蘋果腐敗菌的分離與鑒定

季春艷，段夢晴，曾雅倩，獨(dú)夢蕊，劉生杰，2， 劉艷紅

（1.阜陽師范大學(xué) 信息工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037；2.阜陽師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037）

蘋果中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，因其營養(yǎng)價值高為人們所喜愛，但富含營養(yǎng)也為腐敗微生物滋生提供了良好條件，為蘋果的貯藏保鮮帶來難度[1]。影響蘋果腐敗變質(zhì)的因素有很多，有物理因素、化學(xué)因素、生物因素等，其中微生物感染是導(dǎo)致蘋果腐敗變質(zhì)的重要原因。只要環(huán)境適宜，病原菌侵染蘋果后生長繁殖，分解吸收利用果實(shí)中的營養(yǎng)物質(zhì)，來滿足自身生長代謝的需要，蘋果的營養(yǎng)成分被破壞，果實(shí)腐敗并產(chǎn)生不良?xì)馕?，失去了原有的感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值[2-3]。蘋果的常見微生物侵染型病害有霉心病、輪紋病、青霉病等[4]。引起這些病害的主要微生物為青霉（Penicillium sp.）、鏈格孢菌（Alternaria sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）等，都是從碰、壓、磕、刺傷或病蟲害的部位侵入果實(shí)，引起蘋果發(fā)病。蘋果腐敗變質(zhì)嚴(yán)重阻礙了我國蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

以市售常見紅富士腐爛蘋果為原料，對爛蘋果上的微生物進(jìn)行了分離，通過侵染試驗(yàn)驗(yàn)證分離菌株的致腐能力，并對該微生物進(jìn)行鑒定，以期為深入研究致腐微生物對蘋果的致病機(jī)理和保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

市售自然腐爛紅富士蘋果。

1.2 儀器設(shè)備

BPC-250F 型生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；T100P 型PCR 儀，上海興曼生物科技有限公司產(chǎn)品；BM1000 型光學(xué)顯微鏡，德國Eppendof 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 分離可能的致病菌

挑選腐敗的紅富士蘋果，切除蘋果表面腐敗組織作為樣品，將25 g 果肉樣品加入225 mL 滅菌水中，均質(zhì)，按照10 倍系列稀釋[5]。選擇適當(dāng)?shù)南♂屢?，? mL 的稀釋液涂抹在PDA 培養(yǎng)基上。培養(yǎng)1～2 d，再用平板劃線方法分離純化，連續(xù)純化5～6 次，直至長出單個菌，將純化的菌種置于4 ℃下保存[6-8]。

1.3.2 致腐能力測定

（1）孢子懸浮液制備。將已分離菌接種到PDA培養(yǎng)基上，在28 ℃下培養(yǎng)約5 d，挑取菌落孢子于無菌水中，用血球板計數(shù)，孢子懸浮液的質(zhì)量濃度配制為1×105CFU/mL。

（2）接種。蘋果→清洗→消毒（200 mg/L 次氯酸鈉浸泡10 min）→70 %酒精噴涂蘋果表面→晾干→在蘋果果實(shí)的赤道部位用滅菌不銹鋼鐵釘（約4 mm）形成統(tǒng)一大小的創(chuàng)傷口。每個蘋果隨機(jī)選擇3 個創(chuàng)口接種20 μL 孢子懸浮液，另一個創(chuàng)口接種等量的無菌水作為對照試驗(yàn)。

（3）菌斑直徑的測量。接種后的蘋果放置在28 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，并每天觀察和測量病斑直徑，若蘋果病斑直徑大于2 mm 為腐敗菌，反之不是腐敗菌。

1.3.3 菌株的鑒定

（1）形態(tài)觀察。挑取純培養(yǎng)菌落，于光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)特征，進(jìn)行初步鑒定。

（2）微生物基因組DNA 提取與電泳檢測。采用CTAB 方法提取基因組DNA，主要參照易慶平，馮廣達(dá)等人[9-10]的方法，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%的凝膠，電泳檢測基因組DNA。根據(jù)電泳檢測結(jié)果判斷該菌基因組序列大小[3，11]。

（3）真菌ITS 序列測定與分析。將提取出來的DNA 產(chǎn)物送往北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序，采用ITS 序列擴(kuò)增通用引物ITS4，ITS5 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，從而鑒定分離純化的菌的ITS 序列，將測得的序列通過BLAST 軟件進(jìn)行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離可能的致病菌

注射孢子懸浮液5 d 后的蘋果腐敗情況見圖1。

圖1 注射孢子懸浮液5 d 后的蘋果腐敗情況

2.2 致腐能力測定

注射孢子懸浮液后的病斑直徑見圖2。

圖2 注射孢子懸浮液后的病斑直徑

圖1 是在同一個蘋果上用滅菌不銹鋼鐵釘（約4 mm）形成統(tǒng)一大小的創(chuàng)傷口，4 個創(chuàng)傷口，如圖1（a）（b）（c）（d），分別命名為孔1，2，3，4，其中孔1～3（a～c）是試驗(yàn)組，3 個孔分別接種質(zhì)量濃度為1×105CFU/mL 的該菌孢子懸浮液20 μL 于28 ℃培養(yǎng)5 d，圖1（d）為對照組，即接種等量的無菌水。圖2 為接種后1～5 d 菌斑直徑的測定結(jié)果。從圖1 和圖2 可以看出，該菌可以使健康蘋果腐敗，且病斑直徑隨著接種時間延長不斷生長，根據(jù)科赫法則原理，可以確定分離出的菌株能夠使蘋果腐敗。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察

對純化后的菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察見圖3。

圖3 對純化后的菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察

從蘋果表面提取病料，接種至PDA 培養(yǎng)基，經(jīng)分離純化發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上長出單個菌落，菌落較大、疏松、干燥，呈絨毛狀，灰白色，可沿培養(yǎng)基表面蔓延生長（圖3（a））。挑取單菌落邊緣部分于載玻片上的無菌水中，在光學(xué)顯微鏡下（油鏡下，10×100 倍）觀察，可以看出有纖細(xì)管狀的疑似菌絲的結(jié)構(gòu)（圖3（b）），從形態(tài)觀察推測該菌株是真菌。

2.3.2 ITS 序列擴(kuò)增及電泳

基因組DNA 電泳的檢測結(jié)果見圖4。

從純化后的菌株中提取了7 管基因組DNA，編號為1～7，分別以7 管中的DNA 為模板，以真菌ITS 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，從圖4 中可以看出，1，2，4，5 這4 個管中序列DNA 條帶明顯，且DNA 序列大小在500 bp左右，這與真菌的ITS 序列片段長度一般在500～750 bp 相吻合，所以可以初步判斷該菌株為真菌。

圖4 基因組DNA 電泳的檢測結(jié)果

2.3.3 真菌ITS 序列測定與分析

將提取出來的DNA 產(chǎn)物進(jìn)行基因序列的測定，得到真菌的基因ITS 序列。

真菌ITS 測定序列見圖5。

圖5 真菌ITS 測定序列

將測得的序列通過BLAST 軟件進(jìn)行比對[12-17]，比對結(jié)果顯示，菌株（命名為XXGC-1）與色二孢屬基因序列的同源性高達(dá)99.34%，將測得的序列通過BLAST 軟件與已知微生物比對構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，在系統(tǒng)發(fā)育樹中XXGC-1 與色二孢屬Diplodia seriata CBS 112555（NR 111151.1）等菌能聚在一起（圖6），表明菌株是色二孢屬中一種。

基于ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖6。

圖6 基于ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

對腐爛蘋果上腐敗菌分離、鑒定。通過平板分離純化、蘋果菌落特征觀察、光學(xué)顯微鏡觀察、ITS序列測定，及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果表明該菌種與色二孢屬（Diplodia seriata）有99.34%的相似率，且與色二孢屬Diplodia seriata CBS 112555（NR 111151.1）親緣關(guān)系最近。通過侵染試驗(yàn)表明，該菌種具有致腐能力。致腐試驗(yàn)結(jié)果與原腐敗現(xiàn)象基本一致、癥狀表現(xiàn)基本相同。

目前，從腐敗蘋果中分離并鑒定出的微生物主要有細(xì)菌和真菌，細(xì)菌有歐文氏菌（Erwinia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、棒桿菌屬（Corynebacteriurn）、芽孢桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬等，真菌有青霉菌屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、枝孢屬（Cladosporium）等，色二孢屬在果蔬種植過程中較常見，如它能夠引起葡萄藤頂端枯萎、藤蔓變白、芽體壞死及嫁接失敗等癥狀。而對于色二孢屬對蘋果果實(shí)的致腐問題鮮有研究。

一般腐敗霉菌侵入果蔬組織先附著在果蔬表面，孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管能夠識別合適的滲透位置，然后形成附著胞和侵染墊等侵染結(jié)構(gòu)，在侵染結(jié)構(gòu)形成期間，逐漸代謝產(chǎn)生纖維素酶和果膠酶等細(xì)胞壁降解酶，腐敗霉菌的主要致病因子是細(xì)胞壁降解酶和毒素，有的腐敗菌也會增加蘋果中促使果蔬發(fā)生褐變的關(guān)鍵酶的活性，如PPO 和POD 等，從而加速果實(shí)的褐變反應(yīng)；有的腐敗菌能夠改變果蔬的風(fēng)味物質(zhì)，加快風(fēng)味物質(zhì)的代謝和揮發(fā)，改變與軟化相關(guān)的關(guān)鍵酶的活性，如PG、PME、CX 酶等[3]。所以，推測試驗(yàn)分離的腐敗菌可能有以上致病機(jī)理。試驗(yàn)存在一些不足之處，只對蘋果上的腐敗菌進(jìn)行分離鑒定，且只分離鑒定出一種菌，未能分離出多種菌株，也無法解釋該菌的致病機(jī)理，在此試驗(yàn)的基礎(chǔ)上可以從以下幾個方面進(jìn)行深入研究：

（1）該菌種導(dǎo)致蘋果腐敗機(jī)理尚不清楚，還需要進(jìn)一步檢測相關(guān)指標(biāo)，如壞果率、抗壞血酸含量、丙二醛含量、過氧化氫酶活性等，同時也可進(jìn)一步檢測相關(guān)抗性基因表達(dá)情況，從而進(jìn)一步探尋該菌對蘋果果實(shí)的致腐機(jī)理及蘋果果實(shí)的應(yīng)答機(jī)制。

（2）尋找能夠抑制蘋果中的色二孢屬（Diplodia seriata）的方法，并通過感官評價和相關(guān)指標(biāo)的測定證明該方法安全有效。

（3）在腐爛的蘋果上再分離純化多個菌種，并探尋它們的致病制腐機(jī)理，也可從其他腐爛水果上分離鑒定菌種，并探尋其致病或致腐機(jī)理。

（4）探尋蘋果保鮮方法，找到抑制有害微生物生長繁殖的安全可行的方法。但是，由于其中的微生物種類多，影響因素繁多，環(huán)境條件也變化多端，存在許多不定的因素，且不同微生物之間也會相互影響。因此，探尋最佳蘋果保鮮效果是需要大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的，還需進(jìn)一步深入研究。