王敬文 嚴(yán)芳 柳浪 周雪平，2 王道文 周煥斌，5

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2. 浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州 310058； 3. 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 植物細胞與染色體工程國家重點實驗室，北京 100101；4. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，鄭州 450002； 5. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部桂林作物有害生物科學(xué)觀測實驗站，桂林 541399）

植物基因功能和分子育種等研究的前提是突變體材料的獲得。自然突變、人工誘變等方法存在效率低、周期長、難操作等缺點，因此，利用序列特異性核酸酶在特定基因位點產(chǎn)生 DNA 雙鏈斷裂、通過非同源末端連接和同源重組修復(fù)在靶基因位點引入突變的基因組編輯技術(shù)得到迅速發(fā)展?，F(xiàn)有的基因編輯技術(shù)根據(jù)核酸酶的不同，主要包含鋅指核酸酶（ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)蛋白核酸酶（TALENs）和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白（CRISPR/Cas），其中CRISPR/Cas系統(tǒng)具有操作簡單、效率高、成本低等優(yōu)點，受到廣大研究人員的青睞。CRISPR/Cas來自原核生物（如細菌和古細菌）的免疫系統(tǒng)，可以選擇性地靶向并破壞外源DNA，主要由Cas基因和CRISPR基因座（富含AT堿基的前導(dǎo)序列（leader）、涵蓋回文序列的20-50 bp的重復(fù)序列（repeat）和從外源捕獲的間隔序列（spacer）組成。基于Cas基因序列的差異、重復(fù)序列以及Cas簇的組成不同，Cas系統(tǒng)劃分為2大類6種類型（I- VI）［1-3］。目前，應(yīng)用較為廣泛的 Cas9和Cas12系統(tǒng)都屬于2類。

CRISPR/Cas9 作為研究最為廣泛的基因編輯系統(tǒng)，僅需要由crRNA和tracrRNA組成的sgRNA和單體Cas9蛋白就能通過HNH和RuvC兩大功能域?qū)崿F(xiàn)對外源DNA 的切割［4］，已成功在人類細胞、果蠅、水稻、擬南芥、小麥等中實現(xiàn)基因編輯。目前，研究報道表明通過挖掘Cas9的同源蛋白（如ScCas9和SaCas9等）和Cas9變體（xCas9和SpCas9-NG，SpRY）可對CRISPR/Cas9系統(tǒng)實現(xiàn)優(yōu)化升級，提高其編輯效率和縮小PAM序列的限制性。盡管如此，該系統(tǒng)仍存在編輯位點受限、脫靶情況較多等缺陷。

CRISPR/Cas12a是繼CRISPR/Cas9之后被開發(fā)用于基因組編輯的CRISPR/Cas系統(tǒng)。與Cas9蛋白不同，Cas12蛋白具有RNase和DNase活性，該系統(tǒng)可以同時完成crRNA的加工和其后對靶位點的切割［5］。Cas12a特異性識別富含“T”的PAM，且在PAM序列下游實現(xiàn)DNA雙鏈切割，形成黏性末端［6］；特別是Cas12a可以利用自身的核酶功能域同時對多個crRNA的表達陣列剪切，實現(xiàn)多基因編輯［7］。且Cas12a具有更高的精準(zhǔn)度，其脫靶率要低于Cas9蛋白［8］?；谄渥陨淼膬?yōu)點，CRISPR/Cas12a系統(tǒng)已成功應(yīng)用到煙草、擬南芥、大豆、玉米、水稻等植物基因組編輯中［9-14］。目前，僅報道了Francisella novicida Cas12a（FnCas12a）、Acidaminococcus sp.BV3L6 Cas12a（AsCas12a） 與Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cas12a（LbCas12a），且Cas12a的編輯活性受到溫度等因素的影響［15］。因此，鑒定新的Cas12a蛋白或?qū)σ延械腃RISPR/Cas12a系統(tǒng)進行優(yōu)化非常重要。

基于CRISPR/Cas系統(tǒng)開發(fā)的單堿基編輯技術(shù)可實現(xiàn)基因組中靶堿基的精準(zhǔn)替換，而這一過程并不依賴于雙鏈DNA斷裂和外源DNA供體［5］。單堿基編輯系統(tǒng)中的胞嘧啶堿基編輯器（CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（ABE）應(yīng)用最為廣泛。ABE通過脫氨作用將靶區(qū)域的腺苷變成肌苷，從而在DNA修復(fù)過程中完成A·T到 G·C的置換。到目前為止，所有可用的ABE均來自TadA7.10，并且在植物中不同基因組位點之間顯示出明顯不同的編輯效率，具有典型的位點依賴性。這些問題限制了ABE的應(yīng)用范圍。近日，魏鵬程團隊利用大腸桿菌腺嘌呤脫氨酶（TadA8e）與CRISPR系統(tǒng)融合構(gòu)建的ABE能實現(xiàn)穩(wěn)定高效的A>G替換的研究［16］，豐富了植物基因編輯系統(tǒng)。目前，在水稻中還未有關(guān)于CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的單堿基編輯的報道。然而針對富含AT的基因序列，CRISPR/Cas12a可提供的靶位點更多，更具優(yōu)勢。

因此，建立和優(yōu)化基于CRISPR/Cas12a的基因組編輯工具可提高編輯效率，彌補CRISPR/Cas9系統(tǒng)的缺陷和不足。鑒于此，本研究通過比較不同來源的Cas12a蛋白的核酸酶活性，并對其crRNA構(gòu)型進行優(yōu)化，在水稻中建立高效的基因組編輯系統(tǒng)。并利用TadA8e開發(fā)了一套識別TTTV為PAM的新型腺嘌呤堿基編輯器rBE58，在水稻基因組中實現(xiàn)了A>G替換。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本研究中所用的水稻材料是自然條件下在稻田中種植的早熟水稻粳稻品種Kitaake（Oryza sativa ssp. geng），從健康的植株中收獲的未成熟種子用于水稻轉(zhuǎn)化，收獲成熟的種子用于水稻原生質(zhì)體實驗，種子使用前用50%的84消毒液進行表面消毒。實驗時，水稻材料均是在75%相對濕度、30℃ 12 h光照和25℃ 12 h黑暗條件的溫室中培養(yǎng)。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒、試劑及引物 本研究所用的菌株和質(zhì)粒見表1。潮霉素、乙酰丁香酮、氨芐青霉素、羧芐青霉素、硫酸卡那霉素、利福平和2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸購自上海翊圣生物科技公司。酵母粉、胰蛋白胨、細菌用瓊脂粉、植物組培用瓊脂粉、MS培養(yǎng)基、2，4-二氯苯氧乙酸、激動素、萘乙酸、6芐基腺嘌呤、PEG4000購自北京索萊寶公司。十六烷基三甲基溴化銨、β-巰基乙醇、瓊脂糖、溴化乙錠、Axygen質(zhì)粒DNA小量試劑盒、Axygen DNA凝膠回收試劑盒購自北京冰達生物科技公司。NaCl、三氯甲烷、異丙醇、乙醇、乙二胺四乙酸、Tris、甘露醇、山梨醇和蔗糖等常用試劑購自國藥集團，為分析純。各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase、ATP、T4 polynucleotide kinase、FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase等 購 自Thermo Scientific。BsaI購自NEB。PCR擴增用的高保真酶KOD Plus購自TOYOBO，Gateway? LR ClonaseTMII Enzyme Mix購自Invitrogen。實驗中用到的引物的合成及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

表1 實驗中涉及的質(zhì)粒和菌株Table 1 Plasmids and strains involved in this study

1.2 方法

1.2.1 （1）crRNA的設(shè)計及打靶載體的構(gòu)建 LbCas-12a-crRNA表達盒利用玉米泛素化啟動子驅(qū)動具有核酸酶活性的HH核酶和HDV核酶單元［10］、CRISPR/LbCas12a系統(tǒng)的crRNA 靶序列表達，至Nos終止子終止，該表達盒序列交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。然后用引物Ubi-F3/Nos-R3擴增上述合成的LbCas12a-crRNA表達盒，與用NcoI/EcoRV雙酶切后的pENTR4［17］載體連接，經(jīng)酶切驗證及測序，最終得到正確質(zhì)粒，命名為pHZ11（圖1-B）。用類似的方法構(gòu)建pHZ4（圖1-B）。由公司合成AsCas12a-crRNA片段，將合成的AsCas12a-crRNA片段和pHZ11用SpeI/EcoRV酶切后連接，將pHZ11中的LbCas12a-crRNA替換成AsCas12a-crRNA，命名為pHZ4。本研究所選用的crRNA序列均由CRISPR-GE（http：//skl.scau.edu.cn/targetdesign/）設(shè)計得出，設(shè)計原則為：PAM為TTTV，crRNA長度23 nt?；パa的引物對在磷酸化后通過熱處理退火反應(yīng)的方式結(jié)合成雙鏈，然后插入BsaI酶切后的pHZ11或pHZ4載體。

（2）Cas12a表達載體的構(gòu)建 首先對AsCas12a和LbCas12a基因按照水稻密碼子使用偏好性進行了密碼子優(yōu)化后委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，再通過BamHI和BcuI酶切將合成的基因片段AsCas12a與LbCas12克隆至瞬時表達載體pUC19∶rBE3與雙元表達載體pUbi∶rBE3［18］中，替換原來的rBE3基因，得到pUC19∶AsCas12a、pUC19∶LbCas12a、pUbi∶AsCas12a和pUbi∶ LbCas12a（圖1-A）。在pUC19中，由CaMV 35S啟動子驅(qū)動Cas12a表達，用于水稻原生質(zhì)體瞬時表達檢測Cas12a的編輯活性；在雙元載體中，由玉米泛素蛋白啟動子（Ubi-p）驅(qū)動Cas12a表達，可用于水稻穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化獲得基因編輯植株。

（3）水稻腺嘌呤堿基編輯器pUbi∶rBE58載體的構(gòu)建 為了在CRISPR/LbCas12a系統(tǒng)中優(yōu)化腺嘌呤堿基編輯器，我們按照水稻密碼子使用的偏好性將TadA8e基因與催化失活的LbCas12a（H832A）基因（dLbCas12a）的5′末端融合在一起優(yōu)化后交由生工生物工程（上海）股份有限公司（命名為rBE58），然后利用BamHI和BcuI對合成的rBE58基因片段和實驗室原有pUbi∶rBE3［18］雙元載體酶切，形成可用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的載體pUbi∶rBE58 （圖1-C）。

圖1 載體示意圖Fig.1 Schematics of gene editing constructs

在水稻原生質(zhì)體中，crRNA表達框與pUC19∶Cas12a共同轉(zhuǎn)化完成瞬時表達；而在水稻轉(zhuǎn)化體系中，先利用AatII對pHZ11（或pHZ4）-crRNA進行酶切，通過Gateway的LR反應(yīng)將含不同crRNA的質(zhì)粒pHZ11（或pHZ4）-crRNA插入雙元載體pUbi∶Cas12a或pUbi∶rBE58中得到pUbi∶Cas12a-crRNA或pUbi∶rBE58-crRNA，最終的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105即可進行侵染水稻愈傷。

1.2.2 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 使用之前報道的方法進行原生質(zhì)體的分離和PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染［19］。轉(zhuǎn)染表達Cas蛋白和crRNA（20 μg）的質(zhì)粒DNA混合物，然后將轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體在28℃下孵育48 h，收集原生質(zhì)體后提取基因組DNA，用于限制性酶切驗證或測序。

1.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 通過電穿孔將上述得到的pUbi∶Cas12a-crRNA或pUbi∶rBE58-crRNA載 體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105。按照先前報道的方法，使用剝殼后的Kitaake種子誘導(dǎo)水稻愈傷組織進行遺傳 轉(zhuǎn)化［20］。

1.2.4 編輯效率檢測 采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法提取水稻原生質(zhì)體和轉(zhuǎn)基因材料的基因組DNA。

為了檢測原生質(zhì)體中是否發(fā)生預(yù)期突變，將提取的原生質(zhì)體基因組DNA用BamHI酶解6 h，然后使用高保真酶KOD Plus和靶位點對應(yīng)的引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用BamHI酶解3 h，并在瓊脂糖凝膠上分離，富集未切割的條帶，最后連接到pGEM-T載體，挑單克隆進行Sanger測序鑒定突變的序列。

為了檢測通過水稻遺傳轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因材料的編輯效率，將提取的基因組DNA用包含預(yù)期編輯位點的基因特異性引物進行PCR擴增，通過Sanger測序驗證突變的序列。突變愈傷（植株）數(shù)與所檢測的轉(zhuǎn)基因愈傷（植株）總數(shù)的比例，即為轉(zhuǎn)基因愈傷的編輯效率。

2 結(jié)果

2.1 CRISPR/Cas12a編輯活性的檢測

首先，利用水稻原生質(zhì)體實驗對構(gòu)建的CRISPR/Cas12a系統(tǒng)進行編輯活性檢測。將分別表達Cas蛋白的pUC19載體和帶有靶位點的crRNA載體通過PEG介導(dǎo)水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入水稻細胞中進行共表達，轉(zhuǎn)染48 h后收集并提取原生質(zhì)體基因組DNA，通過BamHI酶切消解去除未發(fā)生編輯的靶位點，富集攜帶有成功編輯（即BamHI酶切位點被破壞）的靶位點區(qū)域片段，最后對基因組DNA靶位點區(qū)域進行PCR擴增和Sanger測序。結(jié)果顯示在crRNA為23 nt時，LbCas12a和AsCas12a處 理的樣品都成功擴增出目的片段，且在靶位點引起的突變基本都在-6--12 bp之間（圖2），上述結(jié)果證明以TTTV為PAM的CRISPR/LbCas12a和CRISPR/AsCas12a在水稻中都具有編輯活性。

圖2 利用水稻原生質(zhì)體檢測CRISPR/AsCas12a和CRISPR/LbCas12a的核酸酶活性Fig.2 Detection of CRISPR/LbCas12a in rice protoplasts and the nuclease activity of CRISPR/AsCas12a

2.2 crRNA構(gòu)型對Cas12a編輯活性的影響

Moon等［21］2018年研究表明，在20 nt crRNA 的3′添加UUUUAUUUU（U4AU4）序列可轉(zhuǎn)錄形成最佳構(gòu)型的crRNA，能增強AsCas12a在人類細胞中編輯效率。因此，為了建立高效的CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的水稻編輯系統(tǒng)，我們探索了crRNA長度和crRNA 3′端富含尿嘧啶（U）對編輯效率的影響。本研究設(shè)計了4種crRNA，分別是：（1）20 nt，（2）20 nt+U4AU4（20+9 nt），（3）23 nt，（4）23 nt+U4AU4（23+9 nt），選擇3個水稻內(nèi)源基因（OsCERK1，OsCPK13和OsCPK17）進行打靶實驗（表2）。通過PCR擴增和Sanger測序?qū)Λ@得的獨立轉(zhuǎn)基因水稻品系進行基因型分析。結(jié)果顯示：LbCas12a在3個靶位點處均顯示出強大的活性（圖3），當(dāng)測試 的crRNA為23 nt時，在 OsCERK1、OsCPK13和OsCPK17中編輯效率分別為77.78%、84.21%和86.67%，并且大多數(shù)突變類型為雙等位基因突變；當(dāng)使用23 nt+U4AU4為crRNA時，LbCas12a的核酸酶活性大大降低；雖然與20 nt相比，使用20 nt+U4AU4為crRNA可使在OsCERK1和OsCPK17位點的編輯效率有所提高，但還是低于23 nt crRNA的編輯效率（圖3）。相較于LbCas12a，AsCas12a僅在OsCERK1和OsCPK13中檢測到突變，編輯效率范圍為0至46.43%，其中，使用20 nt為crRNA、靶向OsCPK13時編輯效率最高。綜上所述，在水稻中LbCas12a的編輯活性明顯優(yōu)于AsCas12a，并且LbCas12a使用23 nt為 crRNA編輯效率最高，同時通過在靶序列的3′端添加U4AU4并不能提高AsCas12a和LbCas12a的編輯活性。

圖3 不同crRNA構(gòu)型對AsCas12a和LbCas12a核酸酶活性的比較Fig.3 Comparison of nuclease activities of AsCas12a and LbCas12a with different crRNA configurations

2.3 基于TadA8e-dLbCas12a水稻基因組腺嘌呤堿基編輯的構(gòu)建

本研究試圖構(gòu)建CRISPR/LbCas12a系統(tǒng)介導(dǎo)的腺嘌呤堿基編輯器，用于在水稻基因組中“AT”富集的區(qū)域引入A>G替換。本研究基于TadA8e建立了CRISPR/dLbCas12a介導(dǎo)的腺嘌呤堿基編輯器pUbi∶rBE58，并在水稻中檢測其可行性和有效性。鑒于上述結(jié)果，本研究選擇使用以TTTV為PAM的23 nt crRNA打靶3個水稻內(nèi)源基因（OsCPK15，Bsrd1，OsJAZ4）（表2）。結(jié)果顯示，在Bsrd1和 Os-JAZ4的靶位點沒有檢測到目的突變，僅有OsCPK15檢測到目的突變，在獲得的48個獨立的轉(zhuǎn)基因水稻品系中，鑒定出16個發(fā)生了A到G置換的植株（效率為33.33%），編輯框在TTTV PAM下游的+8-+14，活性窗口寬7 nt。其中，14個植株在PAM下游的第8位或第12位發(fā)生了單個靶堿基的置換，2個植株發(fā)生了多個靶堿基的置換事件，分別為PAM下游的第12、14位和PAM下游的第10、12、14位（圖4）。這些數(shù)據(jù)表明，利用基于dLbCas12a的腺嘌呤堿基編輯器rBE58在水稻中實現(xiàn)定向堿基A向G的置換是可行的，但是存在位點依賴性。

圖4 rBE58對水稻內(nèi)源基因OsCPK15的靶位點腺嘌呤堿基編輯Fig.4 Targeted adenine base editing of endogenous gene OsCPK15 in rice using the rBE58 system

表2 實驗中所用靶位點Table 2 Target sites used in this study

3 討論

基于CRISPR/Cas12a建立的基因組編輯工具可實現(xiàn)靶位點的高效編輯，且以識別TTTV為PAM，彌補了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的缺陷和不足，在動植物基因組編輯具有極大的潛力。據(jù)報道，在哺乳動物中，在20 nt crRNA的3′端加上U4AU4序列能改善其結(jié)合親和力，促進細胞內(nèi)crRNA和Cas12a蛋白的結(jié)合，可能有助于核糖核蛋白復(fù)合物形成的穩(wěn)定，進而提高其編輯效率，但是卻不影響脫靶效應(yīng)［21］。然而在本研究中，CRISPR/LbCas12a和CRISPR/AsCas12a系統(tǒng)可以在水稻中實現(xiàn)基因編輯，但是crRNA的3′端富含“U”并沒有明顯改善其在水稻中的編輯活性，這可能是由于物種差異性造成的，同時crRNA的3′端富含“U”是否能提高編輯的特異性，即減少可能存在的脫靶效應(yīng)需要進一步實驗驗證。

CRISPR/SpCas9及其突變體（SpCas9-NG和Sp-RY）或同源蛋白（ScCas9和SaCas9等）介導(dǎo)的腺嘌呤編輯器在水稻中已實現(xiàn)A·T到G·C，并將其識別的NGG PAM逐漸擴寬至NRN PAM，但是由于這些蛋白識別的PAM序列仍需要G或A的存在，使得Cas9介導(dǎo)的腺嘌呤堿基編輯器無法有效地實現(xiàn)富含AT的靶DNA（尤其是基因啟動子）的腺嘌呤堿基編輯。本研究利用識別TTTV PAM序列的CRISPR/dLbCas12a系統(tǒng)建立了的水稻腺嘌呤編輯器rBE58，該編輯器的獲得使得富含AT的靶DNA（尤其是基因啟動子）的腺嘌呤堿基編輯成為現(xiàn)實，極大擴展了腺嘌呤堿基編輯技術(shù)在水稻中的應(yīng)用和靶向范圍。此外，rBE58與Cas9介導(dǎo)的腺嘌呤編輯器具有不同的堿基編輯活性窗口。本研究中，rBE58能夠?qū)崿F(xiàn)內(nèi)源基因OsCPK15靶位點處PAM下游的第8、10、12和14位的靶堿基的定向替換，即其編輯活性窗口位于crRNA靶位點的中間位置（大約+10位置），這與已報道的Cas12a介導(dǎo)的動物細胞堿基編輯的編輯活性窗口一致［22］，但與而傳統(tǒng)的Cas9蛋白的活性窗口位于PAM的5′端存在差別。因此，rBE58豐富了ABE工具箱，為研究人員提供了更多的選擇。然而，該編輯器在3個內(nèi)源基因的檢測中，僅有OsCPK15發(fā)生了A向G的置換，說明rBE58的編輯效率具有位點依賴性，這可能與染色質(zhì)狀態(tài)，DNA和/或組蛋白的修飾及dLbCas12a和腺嘌呤脫氨酶之間的相容性問題有關(guān)。

綜上所述，本研究提出使用CRISPR/Cas12a系統(tǒng)在水稻中進行精準(zhǔn)堿基編輯的思路，為將來開發(fā)更多與CRISPR/ Cas12a相關(guān)的工具用于基因功能研究和分子作物育種提供了良好的技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本研究以水稻為植物模型，通過篩選不同來源的Cas12a同源蛋白、crRNA長度、crRNA構(gòu)型等因素，建立了高效的CRISPR/LbCas12a介導(dǎo)的水稻基因編輯系統(tǒng)，該系統(tǒng)識別TTTV為PAM，且在crRNA為23 nt時具有更高的編輯效率?；赿LbCas12a和腺嘌呤脫氨酶TadA8e成功建立的腺嘌呤堿基編輯器rBE58在水稻基因組中成功實現(xiàn)A>G堿基替換。