陳明雨 倪烜 司友斌 孫凱

（農(nóng)田生態(tài)保育與污染防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，合肥 230036）

漆酶是一類胞外含銅多酚氧化還原酶（EC 1.10.3.2），普遍分布在高等植物、昆蟲和微生物體內(nèi)，首次被日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)于日本紫膠漆樹的汁液中［1］。分泌漆酶的真菌來源較為廣泛，主要包括擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）和半知菌類（Deuteromycota），其中最重要的是擔(dān)子菌門中的白腐真菌［2］。漆酶在生物體內(nèi)的主要作用包括色素形成、木質(zhì)素合成、角質(zhì)層硬化和污染物解毒等［3-4］。 鑒于真菌漆酶具有良好的催化機(jī)能和底物廣譜性，其已被用于去除生態(tài)環(huán)境中的多種難降解有機(jī)污染物。例如，Ulu等［5］利用改性Fe3O4磁性顆粒固定漆酶，該固定化漆酶對活性藍(lán)171和酸性藍(lán)74染料具有顯著地脫色和降解效果。另有研究指出，漆酶和2，2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）［2，2’-azinobis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate），ABTS］介質(zhì)在3 h內(nèi)可以完全降解非甾體抗炎藥雙氯芬酸（diclofenac，DCF），且反應(yīng)7 d后DCF的羥基化產(chǎn)物也被徹底消除［6］。

漆酶的催化中心含有4個銅離子，它們共同調(diào)控漆酶對不同底物分子的氧化反應(yīng)［3］。該過程以水體中溶解氧作為最終電子受體，催化有機(jī)污染物的單電子氧化形成活性自由基或醌類中間體，隨后這些活性中間體自發(fā)地發(fā)生耦合或鍵斷裂反應(yīng)。漆酶介導(dǎo)有機(jī)污染物的轉(zhuǎn)化具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、底物廣譜、操作可控和經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，其能夠作為一種環(huán)境友好型“綠色催化劑”［2］。目前，酶固定化技術(shù)的快速發(fā)展為漆酶在環(huán)境有機(jī)污染物去除中的大規(guī)模應(yīng)用提供了廣闊空間［7］。與游離態(tài)漆酶相比，固定化漆酶增強(qiáng)了酶的穩(wěn)定性和催化效能，并提高了酶的重復(fù)利用率［8-9］。本文概述了真菌漆酶的結(jié)構(gòu)特征、底物譜和催化機(jī)能，比較了漆酶的常規(guī)固定化技術(shù)及其利弊，系統(tǒng)地總結(jié)了固定化漆酶介導(dǎo)雌激素、抗生素、多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）、個人護(hù)理產(chǎn)品、合成染料，以及磺胺類藥物轉(zhuǎn)化的自由基耦合和氧化分解機(jī)制，該綜述有望為固定化漆酶在生物修復(fù)領(lǐng)域中的大規(guī)模應(yīng)用奠定科學(xué)的理論基礎(chǔ)和提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 真菌漆酶

1.1 真菌漆酶的分子結(jié)構(gòu)和催化特性

普遍認(rèn)為，真菌漆酶是一種酸性等電點(diǎn)單體糖蛋白，由500-550個氨基酸組成，分子量變化范圍在50-70 kD；同時伴有不同程度的糖基化，糖基化含量約為10%-25%［10］。銅離子是構(gòu)成漆酶催化活性中心的關(guān)鍵位點(diǎn)，在酶促反應(yīng)中起著電子轉(zhuǎn)移的作用［11］。根據(jù)漆酶的分子結(jié)構(gòu)特征，其催化活性中心含有3種類型的Cu2+結(jié)合位點(diǎn)，即T1-Cu（Ⅰ Cu2+）、T2-Cu（Ⅱ Cu2+）和T3-Cu（Ⅲ Cu2+）。在漆酶銅簇位點(diǎn)的四面體幾何結(jié)構(gòu)中，T1-Cu和T2-Cu各1個，T3-Cu有2個［12］。T1-Cu位 點(diǎn) 的Cu2+是順磁性“藍(lán)色”銅，在610 nm有特征吸收峰，該位點(diǎn)是漆酶催化底物氧化的重要活動窗口，其可以從底物分子中獲取電子并通過組氨酸-半胱氨酸-組氨酸（His-Cys-His）三肽序列傳遞給水中的溶解 氧［1，13］。T2-Cu位點(diǎn)的Cu2+是順磁性“非藍(lán)色”銅，該位點(diǎn)不穩(wěn)定，在可見光區(qū)的吸收峰較弱。T3-Cu位點(diǎn)的2個Cu2+是反磁性雙電子受體，構(gòu)成一個雙核銅簇中心［2］。T2-Cu和T3-Cu共同組成真菌漆酶的三核銅簇位點(diǎn)，該催化核心能夠接收T1-Cu位點(diǎn)傳遞的電子并將水中溶解的分子氧還原為水［14］。

1.2 漆酶催化底物的廣譜性和作用機(jī)制

真菌漆酶作為一種含銅多酚氧化還原酶，其催化底物十分廣泛，包括木質(zhì)素、酚類化合物和非酚類化合物等。例如，Chen等［15］研究了漆酶和磁性納米粒子的協(xié)同作用對木質(zhì)素模式化合物2-苯氧基-1-苯乙醇的生物降解作用。結(jié)果表明，其降解產(chǎn)物主要包括2-苯基氧基烷、2-苯基苯酚、2，3-二苯基氧基烷和4-苯基苯酚等。孫凱等［3］總結(jié)了漆酶催化氧化真菌體內(nèi)外源或內(nèi)源小分子酚類化合物及其衍生物的自由基耦合反應(yīng)，該過程可以生成具有特殊功能的同源或異源生物大分子聚合物。真菌漆酶的氧化還原電位越高，可催化的底物范圍越廣［11］。添加小分子氧化還原介質(zhì)能夠進(jìn)一步擴(kuò)大漆酶催化的底物譜，常用的介質(zhì)有1-羥基苯并三唑（1-hydroxybenzotriazole，HBT）、ABTS、紫脲酸、三苯胺和丁香醛等，這些介質(zhì)在氧化還原反應(yīng)中起到電子穿梭體的作用［16］。

如圖1所示，真菌漆酶的催化氧化作用機(jī)制主要表現(xiàn)在底物自由基中間體的產(chǎn)生和分子氧還原成水兩個方面。T1-Cu位點(diǎn)的Cu2+與兩個組氨酸（His）的N和一個半胱氨酸（Cys）的S配位形成扭曲的四面體結(jié)構(gòu)［1］。漆酶在共價(jià)鍵Cu-S（Cys）的配位附近接受來自底物轉(zhuǎn)移的單電子，該底物被氧化成活性自由基中間體，同時T1-Cu位點(diǎn)的Cu2+轉(zhuǎn)變成Cu+；隨后這些自由基中間體在酶促位點(diǎn)外發(fā)生氧化耦合或目標(biāo)底物的鍵斷裂反應(yīng)，最終將底物轉(zhuǎn)化為大分子聚合產(chǎn)物或小分子分解產(chǎn)物［2］。T2-Cu位點(diǎn)的Cu2+與T3-Cu位點(diǎn)的Cu2+緊密相連形成的三核銅簇是真菌漆酶的催化活性中心，該銅簇位點(diǎn)利用T1-Cu位點(diǎn)傳遞來的電子將氧氣還原成水。在真菌漆酶催化的氧化反應(yīng)中，底物被氧化形成活性中間體，4個電子和4個H+通過His-Cys-His途徑傳遞到三核銅簇中心，并將1個氧分子還原成2個水分子［13］。由此可見，真菌漆酶催化底物的氧化過程中僅生成唯一副產(chǎn)物水，具有高效、綠色、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。

圖1 真菌漆酶催化底物的分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移機(jī)制Fig. 1 Intramolecular electron transfer mechanism of substrate catalyzed by fungal laccase

2 真菌漆酶的固定化

2.1 漆酶固定化材料

與游離態(tài)漆酶相比，固定化技術(shù)顯著提高了漆酶的催化活性、熱穩(wěn)定性、存儲周期和循環(huán)利用次數(shù)［17］。載體的選擇是漆酶能否實(shí)現(xiàn)有效固定化及效果優(yōu)劣的關(guān)鍵［1］。目前，常用的經(jīng)濟(jì)型固定化載體材料主要包括無機(jī)載體材料、高分子載體材料和復(fù)合載體材料［18］。無機(jī)載體材料如納米材料、磁性材料、介孔材料和碳基材料等，均具有良好的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性［19］；其中納米材料比表面積較大，具有更強(qiáng)的化學(xué)、機(jī)械、熱學(xué)和成本效益等特性，已經(jīng)成為固定化漆酶的理想載體［20］。與非磁性納米載體相比，磁性納米載體表面含有較豐富的羥基官能團(tuán)，使其更容易與漆酶的蛋白質(zhì)位點(diǎn)結(jié)合［5］。例如，Muthuvelu等［21］將漆酶固定在銅鐵氧體磁性納米粒子（CuFeMNPs）表面，固定化CuFeMNPs的活性比游離態(tài)漆酶提高了18%，其在較寬的溫度和pH范圍內(nèi)仍具有良好的動力學(xué)電位和穩(wěn)定性，且重復(fù)使用6次后依然保持70%以上的催化活性。該類載體材料的最大優(yōu)點(diǎn)在于可以通過磁力吸引達(dá)到迅速分離固定化漆酶的效果。單一的磁性顆粒一般不直接用于漆酶的固定化，通常將其與有機(jī)或無機(jī)載體結(jié)合形成磁性復(fù)合載體來提升漆酶的固定化效率［22］。

高分子載體材料主要分為天然高分子材料和人工合成高分子材料。天然高分子材料主要有甲殼中提取的殼聚糖和海藻中提取的海藻酸，其中殼聚糖是一種具有生物相容性的優(yōu)良材料［23］。人工合成高分子材料包括聚丙烯酰胺和樹脂等。目前，研究人員為增強(qiáng)漆酶與載體之間的穩(wěn)定結(jié)合，通常采用有目的、有方向的化學(xué)修飾法，在天然高分子材料的基礎(chǔ)上人工改良形成新的高分子材料。例如，Dwamena等［24］利用陰離子表面活性劑凝膠對殼聚糖進(jìn)行表面修飾，制備多孔殼聚糖水凝膠膠囊。與具有熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性的傳統(tǒng)殼聚糖水凝膠相比，修飾后的多孔殼聚糖水凝膠膠囊具有良好的漆酶加載效率，并且在極端溫度下仍保持良好的穩(wěn)定性。復(fù)合載體材料可以是無機(jī)-無機(jī)、有機(jī)-無機(jī)和高分子-高分子材料，這種材料能夠?qū)煞N材料的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合在一起，提高固定化漆酶的加載效率和使用性能。例如，Girelli等［19］將二氧化硅的穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度與殼聚糖的生物相容性和凝膠特性相結(jié)合，利用制備的二氧化硅-殼聚糖復(fù)合載體包埋、固定漆酶；結(jié)果表明，在較寬的pH（6-8）和溫度（40-60℃）范圍內(nèi)漆酶表現(xiàn)出較高的活性和穩(wěn)定性，其可重復(fù)循環(huán)利用15次。另有研究將海藻酸鈉組成的核殼體系與磁性材料相結(jié)合，作為多功能復(fù)合載體用于固定漆酶；該封裝法形成的微球能實(shí)現(xiàn)85.5%的漆酶固定化率，且在該固定化方法下漆酶的催化結(jié)構(gòu)能在水、乙酸緩沖液和實(shí)際廢水中維持穩(wěn)定，同時也可實(shí)現(xiàn)固定化漆酶的磁力回收、提高漆酶催化活性和效率［25］。

2.2 漆酶固定化方法及其優(yōu)缺點(diǎn)

2.2.1 吸附法 吸附法主要包括物理吸附法和離子吸附法。物理吸附法是指通過氫鍵、疏水作用和范德華力等相互作用使漆酶分子吸附到不溶于水的載體表面，這是一種操作步驟簡潔且不需要額外添加化學(xué)試劑的漆酶固定化方法［26］。離子吸附法是一種利用漆酶和載體之間形成靜電作用力的固定化方法（圖2-A）。吸附法的特點(diǎn)之一是沒有選擇性，吸附質(zhì)并不固定在吸附劑表面的特定位置，其優(yōu)點(diǎn)在于固定化技術(shù)簡單，可供選擇的載體較多，酶蛋白的活性中心不易受破壞，酶的高級結(jié)構(gòu)變化不明顯。例如，Ko?odziejczak-Radzimska等［27］采用吸附法將漆酶固定在介孔Al2O3表面，用獲得的固定化生物催化劑對酵母出水中的黑色素進(jìn)行脫色，整個過程操作簡單，漆酶的流動性較好。盡管如此，吸附法也存在一定的缺陷和弊端，如漆酶和載體之間的結(jié)合能力通常較弱，漆酶無法高效固定在載體表面且容易浸出，導(dǎo)致固定化漆酶的重復(fù)利用率較低［28］。

2.2.2 包埋法 包埋法是一種將漆酶固定在高聚物的細(xì)微凝膠網(wǎng)格或高分子半透膜中的方法，該方法能有效防止酶分子的滲出（圖2-B）。當(dāng)酶分子或酶制劑被限制在某種載體中時，底物則需要滲入載體內(nèi)與酶接觸。根據(jù)載體材料和包埋方法的不同，可以將包埋法分為凝膠包埋法和半透膜包埋法。凝膠包埋法常用的載體有海藻酸鈉、明膠和瓊脂等天然凝膠，以及聚丙烯酰胺和聚乙烯醇等合成凝膠或樹脂。半透膜包埋法常用的載體材料有聚胺、火棉膠和醋酸纖維素等，該半透膜在阻止漆酶通過的同時允許酶的作用底物自由出入［18］。在使用包埋法固定漆酶的過程中，由于酶分子本身未發(fā)生物理化學(xué)變化，因此不會引起漆酶分子構(gòu)象的改變［9］。例如，Ratanapongleka等［29］采用包埋法將多色香菇（Lentinus polychrous）漆酶固定在海藻酸鋇中，用于去除對乙酰氨基酚（acetaminophen，AP）；與游離態(tài)漆酶的Km值（203.56 M）相比，固定化漆酶的Km值（98.86 M）較低，說明固定化可提高漆酶與AP的親和力，且顯著地增加了漆酶對pH和溫度的穩(wěn)定性，當(dāng)固定化漆酶重復(fù)使用5次后，AP去除率和酶活性仍保持在70%以上。然而，只有小分子物質(zhì)可以穿過載體與酶接觸，故包埋法只適用于漆酶催化小分子底物形成低分子量產(chǎn)物［30］。此外，作為載體的高聚物網(wǎng)格和半透膜對小分子物質(zhì)擴(kuò)散存在阻力，這有可能改變固定化漆酶的動力學(xué)行為并降低其催化活力。

2.2.3 交聯(lián)法 交聯(lián)法是一種利用雙功能或多功能試劑在酶分子之間、酶分子與惰性蛋白之間或酶分子與載體之間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)形成共價(jià)鍵的固定化方法（圖2-C）。常用的交聯(lián)試劑有戊二醛、己二胺、雙偶氮苯和異氰酸衍生物等。例如，曹文娟和袁海生［31］采用殼聚糖交聯(lián)法固定樺熠孔菌（Lenzites betulina）漆酶，研究固定化漆酶對染料的脫色和降解作用。結(jié)果表明，在殼聚糖2.5%、戊二醛7%、交聯(lián)時間2 h、固定化時間5 h、1 g殼聚糖小球和1 mL給酶量（1 U/mL）的最佳條件下，漆酶的固定化效率為56%；與游離態(tài)漆酶相比，固定化漆酶具有更寬的溫度范圍和更穩(wěn)定的pH，且重復(fù)使用8次后剩余酶活力仍高達(dá)64%。Rouhani等［32］利用戊二醛作為交聯(lián)試劑將漆酶固定到Fe3O4-石墨烯復(fù)合納米材料上，在接觸時間為4 h、戊二醛濃度為5%和漆酶濃度為5 mg/mL的反應(yīng)條件下，漆酶活性高達(dá)86%，固定化漆酶在貯藏20 d后仍保持88%的初始活性，而游離態(tài)漆酶在同等條件下的活性僅保持32%。此外，與游離態(tài)漆酶相比，固定化漆酶的可重用性得到明顯改善。然而，由于交聯(lián)法的反應(yīng)較為劇烈，所以單獨(dú)使用該方法固定漆酶的效果不佳。因此，交聯(lián)法多與其他固定化方法聯(lián)合使用。例如，與包埋法聯(lián)用可防止包埋的酶或細(xì)胞泄漏，與吸附法聯(lián)用可防止吸附的酶脫落。

2.2.4 共價(jià)結(jié)合法 漆酶的共價(jià)結(jié)合法是指酶蛋白的非必需基團(tuán)通過共價(jià)鍵和載體形成不可逆的連接，這種連接是一種化學(xué)反應(yīng)，即酶表面的活性氨基酸殘基與載體表面的活性官能團(tuán)之間的反應(yīng)（圖2-D）。共價(jià)鍵結(jié)合法普遍通過醚、硫醚、酰胺或氨基甲酸酯鍵形成共價(jià)鍵，參與結(jié)合的官能團(tuán)主要包含半胱氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的側(cè)鏈［9］。共價(jià)鍵在漆酶與載體之間提供了強(qiáng)大的連接，因此比其它可用的固定化方法更容易重復(fù)使用，即使是高濃度的底物溶液或鹽溶液都無法使酶從載體上脫落［28］。由此可見，采用共價(jià)結(jié)合法固定的漆酶穩(wěn)定性極強(qiáng)，酶的重復(fù)利用率也比較高；但該方法反應(yīng)劇烈，在固定化的過程中漆酶直接參與了化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致酶蛋白空間結(jié)構(gòu)改變，從而降低了漆酶的催化活性［30］。

圖2 四種常規(guī)的真菌漆酶固定化方法Fig. 2 Four conventional methods of fungal laccase immobilization

2.3 固定化技術(shù)的條件優(yōu)化

2.3.1 反膠束固定化技術(shù) 反膠束一般是在水溶液中通過不溶于水的溶劑和表面活性劑相互作用形成［33］。將漆酶置于反膠束體系中來達(dá)到固定化的作用，可以減少外界因素對漆酶活性的影響，更好地發(fā)揮漆酶的催化作用，提高漆酶利用率。例如，Xu等［34］采用異辛烷模擬含油污泥含油量制備了反膠束，通過對各種因素的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，反膠束固定化漆酶降解PAHs的最佳條件為反應(yīng)時間24 h、pH 4.2、溫度30℃；該條件下，漆酶反膠束體系對菲、蒽和苯并［β］熒蒽等PAHs的降解率分別達(dá)到50.3%、68.2%和68.9%。

2.3.2 酶 膜 反 應(yīng) 器（enzyme membrane reactors，EMRs）固定化技術(shù) 采用膜作為支撐材料的漆酶固定化方法是一種很有前途的技術(shù)，因?yàn)樵摷夹g(shù)可以在溫和的條件下快速進(jìn)行，且將酶促反應(yīng)的高效率與膜的選擇透過性有機(jī)結(jié)合，使酶活性維持在較高水平［35］。膜生物反應(yīng)器具有較長的固體停留時間和較高的生物加載量，酶分子可以通過共價(jià)鍵或各種非共價(jià)的相互作用固定在膜內(nèi)或膜上［36］。目前，漆酶主要通過共價(jià)鍵結(jié)合或吸附作用實(shí)現(xiàn)在EMRs上的固定化，以確保生物催化系統(tǒng)的穩(wěn)定結(jié)合和可重用性［9］。例如，通過聚醚砜膜共價(jià)固定嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermophila）漆酶的EMRs技術(shù)，能夠連續(xù)去除廢水中的多種雌激素類化合物，其對雌酮（E1）、17β-雌二醇（17β-E2）和17α-雌二醇（17α-E2）的去除率均達(dá)到80%以上［37］。由此可見，EMRs具有較好的熱穩(wěn)定性和機(jī)械操作穩(wěn)定性，可以有效運(yùn)行100 h，易于連續(xù)化、自控與集成化，證實(shí)了其作為酶反應(yīng)器系統(tǒng)的高生產(chǎn)率和實(shí)際應(yīng)用 潛力［38］。

3 固定化真菌漆酶在有機(jī)污染物去除中的 應(yīng)用

真菌漆酶能夠以分子氧作為電子受體，催化酚類和非酚類底物氧化形成活性自由基或醌類中間體［2］。這些活性中間體不僅可以通過C-C、C-O-C或C-N-C等共價(jià)耦合途徑形成大分子聚合物，也能夠通過自由基相互攻擊生成小分子分解產(chǎn)物，聚合或分解產(chǎn)物的形成有效降低了環(huán)境中有機(jī)污染物的生態(tài)毒性［13］。大量的報(bào)道指出，漆酶在催化雌激素、抗生素、PAHs、個人護(hù)理產(chǎn)品和磺胺類藥物等有機(jī)污染物自由基耦合和氧化分解反應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用，以真菌漆酶為基礎(chǔ)的環(huán)境生物修復(fù)技術(shù)已經(jīng)受到越來越多研究者的關(guān)注［39-40］。固定化真菌漆酶在環(huán)境有機(jī)污染物去除中的應(yīng)用，見表1。

表1 固定化真菌漆酶在環(huán)境有機(jī)污染物去除中的應(yīng)用Table 1 Applications of immobilized fungal laccase in the removal of environmental organic contaminants

3.1 雌激素

雌激素是一類廣泛存在于水體中的微污染物，即使在低濃度條件下也能夠干擾生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)，長期接觸會對人類和水生生物的健康造成嚴(yán)重危害［52］。目前，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將雌激素列為第一類致癌物［53］。環(huán)境中的雌激素如雙酚A（BPA）、17β-E2和17α-乙炔基雌二醇（17α-EE2）主要來源于工業(yè)生產(chǎn)、畜牧養(yǎng)殖和農(nóng)業(yè)活動。其中，BPA是一種重要的有機(jī)化工原料，主要用于制造聚碳酸酯和環(huán)氧樹脂塑料，普遍存在于塑料食品容器、廚房用具、醫(yī)療設(shè)備、嬰兒用品以及罐頭和瓶蓋的內(nèi)部涂層中［17，54］。BPA在化學(xué)工業(yè)中的應(yīng)用超過50年，在地表水、地下水，甚至人類尿液和血液中均檢測到BPA［55］。在所有類固醇雌激素中，17β-E2是最危險(xiǎn)的，因?yàn)樗哂袠O強(qiáng)的致癌性、穩(wěn)定性和高雌激素活性，并能在水生生物和人體內(nèi)富集［56］。人工合成的17α-EE2可以作為避孕藥片，通常女性每日只代謝體內(nèi)17α-EE2總劑量的20%-48%，剩余的被排出進(jìn)入廢水循環(huán)［52］。近年來，研究者已經(jīng)在世界范圍內(nèi)的各種水源中普遍檢測到天然或合成雌激素［57］。目前，在我國江河等地表水甚至地下水中也頻繁檢測出BPA、17β-E2和17α-EE2等雌激素，暴露在環(huán)境中的雌激素對人群健康造成諸多負(fù)面 影響［52］。

雌激素中酚類結(jié)構(gòu)的存在使它們成為真菌漆酶催化反應(yīng)的活性底物，形成的不溶性低聚物很容易從水中沉淀或過濾出來［13］。以BPA為例，漆酶不僅能夠催化BPA單體的C-C或C-O-C耦合形成二聚體、三聚體、四聚體和多聚體產(chǎn)物，也可以誘導(dǎo)BPA的氧化分解生成4-異丙基苯酚和2-（4-羥基苯基）-2-丙醇，最終礦化為CO2和H2O（圖3）。Ashkan等［58］通過將氨基乙醇引入到甲基丙烯酸縮水甘油酯和多孔聚乙烯膜嫁接形成的聚合物上，制備了具有BPA生物降解能力的漆酶多層固定化膜，團(tuán)隊(duì)主要研究了3種介質(zhì)對BPA氧化降解的影響。結(jié)果表明，添加ABTS能夠使低濃度的BPA轉(zhuǎn)化率提升至100%。Tatiane等［59］將漆酶固定在單氨乙基-N-氨乙基（MANAE）-瓊脂糖形成的復(fù)合載體上，該固定化方法顯著地提高了漆酶的熱穩(wěn)定性及其對BPA的降解效率。在重復(fù)使用15次后，固定化漆酶對BPA的降解能力仍保持在90%以上。因此，將漆酶固定在MANAE-瓊脂糖上，可用于大規(guī)模高效連續(xù)降解水體中BPA。另有研究者采用共沉淀法，合成氨基功能化磁性納米粒子并對其進(jìn)行改性，利用磁性交聯(lián)酶聚合體將漆酶固定在納米顆粒上。結(jié)果表明，該固定化漆酶對初始濃度為60 mg/L的BPA去除率最大可達(dá)87.3%［43］。

圖3 真菌漆酶催化BPA聚合和分解的雙功能機(jī)制Fig. 3 Dual-functional mechanisms of BPA polymerization and decomposition catalyzed by fungal laccase

3.2 抗生素

抗生素是一種治療和消除病原菌感染的化學(xué)物質(zhì)，被廣泛用于醫(yī)療和畜牧業(yè)中，能夠降低人類和動物感染性疾病死亡率。然而，該類化合物無法被人體和動物完全吸收，大部分經(jīng)糞尿排出體外，流入土壤和水體環(huán)境，對野生生物造成負(fù)面影響，導(dǎo)致生態(tài)失衡［60］。目前，由于抗生素的過度濫用，研究人員已經(jīng)在飲用水中檢測到抗生素殘留，這將對人類健康構(gòu)成直接威脅［61］。根據(jù)歐盟規(guī)定［62］，環(huán)境中抗生素濃度不應(yīng)超過10 μg/L，而四環(huán)素類抗生素在環(huán)境中的殘留濃度高達(dá)450 μg/L-900 μg/L。環(huán)境中的抗生素會對耐藥細(xì)菌造成選擇性壓力，并可導(dǎo)致抗性基因在環(huán)境中遷移，從而對公眾健康造成嚴(yán)重危害［63］。例如，四環(huán)素類抗生素如四環(huán)素（TC）和土霉素（OTC）就是一種廣泛存在于廢水和天然水體中的廣譜抗菌劑［64］。

漆酶能夠高效降解環(huán)境中抗生素。Shao等［65］利用氨基功能化的中空介孔碳球固定漆酶，研究表明其對鹽酸四環(huán)素和鹽酸環(huán)丙沙星的降解率均高達(dá)99%以上。圖4列舉了固定化漆酶-HBT混合反應(yīng)體系中TC的降解機(jī)理，HBT可以通過氫原子轉(zhuǎn)移機(jī)制促進(jìn)漆酶催化TC的氧化、脫氫和脫甲基［44］。目前，丁香醛、丁香醇、ABTS和HBT作為幾種常見的氧化還原介質(zhì)，已經(jīng)被廣泛用于提高漆酶對抗生素的降解效率。例如，Sun等［66］探討了漆酶-HBT體系對腐殖酸溶液中TC轉(zhuǎn)化的影響；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，漆酶-HBT體系顯著提高了TC的降解效率，且TC可能通過與腐殖酸形成交叉耦合產(chǎn)物來降低其生物毒性。湯星陽等［67］指出復(fù)合介質(zhì)的效果要優(yōu)于單一介質(zhì)，添加雙天然介質(zhì)丁香醛和香草醛，在0.1 U/mL漆酶、50℃、120 r/min和pH 4.0的最優(yōu)反應(yīng)條件下，漆酶對土霉素的降解率達(dá)到95.14%。

圖4 真菌漆酶誘導(dǎo)四環(huán)素轉(zhuǎn)化的氧化機(jī)制Fig. 4 Oxidation mechanism of tetracycline induced by fungal laccase

3.3 多環(huán)芳烴

PAHs是土壤和水生環(huán)境中廣泛存在的一類持久性有機(jī)污染物，主要來源于化石燃料燃燒和石油產(chǎn)品外泄。PAHs能夠被多種環(huán)境介質(zhì)吸收，汽車尾氣和家用采暖是戶外PAHs的主要來源。此外，食品也可能因?yàn)榄h(huán)境來源、工業(yè)加工和某些家庭食品配制，而受到PAHs污染［68］。一些含有4個或更多苯環(huán)的PAHs如苯并［a］蒽和苯并［a］芘，可與DNA反應(yīng)形成共價(jià)加合物，引起DNA氧化損傷，從而對生物體產(chǎn)生誘變和致癌作用［69］。PAHs具有穩(wěn)定性高且不易被降解的特點(diǎn)，能夠通過食物鏈傳遞作用迅速被人體吸收并廣泛分布在機(jī)體中，進(jìn)入淋巴的PAHs通過血液循環(huán)，在機(jī)體的肝臟中進(jìn)行代謝，進(jìn)而對人體健康產(chǎn)生不利影響［34］。由于能源消耗的快速增長以及交通和航運(yùn)的發(fā)展，許多國家的PAHs排放量不斷增加。因此，PAHs已成為各國環(huán)境污染問題關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，已有16種PAHs被美國環(huán)境保護(hù)局列為優(yōu)先控制污染物。

漆酶誘導(dǎo)的自由基氧化過程在PAHs代謝中發(fā)揮巨大作用。漆酶對16種優(yōu)先控制的PAHs氧化能力差異主要取決于PAHs的電離能，由于真菌漆酶的氧化還原電勢比較低，因此對同樣電離能較低的蒽和苯并[α]芘的氧化作用最為突出［70］。Pozdnyakova等［71］研究發(fā)現(xiàn)，在漆酶的作用下蒽和菲會降解成相應(yīng)的醌類代謝物，如蒽被漆酶氧化生成9，10-蒽醌，苯并[α]蒽易被氧化為苯并[α]蒽-7，12-二酮（圖5）。另有研究指出，漆酶能夠催化氧化苯并[α]芘，生成具有不同取代位置的醌類化合物［72］。Pozdnyakova等［73］通過考察不同介質(zhì)對PAHs降解的影響，發(fā)現(xiàn)ABTS是較好的蒽氧化介質(zhì)，HBT是較好的芴氧化介質(zhì)，此外，芘和蒽混合物的降解速率要高于單一體系。Chang等［74］通過解釋表面活性劑與黏土和酶的結(jié)構(gòu)以及分子相互作用，論證了漆酶物理吸附在非離子表面活性劑改性黏土中對PAHs降解的重要意義。Elhusseiny等［75］采用分光光度法測定了漆酶對萘和蒽的降解效率；結(jié)果顯示在作用后3 d內(nèi)，蒽的降解率為27.87%，而萘的降解率高達(dá)86.47%且在5 d內(nèi)完全降解，蒽在11 d后的降解率達(dá)到93.69%。萘在漆酶-介質(zhì)體系的降解過程中首先轉(zhuǎn)化為萘酚，萘酚再代謝為水楊酸和苯甲酸。

圖5 真菌漆酶-介質(zhì)體系氧化降解多環(huán)芳烴的作用機(jī)制Fig. 5 Degradation mechanisms of PAHs oxidized by fungal laccase-mediator

3.4 個人護(hù)理產(chǎn)品

三氯生（TCS）和三氯卡班（TCC）是一類常用作個人護(hù)理產(chǎn)品的高效抗菌化合物，廣泛存在于水、生物和土壤中。TCS穩(wěn)定性好、親脂性強(qiáng)，被認(rèn)為是潛在內(nèi)分泌干擾物，具有抗雄激素的作用［46，76］。 污水處理廠對TCS的去除效率不高，其生成的副產(chǎn)品如甲基三氯生、2，4-二氯酚和2，4，6-三氯酚對環(huán)境的危害性更大［77］。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中，用處理過的廢水灌溉農(nóng)田和用生物油改良土壤，往往都會造成TCS污染。例如，Nie等［78］利用14C標(biāo)記追蹤TCS在植物體內(nèi)的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在不同組織中的生物富集因子大小順序依次為根>莖>葉>果實(shí)。TCC化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具有疏水性，其在陸生和水生環(huán)境中的長期暴露給生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成巨大危害［79］。人體TCC暴露風(fēng)險(xiǎn)主要來自皮膚接觸含TCC的產(chǎn)品、食用含TCC污染的食品和水。在正常肝細(xì)胞中，TCC暴露可打破細(xì)胞氧化還原平衡，其表現(xiàn)為谷胱甘肽代謝的降低和活性氧的過量產(chǎn)生，從而導(dǎo)致DNA損傷和脂質(zhì)過氧化。自2017年9月起，美國食品和藥物管理局已禁止在非處方消費(fèi)者抗菌洗滌液中添加TCC［80］。

真菌漆酶可以催化氧化TCS和TCC的氧化耦合和分解反應(yīng)。Dou等［81］系統(tǒng)地探討了腐殖酸對漆酶介導(dǎo)TCS動力學(xué)、產(chǎn)物分布及作用機(jī)制的影響；結(jié)果表明，漆酶能夠高效去除TCS，添加腐殖酸減少了TCS自聚體的生成，但增強(qiáng)了腐殖酸-TCS交叉耦合物的形成。如圖6所示，TCS在漆酶催化的耦合反應(yīng)中的自聚合反應(yīng)分為兩步。首先，漆酶催化TCS單電子氧化，形成相應(yīng)的TCS反應(yīng)活性自由基中間體。隨后，這些活性中間體在酶促反應(yīng)位點(diǎn)外相互耦合形成TCS二聚體、三聚體和四聚體等低聚物。理論上可以在苯氧自由基中間體的鄰位或?qū)ξ簧仙啥喾NTCS同分異構(gòu)體的C-C和C-O-C低聚物［82］。在缺乏介質(zhì)的反應(yīng)體系中，漆酶催化TCS轉(zhuǎn)化的主要機(jī)制是通過自由基介導(dǎo)的耦合反應(yīng)形成低聚物；而在添加介質(zhì)（HBT）的反應(yīng)系統(tǒng)中，漆酶誘導(dǎo)TCS轉(zhuǎn)化的主要途徑則是通過醚鍵斷裂生成2，4-二氯苯酚和3-氯苯酚等小分子分解產(chǎn)物［83］。

圖6 真菌漆酶介導(dǎo)TCS轉(zhuǎn)化的自由基耦合和氧化分解機(jī)制Fig. 6 Radical coupling and oxidative degradation mechanisms of TCS transformation mediated by fungal laccase

3.5 合成染料

偶氮染料和蒽醌染料作為最常用的合成著色劑，廣泛存在于紡織品、彩紙、食品、人造纖維和皮革等產(chǎn)品中［84］。在工業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的有機(jī)偶氮染料不僅會造成嚴(yán)重的水污染，還會在野生生物體中產(chǎn)生潛在的致癌、致畸、致突變風(fēng)險(xiǎn)［85-86］。當(dāng)含有染料的紡織廢水被排放到水生環(huán)境時，增加了水的顏色，影響陽光在水中的透過，從而降低光合活性、減少水中溶解氧濃度。一系列物理或化學(xué)方法包括吸附、膜過濾、電化學(xué)技術(shù)和高級氧化工藝等已經(jīng)被用來去除合成染料，但是它們大多存在運(yùn)行和投資成本高、產(chǎn)生二次污染等缺點(diǎn)［87］。因此，研究人員將關(guān)注點(diǎn)更多地放在具有催化效率高、耗能少和環(huán)保等特性的生物酶上［88］。

漆酶可以利用高度非特異性的自由基來消除蒽醌和偶氮染料中發(fā)色基團(tuán)的分子結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到染料脫色和降解的目的（圖7）。該方法已經(jīng)被應(yīng)用于處理染料廢水。Legerskáe等［89］研究真菌漆酶對兩種單偶氮染料橙2和酸性橙6的脫色效果。結(jié)果表明，在處理120 h后前者的脫色率為72.8%，后者的脫色率為43.5%，可見漆酶對萘酚型偶氮染料的脫色率高于非萘酚型偶氮染料。Othman等［90］將漆酶固定在添加多壁碳納米的硝酸纖維素上用于活性黑5（RB5）脫色，反應(yīng)6 h和24 h后RB5脫色效果分別達(dá)到68.09%和84.26%。Abbasi［87］將漆酶固定在碳納米管上用于提高其吸附性能，在pH 6.8和pH 2.0時固定化漆酶對直接藍(lán)71（DB71）染料和反應(yīng)藍(lán)19（RB19）染料的吸附量分別達(dá)到最大值61.35和97.08 mg/g；其中DB71去除率為80%-86%（pH 2-10），DB71去除率最高可達(dá)89%（pH 7）。根據(jù)粒子擴(kuò)散動力學(xué)，染料在漆酶-碳納米管表面或內(nèi)部的擴(kuò)散速率相對較高，這種仿生納米復(fù)合材料在廢水處理中具有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖7 真菌漆酶催化蒽醌和偶氮染料脫色的作用機(jī)制Fig. 7 Decolorization and degradation mechanisms of anthraquinone and azo dyes initiated by fungal laccase

3.6 磺胺類藥物

磺胺類藥物是一類在結(jié)構(gòu)上具有對氨基苯磺酰胺的化合物的總稱，屬于人工合成抗菌藥，具有抗癌、抗真菌、消炎鎮(zhèn)痛等多種功效。在畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，磺胺類藥物通常作為飼料添加劑用于促進(jìn)動物生長?；前奉愃幬镌谏矬w內(nèi)代謝周期長，極易在水產(chǎn)品中殘留，從而導(dǎo)致水產(chǎn)品藥物殘留超標(biāo)。近年來，研究者已經(jīng)在河流、湖泊、海洋等水體中頻繁檢出磺胺類藥物，其殘留質(zhì)量濃度在ng/L-μg/L級別［91］。為了確保消費(fèi)者購買的食品安全，中國及歐盟等［92］都提出了食品中允許添加的磺胺類藥物最大殘留限量不應(yīng)超過100 μg/kg。

磺胺類藥物的氧化還原電位較高，難以直接被真菌漆酶氧化降解，但是添加氧化還原介質(zhì)可以有效地促進(jìn)漆酶去除磺胺類藥物。如圖8所示，丁香酸介質(zhì)可被漆酶氧化為2，6-二甲氧基苯并醌（2，6-DMBQ）中間體，隨后該中間體和磺胺類藥物形成交叉耦合產(chǎn)物［51］。丁香酸、丁香醛和丙酮等介質(zhì)對漆酶的親和力各不相同，因此導(dǎo)致漆酶對磺胺類藥物的催化效率差異顯著。丁惠君等［93］研究了兩種介質(zhì)（丁香醇和HBT）對漆酶降解磺胺類抗生素的影響。結(jié)果表明，加入丁香醇介質(zhì)處理組的磺胺類抗生素降解率達(dá)到70%-90%，比不加介質(zhì)的漆酶組高出60%-70%，而加入HBT介質(zhì)處理組的磺胺類抗生素降解率僅為16%-45%。主要原因可能是因?yàn)閮煞N介質(zhì)分別產(chǎn)生高活性的酚氧自由基和氮氧自由基，對漆酶降解黃胺類抗生素起到不同的促進(jìn)作用。另有研究指出，漆酶-ABTS體系在6 h內(nèi)能夠徹底降解磺胺甲惡唑（sulfamethoxazole，SMX），該復(fù)合體系對SMX和磺胺嘧啶（sulfadiazine，SDZ）混合物中相應(yīng)污染物的降解率也分別達(dá)到82%和85%［94］。

圖8 真菌漆酶催化磺胺類藥物的轉(zhuǎn)化機(jī)制Fig. 8 Transformation mechanisms of sulfa drugs catalyzed by fungal laccase

4 結(jié)語

與傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法相比，固定化真菌漆酶具有反應(yīng)條件溫和、催化活性高和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，有望大規(guī)模應(yīng)用于環(huán)境有機(jī)污染物修復(fù)。然而，如何提高漆酶的催化活性和重復(fù)利用率，降低漆酶在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用成本，已經(jīng)成為研究者亟待解決的關(guān)鍵問題。固定化技術(shù)可以提高漆酶的穩(wěn)定性和使用效率，本文比較了吸附、包埋、共價(jià)結(jié)合和交聯(lián)等4種常規(guī)酶固定化方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并提出反膠束和酶膜兩種優(yōu)化的固定化技術(shù)，舉例說明無機(jī)載體、高分子載體和復(fù)合載體在固定漆酶中的應(yīng)用，重點(diǎn)總結(jié)了固定化漆酶介導(dǎo)雌激素、抗生素、多環(huán)芳烴、個人護(hù)理產(chǎn)品、合成染料和磺胺類藥物的自由基耦合和氧化分解機(jī)理。綜合以上有關(guān)固定化真菌漆酶在有機(jī)污染物降解和轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，整理出國內(nèi)外相關(guān)研究人員的最新研究進(jìn)展。在未來的研究過程中，研究者仍需從以下幾個方面不斷開展創(chuàng)新型研究，充分發(fā)揮真菌漆酶在環(huán)境修復(fù)中的潛在應(yīng)用價(jià)值：（1）探索更加優(yōu)良的固定化載體材料，降低制備成本、增強(qiáng)漆酶穩(wěn)定性；（2）有針對性地研究出能夠穩(wěn)定應(yīng)用的綜合固定化技術(shù)，提高漆酶催化效率和重復(fù)利用率；（3）充分發(fā)揮真菌漆酶在環(huán)境有機(jī)污染修復(fù)領(lǐng)域的優(yōu)良特性，與生物化學(xué)修復(fù)技術(shù)相結(jié)合，擴(kuò)大漆酶在綠色環(huán)境發(fā)展中的作用。