5只/籠，正常喂食水，自然光照，適應性飼養(yǎng)。后期作為試驗補充再次購進SD大鼠10只(SPF級)，體質量350～400 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司(許可證號：SCXK(遼)2015-0001)。剛購進動物作為空白對照組，正常飼養(yǎng)。試驗過程中對動物處置符合2006年科技部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 藥物及主要試劑注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(注冊證號：HC20160039，規(guī)格：40 mg×10瓶，產品批號：1E8170)，南光化學制藥股份有限公司產品。戊巴比妥鈉溶液、生理鹽水、蒸餾水、動物飼料、墊料、飼養(yǎng)籠、操作臺、試劑盒，均由長春中醫(yī)藥大學動物中心提供。蘇木精、伊紅、中性樹脂封固劑等輔助試劑由長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院提供。

1.3 主要儀器TDL-5M醫(yī)用離心機由長春中醫(yī)藥大學動物中心提供。CT使用X射線計算機斷層攝影設備(TOSHIBA)，型號：ActivionTSX-031A，最多輸出功率(120 kV 300 mA;135 kV 260 mA)由長春中醫(yī)藥大學動物中心提供。

1.4 動物分組及造模按照體質量隨機將實驗動物分為4組：空白組12只，激素組16只，激素+直立組16只，直立組16只。試驗于2019年7月10日-2019年12月21日在長春中醫(yī)藥大學動物中心完成，采用激素+直立誘導大鼠激素性股骨頭壞死模型。

激素組和激素+直立組、直立組動物按體質量用3%戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg)腹腔注射麻醉后，將其雙前肢剪毛和清潔后，用碘伏消毒大鼠上肢皮膚，取前臂近端1/3處橫向切開皮膚，剝離筋膜和肌肉，暴露三角肌下血管神經(jīng)束，并用絲線結扎，在結扎處遠端用咬骨鉗咬斷肱骨，再用剪刀剪斷皮膚、肌肉、血管和神經(jīng)，使上肢截斷。再將肌肉、筋膜、皮膚逐層縫合，最后再縫合處涂青霉素防止感染。使大鼠逐步抬高飲食。

正常飼養(yǎng)2個月后，臀肌注射激素藥物40 mg/kg，每日1次，連續(xù)6 d。激素組注射激素時間、劑量同模型組。直立組、正常組同時間注射同劑量生理鹽水。

1.5 標本制作造模后正常飼養(yǎng)3個月后，分批麻醉(20%烏拉坦溶液，0.5 mL/100g)，拍CT片。腹主動脈取血，加0.1%肝素抗凝，取1 mL全血用血流變儀測定其全血黏度。3 000 r/min離心15 min，取1 mL血漿，測定其血漿黏度；血漿剩余部分于-20℃凍存?zhèn)溆?；取大鼠雙側股骨頭、肝臟，放置于10%甲醛溶液中固定，備用。后期利用乙醇脫水，常規(guī)石蠟切片(片厚3～5 μm)，包埋，依次做好標記。脫蠟和水化后常規(guī)蘇木精伊紅染色，光鏡下觀察。

1.6 測定指標

1.6.1一般觀察 造模后即開始觀察動物精神、毛發(fā)、飲食、二便、體質量及活動狀況。

1.6.2死亡現(xiàn)象觀察 記錄動物死亡時間，并分析死因，統(tǒng)計各組的最終死亡數(shù)量。

1.6.3血清生化及血液流變學檢查 造模后取血，以測定血清生化(高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHO))及血液流變學(全血3.0，30.0，100.0，180.0)數(shù)值。

1.6.4病理組織學檢查 光鏡下觀察組織學切片，肝組織細胞的變化以及骨細胞壞死病理改變以空骨陷窩率體現(xiàn)，即在100倍放大率下，任選5個視野，經(jīng)ipp6.0圖像分析軟件計算單位視野骨小梁面積百分比和空骨陷窩所占百分比。

1.6.5CT觀察 分別于用藥后8，16周，分批取雙髖蛙式位固定于實驗動物臺上，進行CT檢測。

2 結果

2.1 一般形態(tài)觀察結果4組動物股骨頭仍保持圓形，但激素組和激素+直立組動物的股骨頭色澤灰暗，局部充血明顯，骨質松脆，易于鑿開，軟骨面光滑，軟骨未見明顯塌陷，切面肉眼觀察未見明確的壞死灶。

2.2 血清生化及血液流變學(試驗對血脂各項指標的影響)

2.2.1血清生化指標的變化 結果見表1。HDL分析結果顯示，直立組與直立+激素組的標準差相比較小，說明相同造模條件下，予以直立或增加直立方法誘導建立模型的方法的穩(wěn)定性更好；激素組P<0.01，具有顯著性差異，說明激素可以引起HDL的增高且具有統(tǒng)計學意義；直立+激素組的標準差相比較大，說明相同造模條件下，予以聯(lián)合方法誘導建立模型的方法的穩(wěn)定性欠佳，空白組數(shù)值分別與其余3組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。LDL分析結果顯示，4組標準差中直立+激素組的數(shù)值相比較大，說明相同造模條件下，予以聯(lián)合方法誘導建立模型的方法的穩(wěn)定性欠佳；試驗組與空白組相比較，P值均>0.05，無統(tǒng)計學意義。CHO分析結果所示，直立組與直立+激素組的均值較高，說明通過誘導直立狀態(tài)對CHO的影響較大，直立+激素組的標準差相比較大，說明相同造模條件下，予以聯(lián)合方法誘導建立模型的方法的穩(wěn)定性欠佳；試驗組P值均>0.05，差異無統(tǒng)計學意義；組間對照中，激素組與空白組對照，差異具有統(tǒng)計學意義，(P<0.05)。TG分析結果顯示，直立+激素組的標準差相比最小，說明相同造模條件下，予以聯(lián)合方法誘導建立模型的方法的穩(wěn)定性最佳，組間對照中空白組分別于激素組及直立+激素組的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，空白組與直立組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 試驗對血脂指標的影響

2.2.2試驗對血液流變學的影響 結果見表2。血流變全血3.0分析結果顯示，激素組與直立+激素組的標準差相比較小，說明相同造模條件下，予以激素及聯(lián)合激素方法誘導建立模型的方法的穩(wěn)定性更好；激素組與直立+激素組的均值相對較小，可見本方式對以上2組全血3.0數(shù)值的影響較大，組間對照直立+激素組P<0.05，具有顯著性差異，說明直立聯(lián)合激素對全血3.0組有顯著影響，且P<0.05，具有統(tǒng)計學意義，其余試驗組P值均>0.05，無統(tǒng)計學意義。血流變全血30.0分析結果顯示，激素組與直立+激素組的標準差相比較小，說明相同造模條件下，予以激素方法誘導建立模型的方法的穩(wěn)定性更好；組間比較各試驗組P值均>0.05，無統(tǒng)計學意義。血流變全血100.0分析結果顯示，直立+激素組均值明顯高于其余3組，說明本方法對全血100.0的影響較大，4組標準差中直立+激素組的數(shù)值最大，且與其他組差距明顯，說明相同造模條件下，予以直立+激素方法誘導建立模型的方法的穩(wěn)定性較差；組間對照激素組P值<0.05，具有顯著性差異，說明激素對全血100.0組有顯著影響，且具有統(tǒng)計學意義，P<0.05，其他試驗組P值均>0.05，無統(tǒng)計學意義。血流變全血180.0分析結果顯示，4組標準差中激素組的數(shù)值相比較小，說明相同造模條件下，予以激素方法誘導建立模型的方法的穩(wěn)定性更好；且激素組的均值相對較小，說明通過單純使用激素對全血180.0組有顯著影響，且具有意義，P<0.05，組間對照其他試驗組P值均>0.05，無統(tǒng)計學意義。

表2 試驗對血液流變學的影響

結果表明，單純運用直立方式建立大鼠股骨頭壞死較為困難，且對血液流變學及血脂影響較小，效果不佳；使用激素及激素聯(lián)合誘導大鼠直立建立大鼠股骨頭壞死模型且對有一定效果，對血液流變學及血脂均具有一定影響；而激素聯(lián)合直立建立大鼠股骨頭壞死在4組里效果最佳，對血液流變學及血脂影響最大。

2.3 影像學變化CT結果所示，在試驗進行第8周時，每組取2只大鼠，4組動物均未見骨缺血壞死表現(xiàn)。第16周時，空白組及直流組，均未見骨缺血壞死病變。激素組及激素+直立組，骨小梁密度不均勻增粗，斑片狀高密度硬化帶影,邊緣模糊，股骨頭前上部硬化周圍和邊緣部出現(xiàn)類圓形低密度區(qū),局部骨質疏松(圖1)。

圖1 CT掃描橫斷面(左，16周)和矢狀位(右，16周)

2.4 病理學變化

2.4.1肝臟變化 小葉中央靜脈附近有炎細胞浸潤，小葉中央?yún)^(qū)肝細胞(水樣變性)，胞漿疏松化，肝竇變窄(圖2A)。小葉中央靜脈增寬，小葉中央?yún)^(qū)肝細胞胞漿淡染，少量肝細胞脂肪變性，肝索排列基本整齊(圖2B)。小葉中央靜脈居中，肝細胞索排列整齊，以小葉中央靜脈為中心，向四周放射狀，匯管區(qū)可見，動脈、靜脈、膽管(圖2C，D)。

A.激素+直立組；B.激素組;C.直立組;D.空白組

2.4.2空骨陷窩率 使用3%戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg)腹腔注射麻醉處死4組大鼠，經(jīng)后外側切口取雙側股骨頭，剔除股骨頭周圍肌肉和軟組織后，便可從感官上看出股骨頭外形有著細微改變和關節(jié)軟骨面變化，而后用刀將股骨頭從冠狀面劈為兩半，放到10%中性甲醛中固定7 d后再在5%硝酸溶液中浸泡3 d進行脫鈣。使用針灸的針扎入股骨頭中，可完全扎入視為脫鈣完全。然后在用梯度乙醇脫水。經(jīng)乙醇常規(guī)梯度脫水和常規(guī)石蠟包埋，把股骨頭放到切片機上切出4 μm的連續(xù)切片，然后將切片后脫蠟，用蘇木精-伊紅進行常規(guī)染色，將切片用OLYMPUSBX61正置顯微鏡分析切片結構。利用高倍鏡鏡片分析每一切片，選擇5個觀察點統(tǒng)計出數(shù)量為50個骨細胞的空骨陷窩陽性數(shù)，進行空骨陷窩率計算。病理學把衡量激素性股骨頭缺血性壞死的確診技術參數(shù)標準是：在骨小梁中存在大量空骨陷窩的形成或者核固縮現(xiàn)象，存在著伴有周圍骨髓細胞壞死的現(xiàn)象，而試驗中具有這種表現(xiàn)至少1處壞死病癥的實驗動物可確診為股骨頭壞死(表3，圖3，4)。

A.空白組;B.直立組;C激素組;D.激素+直立組

表3 試驗對股骨頭結構的影響 %

結果說明，單純建立直立或者激素動物模型，相對空白組而言無明顯差異，而使用激素聯(lián)合直立2種方式建立模型的方式對模型動物的空骨陷窩率及骨小梁面積百分比均有較大影響。

A.空白組;B.直立組;C激素組;D.激素+直立組

3 討論

據(jù)報道，激素性股骨頭壞死有著較高的致殘率，JONES等[2]發(fā)現(xiàn)糖皮質激素會誘發(fā)ONFH，但截止目前學者們還沒有一致的發(fā)病機制的研究。因此，能夠制備理想的ONFH的動物模型，是探究ONFH病因及發(fā)病機制十分重要的手段，也是為今后臨床工作提供基礎依據(jù)。根據(jù)文獻報道，目前建立股骨頭壞死動物模型的方法主要有：直立法[3-5]、物理法[6-7]、化學法[8]和非創(chuàng)傷法[9-11]。

激素引起ONFH的機制尚未明確，目前3種假說如脂肪代謝紊亂、血管內凝血和骨質疏松。激素影響內分泌調節(jié)紊亂導致局部血脂增高，易堵塞微小血管，進而導致ONFH。在足量的激素刺激下，股骨頭局部容易發(fā)生高凝狀態(tài)及血管內凝血，很有可能導致ONFH。目前，醫(yī)學界對于ONFN的病理演變過程已具備一定的認識，一般認為，首先出現(xiàn)骨細胞的壞死，繼而通過血管再生，從而出現(xiàn)新骨的形成與死骨的吸收[12]。ONFN的病理改變主要是脂肪代謝紊亂。

目前,在激素造模動物試驗中，激素種類的選取以及激素用量尚未有統(tǒng)一的標準，隨之導致的動物模型壞死部位亦不確定性；當前選擇四足動物在ONFH建模中運用較多，但其四足動物與人類負重方式有著明顯的差異，因此如何使其與人類負重方式相接近需要進一步探索，并通過一些人為干預采取雙足站立或許是一種解決方式。

在本試驗中，試驗組(激素+直立組)用藥8周后未見股骨頭塌陷等;用藥16周后出現(xiàn)骨小梁密度不均勻增粗，斑片狀高密度硬化帶影,邊緣模糊，股骨頭前上部硬化周圍和邊緣部出現(xiàn)類圓形低密度區(qū),局部骨質疏松。本研究也存在著一些不足：一方面研究的樣本量相對較少，應用2～4倍的激素劑量后有個別出現(xiàn)不良反應，因而在數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析時說服力較弱；另一方面試驗組觀察的時間較短，不利于動態(tài)觀察ONFH的病理和影像學變化。此外，四足動物造模的最大限制在于其與人類髖關節(jié)負重模式有很大不同，因為大鼠在患側疼痛情況下會采取保護性肢體回縮，同時給模型的建立提升了難度。