朱雅靜，王亞楠，趙李?yuàn)?，余俊玲，王雪，許玉蘭，蔡年輝，唐軍榮

(1.西南林業(yè)大學(xué) 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

紫果西番蓮(Passifloraedulis)為西番蓮科(Passifloraceae)西番蓮屬(Passiflora)植物。西番蓮屬植物大約有400余種，多產(chǎn)于熱帶美洲，在我國有19種，2變種[1]。其中紫果西番蓮因其芳香物質(zhì)含量多、營養(yǎng)價(jià)值豐富、藥用價(jià)值高等特點(diǎn)[2-4]，是該屬植物中主要被開發(fā)利用的一種[5]。紫果西番蓮在西雙版納傣族自治州種植面積達(dá)2 333.3 hm2，其生產(chǎn)的西番蓮濃縮汁全部出口。紫果西番蓮雖速生、豐產(chǎn)，但仍供不應(yīng)求，市場需求量以每年15%～20%的速度增長，在國際市場熱帶水果中紫果西番蓮占據(jù)重要地位[6-8]。但由于紫果西番蓮易感染莖基腐病且抗寒性差[9]，導(dǎo)致其產(chǎn)量及質(zhì)量受到影響。而開展紫果西番蓮的植物組織培養(yǎng)研究，對(duì)于紫果西番蓮進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新、優(yōu)良材料的快速繁殖具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[10]。

當(dāng)前，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)通過不同操作、添加不同激素誘導(dǎo)紫果西番蓮的葉、芽、莖、根、下胚軸均成功獲得無菌苗[11-12]。由于紫果西番蓮種子細(xì)小，在其植物組織培養(yǎng)過程中子葉被認(rèn)為是更好的培養(yǎng)起始材料。此外，無菌苗的子葉經(jīng)過了一定的時(shí)間發(fā)育，與子葉最初時(shí)的原始狀態(tài)相比，材料更多，取材的準(zhǔn)確性更高，且子葉與成熟的植株相比再生能力更強(qiáng)[8,13]。因此，本研究以紫果西番蓮的子葉為材料，開展子葉再生不定芽的誘導(dǎo)，及其誘導(dǎo)后的不定芽生根和移栽煉苗研究，以期為紫果西番蓮的離體快繁，以及基于植物組織培養(yǎng)的種質(zhì)創(chuàng)新、遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以紫果西番蓮的種子經(jīng)無菌萌發(fā)后小苗上的子葉為外植體。

1.2 間接器官發(fā)生途徑誘導(dǎo)不定芽

將紫果西番蓮無菌子葉切出傷口后放入1 mg/L 2,4-D+0.5 mg/LTDZ 的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出愈傷組織[14]，將愈傷組織切成小塊，于超凈工作臺(tái)上接入添加TDZ(0.5、1.0 mg/L)和2,4-D(1.0、1.5、2.0 mg/L)的MS培養(yǎng)基中，共6個(gè)處理(表1)，每個(gè)處理接5瓶，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)到光培養(yǎng)，培養(yǎng)室的溫度為(25±2)℃，光照時(shí)間為12 h/d，光照強(qiáng)度1 000～1 500 Lx。30 d后統(tǒng)計(jì)分化結(jié)果。

表1 不同激素濃度對(duì)愈傷組織分化芽的影響

1.3 直接器官發(fā)生途徑誘導(dǎo)不定芽

將紫果西番蓮無菌子葉切出傷口后于超凈工作臺(tái)上接入添加6-BA(1.0、2.0 mg/L)與IBA(0.5、1.0 mg/L)的MS培養(yǎng)基中，共4個(gè)處理(表2)，每個(gè)處理接5瓶，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照時(shí)間為12 h/d，光照強(qiáng)度1 000～1 500 Lx。30 d后統(tǒng)計(jì)分化結(jié)果。

表2 不同濃度激素對(duì)子葉直接分化不定芽的影響

1.4 生根培養(yǎng)基篩選

使用1 mg/L6-BA+ 0.3 mg/LIAA的MS培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽增殖培養(yǎng)[14]。將長至2 cm左右的不定芽轉(zhuǎn)入以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，并添加IBA(0.1、0.2、0.3 mg/L)、NAA(0.3、0.5 mg/L)與0.2 g/L碳粉的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，共6個(gè)處理(表3)，設(shè)對(duì)照與重復(fù)，30 d后統(tǒng)計(jì)生根情況。

表3 不同濃度激素對(duì)生根苗的影響

1.5 移栽基質(zhì)的篩選

將生根無菌苗移至室內(nèi)自然光下進(jìn)行煉苗，將蓋子逐漸打開直到15 d后完全打開，將生根苗取出浸泡于0.1%的多菌靈中10 min后移至不同配比的基質(zhì)中。土壤基質(zhì)為紅土、腐殖土、珍珠巖的不同比例混合(表4)。

表4 不同土壤基質(zhì)對(duì)組培苗的成活率影響

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

統(tǒng)計(jì)分化出不定芽的愈傷組織與子葉數(shù)量及植株的生根數(shù)。用直尺(cm)測(cè)量植株的生根長度，記錄不同土壤中植株的成活數(shù)。計(jì)算不同誘導(dǎo)途徑不定芽的分化率、生根率和成活率。數(shù)據(jù)采用Excel 2011和SPSS 18.0軟件進(jìn)行整理和分析。

其中：在器官間接發(fā)生途徑中，不定芽分化率=分化出不定芽的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù)×100%；

在器官直接發(fā)生途徑中，不定芽分化率=分化出不定芽的子葉數(shù)/接種的子葉數(shù)×100%；

生根率=生根數(shù)/接種數(shù)×100%；

成活率=成活數(shù)/接種數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 器官間接發(fā)生途徑誘導(dǎo)不定芽

植物外源激素具有雙重作用，濃度過高將抑制或殺死植物，濃度過低對(duì)植物的誘導(dǎo)生長不能起到最好的作用，對(duì)不同的植物組織選擇合適的濃度才能使其得到較好的生長。在對(duì)紫果西番蓮子葉愈傷組織進(jìn)行分化不定芽的試驗(yàn)中(圖1)，如表1所示，2,4-D濃度為1 mg/L和1.5 mg/L時(shí)均有不定芽產(chǎn)生，不定芽分化率隨2,4-D濃度的增加而下降，當(dāng)2,4-D濃度達(dá)到2 mg/L時(shí)，分化不定芽數(shù)為0，說明高濃度的2,4-D反而不利于不定芽的分化。在1 mg/L 2,4-D+1 mg/L TDZ+MS這一配方下分化出不定芽的愈傷組織數(shù)量最多，分化率達(dá)66.7%。

圖1 愈傷組織分化不定芽

2.2 器官直接發(fā)生途徑誘導(dǎo)不定芽

6-BA是一種高效、穩(wěn)定的細(xì)胞分裂素，IBA是一種常用于離體快繁的生長素，二者配合使用可促進(jìn)外植體分化不定芽。在通過無菌子葉直接分化不定芽的試驗(yàn)中，如表2所示，培養(yǎng)30 d后發(fā)現(xiàn)4個(gè)處理均能直接分化出不定芽，在6-BA濃度為1 mg/L時(shí)誘導(dǎo)不定芽數(shù)量較多，濃度為2 mg/L時(shí)誘導(dǎo)出的不定芽長勢(shì)較高，說明高濃度的6-BA利于不定芽的生長，低濃度6-BA利于不定芽的分化。在不同激素作用下能分化出不定芽的子葉較能分化出不定芽的愈傷組織數(shù)量多。如圖2所示，在1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA的MS培養(yǎng)基中通過誘導(dǎo)直接分化出不定芽的子葉數(shù)量最多，分化率達(dá)83.3%。當(dāng)不定芽長至1.5～2.0 cm時(shí)可切下進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

圖2 子葉直接分化不定芽

2.3 生根培養(yǎng)基篩選

將不定芽移至1 mg/L 6-BA+0.3 mg/LIAA的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)其增殖倍數(shù)與平均苗高，增值倍數(shù)為2.6，苗高達(dá)2.7 cm，不定芽長勢(shì)良好，如圖3所示。將長至2.0 cm左右的植株，移至含不同激素配比的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在生根培養(yǎng)基中加入0.2 g/L的碳粉。適量的碳粉能提供暗環(huán)境利于根的形成與生長。培養(yǎng)30 d后，由表3可知當(dāng)NAA為0.3 mg/L時(shí)，生根率隨著IBA濃度的增加開始增加，但當(dāng)IBA達(dá)到0.3 mg/L時(shí)生根率不再增加；當(dāng)NAA為0.5 mg/L時(shí)，生根率隨著IBA濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA+0.2 g/L碳粉的1/2 MS培養(yǎng)基中，紫果西番蓮植株生根率最高，達(dá)83.3%，且在該配比下植株的根系生長情況最佳，見圖4。

圖3 不定芽增殖Fig.3 Adventitious bud multiplication

圖4 紫果西番蓮生根

2.4 移栽基質(zhì)的篩選

將培養(yǎng)基蓋逐漸打開在室內(nèi)適應(yīng)15 d后，移至不同的基質(zhì)中，30 d后觀察并記錄植株生長情況。由表4可知，僅用紅土栽培的植株表現(xiàn)出黃化、枯萎死亡、植株矮化的現(xiàn)象，相比較之下僅用腐殖土栽種的植株成活率稍高，但仍不適宜紫果西番蓮植株的生長。紅土有保水的作用，腐殖土能提供較多的營養(yǎng)，當(dāng)紅土與腐殖土、珍珠巖配合使用時(shí)較利于植株生長，且配比為1︰2︰1時(shí)植株長勢(shì)好，成活率最高，達(dá)93.3%，移栽后紫果西番蓮無菌苗長勢(shì)良好(圖5)。

圖5 紫果西番蓮移栽

3 討論與結(jié)論

植物組織培養(yǎng)中不定芽的發(fā)生方式可以分為2種，即直接發(fā)生型和間接發(fā)生型。其中直接發(fā)生型中常采用芽、莖和下胚軸作為外植體通過激素直接誘導(dǎo)器官得到不定芽[11,15]。在本研究中，采用紫果西番蓮子葉在1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA的MS培養(yǎng)基中通過直接器官發(fā)生途徑分化出不定芽，其分化率為 83.3%。這一結(jié)果與張琴等[16]對(duì)紫果西番蓮子葉進(jìn)行分化的結(jié)果相似，都選用了6-BA這一細(xì)胞分裂素，其主要作用是促進(jìn)不定芽的萌發(fā)，其中6-BA濃度過高或過低都會(huì)抑制不定芽的形成[17]。在間接發(fā)生型中常采用葉、子葉為外植體經(jīng)脫分化得到愈傷組織再分化得到不定芽[18-19]。在本研究中，紫果西番蓮子葉經(jīng)脫分化得到的愈傷組織在1 mg/L 2,4-D+1 mg/L TDZ的MS培養(yǎng)基中通過器官間接發(fā)生途徑也分化出不定芽，其分化率為66.7%。這一分化率高于王亞楠等[14]的研究，雖都采用同類型的激素，但激素濃度不同，導(dǎo)致分化結(jié)果不同。結(jié)果表明，同一器官在不同的激素濃度與培養(yǎng)條件下其分化能力有較大差異[20-21]。其中在器官直接發(fā)生型中選擇合適的激素種類及濃度不僅能將操作過程簡化還能縮短育種周期，此途徑無需通過脫分化即可獲得不定芽，在需要快速得到大量無菌苗的工作中適用。同樣，器官間接發(fā)生型中激素的選擇也至關(guān)重要，2,4-D與TDZ共同作用可促使愈傷組織分化出不定芽，2,4-D在分化過程中起到脫分化的作用[22]，但2,4-D濃度過高對(duì)植物有很大的毒害作用[23]。此方式經(jīng)過脫分化再分化，先形成愈傷組織后才萌發(fā)出不定芽，而脫分化細(xì)胞易于誘導(dǎo)變異，所以該方式適用于突變育種及基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立[24-25]。

此外，本研究中，通過直接發(fā)生型或間接發(fā)生型得到的紫果西番蓮不定芽在0.5 mg/L NAA +0.1 mg/L IBA+0.2 g/L碳粉的1/2 MS培養(yǎng)基中生根狀況均較好，生根率可達(dá)83.3%。生根苗在不同基質(zhì)配比的土壤中呈現(xiàn)不同的生長狀態(tài)[26]，在僅用紅土栽培時(shí)無菌苗成活率最低，大部分枯萎死亡。由于紅土比較板結(jié)不利于植物根系呼吸，易積水導(dǎo)致根系腐爛[27]，但其有保水的優(yōu)勢(shì)與珍珠巖一起使用能夠中和其缺點(diǎn)，而加入腐殖土可以提高土壤的營養(yǎng)成分，使植株長得更好。所以本研究中篩選出紅土︰腐殖土︰珍珠巖=1︰2︰1的土壤基質(zhì)培育紫果西番蓮無菌苗，成活率可達(dá)93.3%。且在移栽紫果西番蓮無菌苗的過程中煉苗時(shí)間顯得尤為重要，在室內(nèi)煉苗15 d的無菌苗明顯比直接移栽的苗長勢(shì)好，成活率更高。

本研究利用紫果西番蓮子葉通過2種器官發(fā)生途徑成功建立了紫果西番蓮的植株再生體系，并篩選出了適合紫果西番蓮移栽煉苗的基質(zhì)。研究結(jié)果進(jìn)一步完善了紫果西番蓮的植物組織培養(yǎng)技術(shù)，不僅為紫果西番蓮倍性育種及轉(zhuǎn)基因工程奠定了一定基礎(chǔ)，也為紫果西番蓮無菌苗的栽培提供了科學(xué)依據(jù)與技術(shù)支撐。