章英才 黃月 海源 張媛 扈亞杰 趙夢怡

（寧夏大學生命科學學院，銀川 750021）

棗（Ziziphus jujuba Mill）為鼠李科（Rhamnaceae）、棗屬（Ziziphus Mill）落葉喬木，其果實的藥用和營養(yǎng)價值都很高，是典型的具有藥食兼用的果品之一［1］。近年來，在棗屬植物果實解剖結(jié)構(gòu)特性［2］、棗果實維管束解剖結(jié)構(gòu)［3］等方面取得了一定的研究結(jié)果，反應(yīng)了不同棗屬植物的果實結(jié)構(gòu)存在著異同［4-8］。光合同化物進入果實貯藏積累和運輸經(jīng)歷了較復雜的過程，其中同化物韌皮部卸載過程是決定從“源”到“庫”果實轉(zhuǎn)運的重要步驟，對果實產(chǎn)量和品質(zhì)起決定作用［9-10］。植物庫器官韌皮部卸載途徑主要有共質(zhì)體途徑和質(zhì)外體途徑兩種［11-12］，近年來果實生殖貯藏庫韌皮部同化物的卸載研究取得了顯著的進展，揭示了許多果實同化物卸載的途徑及其卸載機制［13］。研究表明，冬棗、梨棗和酸棗果實發(fā)育早期或前期同化物從篩分子的卸出主要采取質(zhì)外體途徑，果實發(fā)育中期轉(zhuǎn)變?yōu)楣操|(zhì)體途徑，果實發(fā)育后期重新轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)外體卸載途徑［14-15］。因此，光合同化物在果實庫中的卸載，隨著不同類型的果實、果實的不同發(fā)育時期、以及果實庫器官的不同組織部位而存在著差異。

韌皮部同化物卸載的研究方法主要有生理方法，如“空種皮杯法”、“卸載穴法”、“漿果杯法”、“組織圓片法”等；植物解剖學研究方法，如透射電子顯微鏡胞間連絲的超微結(jié)構(gòu)觀察［15］、膠體金免疫電子顯微鏡觀察；熒光染料活細胞示蹤技術(shù)，如熒光探針引入示蹤結(jié)合激光共聚焦掃描顯微鏡觀察［16-17］；其他研究韌皮部卸載細胞學路徑的方法，如顯微注射法、綠色熒光蛋白示蹤技術(shù)、同位素示蹤放射自顯影技術(shù)等。其中，熒光染料活細胞示蹤技術(shù)研究植物體內(nèi)物質(zhì)運輸具有悠久的歷史，尤其是羧基熒光素酯的應(yīng)用極大的簡化了韌皮部卸載和韌皮部后運輸?shù)臋z測，并且，結(jié)合激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，促進了同化物的韌皮部卸載及其在細胞間運輸?shù)难芯浚?6-17］。維管束是棗果實有機物和水分運輸?shù)闹匾ǖ?，而韌皮部為同化物卸載和運輸?shù)闹饕獔鏊?，在棗果實生長發(fā)育和品質(zhì)形成中具有非常重要的作用。熒光染料活細胞示蹤技術(shù)利用熒光染料的特點，使其與果實維管組織中的化合物結(jié)合而標記，從而對卸載路徑的過程進行示蹤。由于棗果實維管束深埋于組織中，對維管束在果實中的分布、果實維管束的結(jié)構(gòu)進行研究，是保障熒光染料活細胞示蹤技術(shù)研究結(jié)果準確的基礎(chǔ)。

靈武長棗（Ziziphus jujuba Mill cv. Lingwuchangzao）原產(chǎn)于寧夏靈武市，是棗中一個較優(yōu)良的、經(jīng)過多年自然篩選、具有寧夏地方特色的藥食同源鮮果品種，具有較高的食用及藥用價值［18］。果實中同化物的積累受卸載路徑的影響，因此，研究果實韌皮部同化物卸載和運輸?shù)耐緩?，對提高同化物向果實中運輸、闡明同化物積累機制非常重要［19］。目前，對靈武長棗的研究多數(shù)集中于其鮮果保鮮、生物學特性以及品種培育方面，而對于棗果實的顯微結(jié)構(gòu)特征及其維管束的分布和結(jié)構(gòu)研究較少，果實的顯微結(jié)構(gòu)與其他棗屬植物果實的異同也未有系統(tǒng)研究，靈武長棗果實同化物卸載途徑與冬棗、梨棗和酸棗等棗品種是否存在差異并不清楚。本研究以不同發(fā)育時期靈武長棗果實為實驗材料，在前期研究的基礎(chǔ)上［20-21］，采用石蠟切片技術(shù)明確不同發(fā)育時期果實維管束分布、結(jié)構(gòu)特征和變化規(guī)律，在此基礎(chǔ)上，通過棗果實維管組織中熒光示蹤劑引入方法的應(yīng)用，采用熒光染料活細胞示蹤技術(shù)，探討棗果實維管束韌皮部同化物卸載路徑的研究方法，為棗屬及其他同類果實同化物韌皮部卸載研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以位于寧夏靈武市的寧夏紅棗工程技術(shù)研究中心試驗基地6年生“靈武長棗”為供試材料，采用隨機設(shè)計，3次重復，每次重復選擇生長發(fā)育良好、樹勢適中、長勢和花期相似、栽培管理水平一致的5-10株植株。用毛線于6月10日標記同一天開放的花朵，每個重復標記3 000朵。

在“靈武長棗”開花坐果到果實成熟的發(fā)育過程中共設(shè)計4次實驗，具體分別在果實膨大前期（7月10日）、快速膨大期（8月9日）、著色期（9月8日）、完熟期（9月28日）左右，每次實驗時間均設(shè)定于上午9：00-11：00進行，按所標記植株從樹冠的東、西、南、北4個方位以及上、中、下、里、外各個方向選擇標記花朵的棗吊作為試驗對象進行石蠟切片試驗和熒光示蹤劑引入試驗，其中熒光示蹤劑引入試驗后將棗吊采摘用冰壺帶回實驗室，以試驗部位的棗果實作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 棗果實石蠟切片制作及觀察 不同發(fā)育時期果實經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次后，用刀片分割成合適的小塊，迅速投入FAA（70%乙醇∶冰醋酸∶甲醛=90∶5∶5）固定液中，抽氣至樣品沉底；固定24 h后將樣品從FAA固定液中取出，依次經(jīng)過不同濃度梯度的酒精脫水、透明、浸蠟、包埋，包埋塊采用石蠟切片法切片，切片厚度8-12 μm；切片經(jīng)二甲苯脫蠟、復水、番紅染色（50%酒精溶液配置）、脫水、固綠染色（95%酒精溶液配置）、脫水、透明、加拿大樹膠封片［20-21］，經(jīng)過LEICA顯微鏡下觀察并 拍照。

1.2.2 棗熒光染料活細胞示蹤技術(shù)

1.2.2.1 羧基熒光素酯（CFDA）的引入標記

（1）羧基熒光素酯（CFDA）母液的配制：用丙酮溶解熒光染料5（6）羧基熒光素酯（5（6）-carboxyfluorescein diacetate，CFDA）（Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品），使得羧基熒光素酯CFDA母液的濃度為25 mg/mL。避光貯存在-20℃。

（2）CFDA母液的稀釋：用含有5 mmol/L Mes-Tris和300 mmol/L山梨醇、pH為5.5的溶液稀釋熒光素母液，使熒光素的濃度為1 mg/mL，得到熒光素稀釋液，備用。

（3）CFDA的引入方法：由于靈武長棗果柄較短、質(zhì)脆、易斷裂造成果實脫落，因此選取靠近果柄的短枝作為引入熒光素酯的操作點。具體引入方法如下：方法1：選擇標記花朵的棗吊，將靠近果柄的短枝沖洗干凈后擦干，將1.5 mL尖底微量Eppendorf離心管底部用末端纏繞脫脂棉（占據(jù)管體積的2/3）的細棉線穿過后，將棉線的另一端用一細針（或縫紉針）從上向下穿過短枝韌皮部，不要劃傷或穿透木質(zhì)部（圖1-A）；用細鐵絲將Eppendorf管固定并保持豎直（圖1-B）；將棉線纏繞于短枝四周對該棉線進行固定，迅速在針穿進和穿出的部位滴加適量2.5 mmol/L EDTA（也可用移液槍滴入傷口處），防止胼胝質(zhì)形成而阻礙運輸，在針穿出部位涂抹凡士林防止CFDA溶液流失，用微量注射器向Eppendorf管中注入200 μL CFDA稀釋液（圖1-C）；迅速蓋好離心管蓋子（扎有通氣小孔），并用錫箔紙包好，防止CFDA見光分解，用剪刀剪掉短枝前端的枝條和葉片（圖1-D）。CFDA溶液在大氣壓力下慢慢滲入棉線進而進入韌皮部。CFDA處理48 h后采摘棗吊，用冰壺帶回實驗室。

圖1 CFDA的引入方法1圖示Fig.1 Photos showing the introduction method 1 of CFDA

方法2：選擇標記花朵的棗吊，用砂布將靠近果柄的短枝表皮輕輕磨擦后，用水沖洗掉表皮毛，不傷及木質(zhì)部，迅速將棉花團纏繞在靠近果柄的短枝上（圖2-A）；用封口膜將棉花團封好以免CFDA溶液揮發(fā)，采用微量注射器將配制好的1 mg/mL CFDA溶液200 μL緩慢注入棉花（圖2-B）；立即用封口膜（可再涂抹凡士林）密封針孔防止溶液外滲（圖2-C）；然后用錫箔紙將靠近果柄的短枝部位覆蓋好，防止CFDA見光分解，用剪刀剪掉短枝前端的枝條和葉片（圖2-D）。CFDA在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運48 h后采摘棗吊，用冰壺帶回實驗室。

圖2 CFDA的引入方法2圖示Fig.2 Photos showing the introduction method 2 of CFDA

1.2.2.2 洋地黃皂苷的引入處理 洋地黃皂苷對細胞質(zhì)膜有通透作用，用洋地黃皂苷處理作為對照（處理）。選擇部分標記花朵的棗吊，在引入CFDA的同時，將200 μL左右濃度為80 μg/mL（由二甲基亞砜母液稀釋所得）的洋地黃皂苷，采用前述引入CFDA的方法［見1.2.2.1（3）方法1和方法2］引入果實（圖3-A-F）。CFDA和洋地黃皂苷引入時，可以任意采用引入CFDA的方法1或方法2，可以相同也可以不同；如圖3所示，CFDA的引入采用方法1，洋地黃皂苷的引入采用方法2（圖3），CFDA和洋地黃皂苷引入方法不同。處理48 h后采摘棗吊，用冰壺帶回實驗室。

圖3 CFDA和洋地黃皂苷同時引入的方法圖示Fig.3 Photos showing the simultaneous introduction methods of CFDA and digitonin

1.2.2.3 Texas-Red的引入標記 德克薩斯紅Texas-Red（磺酰羅丹明101磺酰氯）是一種紅色的活細胞熒光染料，可以將Texas-Red引入果實來標記木質(zhì)部，從而達到區(qū)分木質(zhì)部與韌皮部的目的。將部分CFDA標記棗果實果柄浸泡于1 mg/mL Texas-Red溶液中（或?qū)⒐捻g皮部完全去掉，只留下木質(zhì)部），避光標記30-40 min，Texas-Red溶液在蒸騰拉力的作用下被吸進木質(zhì)部（圖4）。標記結(jié)束立即進行組織切片置于激光共聚焦顯微鏡CLSM下進行觀察。

圖4 Texas-Red標記的方法圖示Fig.4 Photos showing the introduction method of Texas-Red

1.2.2.4 組織切片 將試驗植株的3次重復處理的棗吊上采摘的果實3-5個，果實洗凈、擦干，選取帶有維管束的果肉組織分別進行徒手縱切或橫切，用體積百分含量為80%的甘油封片（可防止熒光的快速泯滅，同時價格低廉節(jié)省材料），低溫避光保存，盡快用激光共聚焦掃描顯微鏡CLSM觀察CFDA和Texas-Red在果實維管束內(nèi)的轉(zhuǎn)運情況，觀察熒光并拍照。

1.2.2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察 用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）分別觀察只引入CFDA、同時引入CFDA和洋地黃皂苷、同時引入CFDA和Texas-Red后，CFDA在棗果實維管束內(nèi)的轉(zhuǎn)運和Texas-Red的標記情況。CFDA產(chǎn)生的熒光采用488 nm激光激發(fā)，Texas-Red采用543 nm激光激發(fā)，利用CLSM觀察熒光染料的標記情況并拍照。

2 結(jié)果

2.1 棗果實維管束特征分析

膨大前期果實的維管束數(shù)量較多，尤其是內(nèi)果皮附近的維管束數(shù)量多、分布集中（圖5-A-C）。維管束發(fā)育趨向成熟，此時有單個維管束進行發(fā)育，也有兩個維管束背靠背進行發(fā)育，木質(zhì)部、形成層、韌皮部可以初步分辨（圖5-B-D）。形成層由多層的扁平細胞構(gòu)成，將木質(zhì)部與韌皮部分隔開，韌皮部由小的排列緊密的韌皮薄壁細胞、篩管、伴胞組成，排列較為緊密（圖5-B-D）。

圖5 膨大前期果實維管束特征Fig.5 Vascular bundles characteristic of fruit during the early bulking period

快速膨大期果實薄壁組織內(nèi)分布著基本成熟的維管束，由于果實的快速膨大，致使相同視野內(nèi)維管束的分布減少，此時期的維管束多為兩兩背靠背式、3個或4個圍成圓式發(fā)育，維管束木質(zhì)部、形成層、韌皮部清晰可辨，各維管束木質(zhì)部彼此緊靠，木質(zhì)部的導管細胞壁木質(zhì)化明顯（圖6-A-B）。韌皮部的篩管與篩胞清晰可辨，由木質(zhì)部向外延伸的形成層和韌皮部的中心基本在一條直線上，三者排列似扇形，形成層與韌皮部的面積寬廣（圖6-C-D）。

圖6 快速膨大期果實維管束特征Fig.6 Vascular bundles characteristic of fruit during the rapid enlargement period

著色期果實發(fā)育結(jié)構(gòu)特征基本與快速膨大期相似，此時中果皮的細胞空腔進一步增大，數(shù)量增多，圍成空腔的薄壁細胞拉長，體積增大明顯（圖7-AB）。相同視野內(nèi)的維管束數(shù)量更少，維管束主要有四至八個圍成并產(chǎn)生多個分支結(jié)構(gòu)，木質(zhì)部、形成層、韌皮部的排列與快速膨大期基本相同，結(jié)構(gòu)進一步發(fā)育成熟，韌皮部篩管與伴胞分化明顯、清晰可辨（圖7）。

圖7 著色期果實維管束特征Fig.7 Vascular bundles characteristic of fruit during the coloring period

完熟期果實薄壁細胞形成的空腔繼續(xù)增大，空腔的分布擴散至整個中果皮（圖8-A-B）。與著色期相比，維管束數(shù)量亦無明顯變化，但普遍出現(xiàn)相鄰維管束鏈接成線，且在維管束橫切中出現(xiàn)縱切現(xiàn)象，可能是由于維管束在后期發(fā)育時會出現(xiàn)維管束分叉現(xiàn)象，生長時間越長分叉現(xiàn)象越明顯（圖8-B-D）。

圖8 完熟期果實維管束特征Fig.8 Vascular bundles characteristic of fruit during the maturation period

2.2 棗果實維管束熒光示蹤劑引入結(jié)果

5（6）羧基熒光素酯（CFDA）引入韌皮部后，由細胞內(nèi)源酯酶分解為有熒光信號的5（6）羧基熒光素（CF），轉(zhuǎn)變?yōu)槟げ煌ㄍ傅臒晒庵甘緞?，可在韌皮部長距離運輸。CFDA引入膨大前期果實48 h后采摘果實橫切，CLSM觀察到不僅果實的韌皮部中具有明顯的CF綠色熒光，同時在周圍薄壁細胞中也分布著CF綠色熒光（圖9-A1-A3），說明在膨大前期韌皮部和周圍薄壁細胞之間存在著共質(zhì)體聯(lián)系，果實韌皮部同化物為共質(zhì)體卸載途徑；并且，韌皮部CF綠色熒光的分布也反映了維管束數(shù)量較多且分布集中，既有維管束單個發(fā)育，也有兩個維管束背靠背發(fā)育，其CF綠色熒光分布在外圍，而木質(zhì)部位于中央，熒光示蹤劑分布特征與膨大前期果實維管束特征一致（圖5）。快速膨大期果實CF綠色熒光主要局限于果實的韌皮部中，但韌皮部周圍薄壁細胞中也分布著少量的CF綠色熒光（圖9-B1），當同時引入CFDA和洋地黃皂苷48 h后，周圍薄壁細胞中CF綠色熒光明顯增加（圖9-B2），說明快速膨大期果實主要以質(zhì)外體途徑運輸同化物，但也通過共質(zhì)體卸出同化物；并且，韌皮部CF綠色熒光的分布反映了維管束數(shù)量的減少（圖9-B1-B2），由于維管束多為兩兩背靠背式、3個或4個圍成圓式發(fā)育，各維管束木質(zhì)部彼此緊靠，排列似扇形（圖6-C-D），因而，維管束縱切CF綠色熒光分布在外圍，而木質(zhì)部分布于中央（圖9-B1-B2）。CFDA引入著色期果實48 h后綠色熒光局限于果實的韌皮部中，在韌皮部周圍薄壁細胞中基本沒有CF綠色熒光（圖9-C1），當同時引入CFDA和洋地黃皂苷48 h后，周圍薄壁細胞中分布著大量的CF綠色熒光（圖9-C2），說明著色期果實通過質(zhì)外體途徑運輸同化物；并且，韌皮部CF綠色熒光的分布一定程度反映了維管束數(shù)量的減少（圖9-C1-C2），以及多個維管束形成的多分支結(jié)構(gòu)（圖7-A-D）。完熟期韌皮部CF綠色熒光的分布說明了維管束數(shù)量的減少，維管束縱切CF綠色熒光分布在外圍，而木質(zhì)部分布于中央反映了維管束產(chǎn)生的分支結(jié)構(gòu)（圖9-D1-D2）；并且，Texas-Red紅色的活細胞熒光染料引入部分已經(jīng)被CFDA標記48 h后的完熟期棗果實，CFDA標記且局限于維管束韌皮部（圖9-D1），紅色熒光示蹤劑Texas-Red標記木質(zhì)部（圖9-D2），維管束木質(zhì)部與韌皮部清晰分明，實驗結(jié)果準確可靠。不同發(fā)育時期棗果實維管束熒光示蹤劑引入結(jié)果，反映了熒光示蹤劑的分布特征與維管束分布特征的相關(guān)性。

圖9 棗果實維管束熒光示蹤圖Fig.9 Fluorescence tracing map of vascular bundles in jujube fruit

3 討論

熒光染料活細胞示蹤技術(shù)利用熒光染料的特點，將熒光染料引入棗果實維管束中，使其與果實維管組織中的化合物結(jié)合而標記，經(jīng)徒手切片或冰凍切片在CLSM下觀察，從而對卸載路徑的過程進行示蹤。由于棗果實體積較小且維管束深埋于薄壁組織中，較其他切片方式而言，徒手切片為活細胞觀察但其切片厚度一般不易掌握，往往會出現(xiàn)切片較厚的情況，在普通顯微鏡下不易識別維管束的特征，CLSM熒光條件下更不易識別，為保障徒手切片在CLSM下觀察同化物卸載路徑研究的準確性，避免盲目觀察產(chǎn)生的錯誤。因此，通過石蠟切片技術(shù)首先明確不同發(fā)育時期棗果實維管束結(jié)構(gòu)特征、分布和變化規(guī)律，在此基礎(chǔ)上，通過棗果實維管組織中熒光示蹤劑引入方法的應(yīng)用，探討棗果實維管束韌皮部同化物卸載路徑，是保障熒光染料活細胞示蹤技術(shù)研究結(jié)果準確的基礎(chǔ)。邊媛［3］的研究認為，棗果實維管束有核內(nèi)維管束、內(nèi)果皮維管束和中果皮維管束3種類型，均由果柄維管束發(fā)育而來，核內(nèi)維管束直接由果柄中心2條維管束伸入果核形成，內(nèi)果皮和中果皮維管束由果柄其余10條維管束及其分支形成。我們的研究也認為，隨果實的發(fā)育，維管束分支逐漸增加，形態(tài)因分支數(shù)目、分支角度不同，并且維管束均為外韌無限維管束，呈卵圓形，木質(zhì)部導管呈輻射狀緊密排列在維管束內(nèi)側(cè)，韌皮部排列在維管束外側(cè)與木質(zhì)部并生成束。膨大前期果皮維管束韌皮部比較發(fā)達，為早期內(nèi)果皮木質(zhì)化對大量物質(zhì)的需求提供了可能，從快速膨大期到著色期、完熟期隨果肉細胞發(fā)育，維管束分支增多，由最初的2個、3個分支增加到4個分支，與葡萄果實維管束的發(fā)育相似［22］。認為棗果實發(fā)育過程中維管束分支數(shù)目的增加與果實膨大生長相適應(yīng)，為果實生長發(fā)育奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

棗果實韌皮部同化物卸載運輸途徑的研究非常重要，相比其他文獻，以圖示的方式全過程展示棗熒光染料活細胞示蹤技術(shù)是本文最大的亮點之一。CFDA和Texas-Red是目前應(yīng)用廣泛的熒光染料，Texas-Red可引入棗果實來標記木質(zhì)部，CFDA對細胞無毒且化學惰性，具有膜透性，引入韌皮部后，其運輸方式與同化物的卸載方式相類似，是一個比較理想的共質(zhì)體標記物，被用于不同類型庫器官中同化物的卸載路徑研究。當CFDA被裝載到細胞里，經(jīng)內(nèi)源酯酶分解為膜不通透的共質(zhì)體同化物卸載的熒光指示劑CF，CF與同化物結(jié)合，其與蔗糖的運輸途徑也極為相似，能沿著胞間連絲擴散，從而對同化物韌皮部卸載路徑進行標記。并且結(jié)合具有質(zhì)膜通透作用的洋地黃皂苷的同步引入果實處理，作為韌皮部質(zhì)外體卸載途徑特征的印證。通過在CLSM下觀察CF和Texas-Red在棗果實內(nèi)的分布情況，完整的記錄活體細胞內(nèi)部的連續(xù)變化，進而明確棗果實韌皮部同化物卸載的路徑。在傳統(tǒng)熒光染料活細胞示蹤法的基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用了一種更為有效的、多途徑引入韌皮部熒光示蹤劑CFDA和木質(zhì)部熒光示蹤劑Texas-Red、可快速示蹤棗果實韌皮部同化物卸載路徑的熒光標記方法，熒光染料引入棗果實不需要專門的設(shè)備，操作方便，在CLSM熒光觀察過程中不需對樣品進行特殊處理、成本低廉、高效，觀察結(jié)果可靠度高。其特點主要表現(xiàn)在以下方面：（1）活體標記，可以追蹤熒光染料在果實內(nèi)的轉(zhuǎn)運規(guī)律；（2）安全，無需使用放射性同位 素；（3）相關(guān)性高的特定示蹤，熒光的分布反映了同化物的卸載路徑；（4）簡單，操作簡單且CLSM觀察結(jié)果可靠；（5）穩(wěn)定性好，進入細胞后熒光不受內(nèi)環(huán)境影響；（6）結(jié)果客觀，熒光染料的引入對細胞生理活動沒有任何影響；（7）經(jīng)濟實惠，費用經(jīng)濟且效率高。

在熒光示蹤劑引入位點的選擇方面，一類如無花果［16］等果柄較長、質(zhì)地較堅韌結(jié)實、不容易斷裂的果實，可采用果柄部位引入熒光示蹤劑研究同化物韌皮部的卸載路徑，果柄是引入熒光示蹤劑的最佳部位；另一類如藍莓［17］等果柄較短、質(zhì)地不夠堅韌結(jié)實的果實，通過果穗所在的莖將熒光示蹤劑引入韌皮部。對于“靈武長棗”這類棗屬植物來說，由于棗的葉肉細胞小而緊密，細胞間隙小，葉表皮覆蓋著蠟質(zhì)，通過摩擦葉片表皮或通過葉片壓力注射等方法很難將熒光素物質(zhì)引入葉片韌皮部；并且，由于木本果樹代謝復雜，韌皮部流速度慢、距離長，可能導致熒光示蹤劑因長時間引入而淬滅，達不到理想的標記效果，從而影響實時追蹤同化物在果實內(nèi)的卸載和運輸情況；另外，由于棗果柄非常短細、質(zhì)脆、特別容易斷裂造成果實脫落，通過棗果柄處韌皮部引入熒光示蹤劑操作異常困難，因此選取靠近果柄的短枝作為引入熒光素酯的位點，有利于熒光示蹤劑以較短的距離快速引入果實，避免了熒光的快速泯滅。

在熒光示蹤劑引入劑量和時間的選擇方面，無花果［16］采用的劑量為1 mg/mL CFDA溶液200 μL，引入時間為24 h，Texas-Red引入時間為1 mg/mL 30 min；而藍莓［17］采用的劑量為1 mg/mL CFDA溶液200 μL，引入時間為48 h或72 h，Texas-Red引入時間為1 mg/mL 40 min左右。由于本實驗方法為定性研究方法，膨大前期果實體積較小，引入可以采用1 mg/mL CFDA溶液200 μL、80 μg/mL洋地黃皂苷200 μL左右的常規(guī)濃度和劑量，引入時間選擇48 h的適中時間；而從快速膨大期到著色期、完熟期隨果實發(fā)育體積不斷增大，CFDA和洋地黃皂苷引入的劑量也可以適當增多，Eppendorf管和引入用的棉花團的體積也要相應(yīng)增大，引入時間也可略微延長；而對于Texas-Red引入來說，采用1 mg/mL Texas-Red引入30-40 min，也可以適當增加引入的時間。但不論是CFDA還是Texas-Red，引入時間都不能過長，否則會引起熒光的快速泯滅而影響研究結(jié)果的準確。

另外，由于棗吊短枝前端的枝條和葉片，特別是非功能葉片作為庫存在，能和果實競爭而固定一部分CFDA熒光染料或洋地黃皂苷，使得引入果實內(nèi)的熒光染料或洋地黃皂苷減少，不能達到最佳實驗效果，影響CLSM觀察結(jié)果。如果通過加大CFDA熒光染料和洋地黃皂苷用量來彌補，一方面對果實有害；另一方面也造成了不必要的浪費。因此，在CFDA和洋地黃皂苷引入操作時，通過剪掉短枝前端的枝條和葉片的方法來避免此情況的發(fā)生。

4 結(jié)論

通過“靈武長棗”果實維管組織中熒光示蹤劑引入方法的應(yīng)用，采用1 mg/mL CFDA溶液200 μL、80 μg/mL洋地黃皂苷200 μL的常規(guī)引入濃度和劑量，選擇48 h的適中引入時間，Texas-Red采用1 mg/mL濃度引入30-40 min，定性研究了棗果實維管束韌皮部同化物卸載路徑，以圖示的方式全過程展示棗熒光染料活細胞示蹤技術(shù)，創(chuàng)新應(yīng)用了具有質(zhì)膜通透作用的洋地黃皂苷的同步引入處理，作為韌皮部質(zhì)外體卸載途徑特征的印證，取得了較好的研究結(jié)果。