不同分子質(zhì)量ε-聚-L-賴氨酸對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)制

廖鈺婷，王賀莉，董天宇，楊 萍，唐昆鵬，譚之磊，賈士儒

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300457）

ε-聚賴氨酸（ε-Poly-lysine，簡(jiǎn)稱ε-PL）來(lái)源于白色鏈霉菌（Streptomyces albus）發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，是一種高安全性的天然食品保鮮防腐劑[1]。ε-PL 是一種乳白色粉末，有很強(qiáng)的吸濕性，略有苦味。ε-PL 在處理G+、G-、霉菌時(shí)均有一定的抑菌效果，且對(duì)耐熱性芽孢桿菌有一定的抑制作用[2]。此外，ε-PL 還具有抗噬菌體、內(nèi)毒素選擇性移除、抑制胰脂肪酶和抗腫瘤活性等多種功能[3-6]。ε-PL的抑菌機(jī)制已有較多報(bào)道，如薄濤等[7]研究了ε-PL 對(duì)釀酒酵母的抑菌機(jī)制，結(jié)果表明ε-PL 對(duì)釀酒酵母的抑菌活性依賴于其作用濃度的高、低，并且其抑菌活性受二價(jià)陽(yáng)離子的影響。譚之磊等[8]通過(guò)研究ε-PL 與卵白蛋白的相互作用，得到ε-PL可與卵白蛋白形成帶不同電荷的復(fù)合物，導(dǎo)致ε-PL 對(duì)大腸桿菌的抑菌效果下降。侯穎等[9]研究了不同致死濃度ε-PL 與抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸共同作用對(duì)釀酒酵母活性的影響，得出ε-PL 能夠誘發(fā)ROS 上升，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡階段，抑制細(xì)胞活性，此外，N-乙酰半胱氨酸能夠降低ε-PL 的抑菌活性。ε-PL 是由不同分子質(zhì)量肽鏈組成的混合物，不同分子質(zhì)量的ε-PL 具有不同的抑菌活性。目前對(duì)不同分子質(zhì)量ε-PL 抑菌活性的研究不多。蘇秦之[10]發(fā)現(xiàn)ε-PL 抑制酵母菌活性的能力與其分子質(zhì)量密切相關(guān)，相比于低分子質(zhì)量（<1 ku）ε-PL，高分子質(zhì)量（1～3 ku 和>3 ku）ε-PL 和ε-PL 產(chǎn)品使細(xì)胞膜的穿透活性增強(qiáng)，細(xì)胞表面粗糙，出現(xiàn)凹陷和微膠粒，并且高分子質(zhì)量ε-PL 和ε-PL 產(chǎn)品對(duì)糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)有較強(qiáng)的抑制作用。

金黃色葡萄球菌廣泛分布于環(huán)境中，極易造成食品污染，是常見(jiàn)的食源性致病菌，能引起嚴(yán)重的感染，甚至威脅人類生命，因此，抑制食品中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)繁殖對(duì)提高食品的安全性至關(guān)重要[11]。為探究不同分子質(zhì)量的ε-PL 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌差異，本文以金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，使用SEM、酶標(biāo)儀等技術(shù)探究不同分子質(zhì)量ε-PL 對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性的影響，采用基于GC-MS 的代謝組學(xué)方法研究菌株代謝途徑及其代謝物，討論ε-PL 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的作用模式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ε-PL 產(chǎn)品（純度≥99%），浙江銀象生物技術(shù)有限公司；供試菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ACCC01331，由天津科技大學(xué)生化工程研究室提供；PUM 緩沖液；磷酸鹽緩沖液【PBS 緩沖液；胞內(nèi)小分子代謝物提取液：甲醇∶水=1∶1（V/V）；內(nèi)標(biāo)溶液：1.5 g/L 氘標(biāo)記丁二酸（Succinic acid，d4）】。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2401 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本SHIMADZU 公司；SU-1510 掃描式電子顯微鏡，日本Hitachi 公司；FA2004 型光電分析天平，上海精科；MULTISKAN MK3 酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo 公司；7890A-5795C GC/MS，美國(guó)Agilent Technologies公司；核磁共振儀Inova-500MHz，美國(guó)Varian 公司。

1.3 方法

1.3.1 不同分子質(zhì)量ε-PL 的制備 稱取10 g ε-PL 產(chǎn)品溶于1 L 超純水中，并用0.45 μm 濾膜過(guò)濾。使用SY-MU2050 切向流超濾系統(tǒng)（超濾膜的截留分子質(zhì)量為1 ku 和3 ku） 將濾液分離為<1 ku，1～3 ku，>3 ku 的3 個(gè)組分，再將這3 個(gè)組分倒入試驗(yàn)用膜分離裝置（截留分子質(zhì)量為400～600 u）進(jìn)行除鹽濃縮。最后通過(guò)冷凍干燥制得不同分子質(zhì)量的ε-PL，并使用核磁共振儀測(cè)定各組分的平均分子質(zhì)量[10]。

1.3.2 不同分子質(zhì)量ε-PL 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用

1.3.2.1 細(xì)胞存活率的測(cè)定 取一環(huán)金黃色葡萄球菌至100 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)12 h 作為種子液。將種子液加入到100 mL LB培養(yǎng)基中，使其OD600nm=0.02，37 ℃培養(yǎng)至OD600nm=0.2 時(shí)，分別加入ε-PL 產(chǎn)品和不同分子質(zhì)量的ε-PL，分別在2，4 h 取樣進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，對(duì)照組不加ε-PL，3 次平行計(jì)算金黃色葡萄球菌細(xì)胞存活率，按公式（1）計(jì)算。

1.3.2.2 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 用LB 液體培養(yǎng)基配制ε-PL 溶液，使其終質(zhì)量濃度分別為2 000，1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.5 μg/mL。挑取一環(huán)金黃色葡萄球菌接種于100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下活化后劃線培養(yǎng)；挑取單菌落使其重懸浮于LB 液體培養(yǎng)基中，調(diào)整菌懸液OD600nm值至0.4，在96 孔板的每個(gè)孔中分別加入100 μL 的ε-PL 溶液和等體積的菌懸液，37 ℃培養(yǎng)24 h 后測(cè)定OD600nm值，以確定不同分子質(zhì)量ε-PL 和ε-PL 產(chǎn)品的最小抑菌濃度。

1.3.2.3 抑菌曲線的測(cè)定 金黃色葡萄球菌種子液同1.3.2.1 節(jié)，加入到100 mL LB 培養(yǎng)基中，使其OD600nm=0.02，37 ℃培養(yǎng)至OD600nm=0.2 時(shí)，加入ε-PL 50 mg，使ε-PL 終質(zhì)量濃度為500 μg/mL，對(duì)照組不加ε-PL。繼續(xù)培養(yǎng)10 h，每隔1 h 取樣測(cè)OD600nm值，平行3 次并繪制抑菌曲線。

1.3.2.4 細(xì)胞膜完整性的測(cè)定 基于碘化丙啶（Propidium iodide，PI）的原理，參考Veerman 等[12]的方法，測(cè)定PI 熒光強(qiáng)度來(lái)確定不同分子質(zhì)量ε-PL 對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜穿透活性的影響。細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.3.2.2 節(jié)，處理時(shí)間為2 h 和4 h。

1.3.2.5 細(xì)胞表面疏水性的測(cè)定 采用微生物黏著碳?xì)浠衔锓ǎ∕ATH）測(cè)定金黃色葡萄球菌細(xì)胞的表面疏水性[13]，取100 mL 金黃色葡萄球菌種子液（同1.3.2.1 節(jié)）4 000 r/min 離心5 min 收集菌體，使用PUM 緩沖液洗滌3 次后懸浮于10 mL PUM 緩沖液中，調(diào)整菌懸液濃度至OD600nm=0.5±0.01。取3 mL 調(diào)整濃度后的菌懸液，試驗(yàn)組分別取3 mL 質(zhì)量濃度為500，1 000，1 500 μg/mL 的ε-PL 溶液，對(duì)照組加入3 mL PUM 緩沖液。37 ℃水浴，分別在2 h 和4 h 取3 mL 菌液，加入400 μL 十六烷，混勻后靜置15 min，取下層水相測(cè)定OD600nm值，計(jì)算方法見(jiàn)公式（2）。

1.3.2.6 細(xì)胞壁表面結(jié)構(gòu)變化的測(cè)定 金黃色葡萄球菌培養(yǎng)方法同1.3.2.1 節(jié)，試驗(yàn)組加入ε-PL，對(duì)照組不加ε-PL，于2 h 后取樣，4 000 r/min 離心10 min，采用PBS 緩沖液清洗細(xì)胞并收集菌體，真空冷凍干燥后壓片進(jìn)行傅里葉紅外光譜掃描測(cè)定。

同時(shí)，要求學(xué)生能將創(chuàng)新性思維更好地融入設(shè)計(jì)過(guò)程中去，這對(duì)傳統(tǒng)的程序性視覺(jué)傳達(dá)設(shè)計(jì)教學(xué)方法提出了挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)視覺(jué)傳達(dá)設(shè)計(jì)教學(xué)方法不再適應(yīng)新的教學(xué)要求。

1.3.2.7 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的測(cè)定 收集經(jīng)過(guò)2 h 和4 h 培養(yǎng)的空白對(duì)照組、H2O2（2.5 mmol/L）陽(yáng)性對(duì)照組和經(jīng)不同分子質(zhì)量ε-PL 處理的細(xì)胞，用PBS 緩沖液清洗3 次并重懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度至OD600nm值為0.3。向上述樣品中加入等體積5 μg/mL DHR123 染色，30 ℃孵育30 min 后用PBS 清洗細(xì)胞3 次并重懸浮，通過(guò)多功能微孔酶標(biāo)儀測(cè)定熒光，λex=488 nm，λem=525 nm。

1.3.2.8 細(xì)胞形態(tài)觀察 參考Shimada 等[14]的方法，用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察采用不同分子質(zhì)量ε-PL 處理2 h 后的金黃色葡萄球菌細(xì)胞。

1.3.3 代謝組學(xué)分析

1.3.3.1 胞內(nèi)代謝物的檢測(cè)分析 參考Hanna 等[15]的方法提取金黃色葡萄球菌胞內(nèi)代謝物，分別收集未經(jīng)處理、ε-PL 產(chǎn)品處理、不同分子質(zhì)量ε-PL處理以及無(wú)水乙醇（添加體積分?jǐn)?shù)為10%）處理的金黃色葡萄球菌細(xì)胞。每個(gè)樣品進(jìn)行6 次生物學(xué)重復(fù)。在GC-MS 分析前，參考Ding 等[16]的方法對(duì)樣品進(jìn)行衍生化操作。

用Agilent HP-5 色譜柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）分離樣品。將衍生樣品（1 μL）注入進(jìn)樣口，進(jìn)樣口溫度為280 ℃。升溫程序：初始溫度70 ℃保持2 min，以5 ℃/min 程序升溫至290 ℃保持5 min；柱后分流比1∶10；載氣為高純氦氣，恒定流量1 mL/min。電離方式為電子轟擊電離EI＋；離子源溫度250 ℃；電子轟擊能量70 eV，離子電流40 μA；掃描質(zhì)量范圍50～800 m/z。

1.3.3.2 定性和定量分析 定性分析：采用Mass Hunter Qualification 軟件（version B06SP1）分析質(zhì)譜峰；定量分析：使用SIMCA 軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘分析（PLS），并用利用HCE（3.5 USA）軟件進(jìn)行層次聚類分析（HCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子質(zhì)量ε-PL 的制備以及聚合度的確認(rèn)

通過(guò)對(duì)分離出的3 個(gè)組分進(jìn)行1H NMR 表征，得出ε-PL 鏈內(nèi)的α-H（δ'αH）、ε-H（δ'εH）、C端的δ''αH 和N 端的δ''εH 發(fā)生了化學(xué)位移。1H NMR 的面積與質(zhì)子數(shù)呈正相關(guān)，由 于δ'αH 和δ'αH（δεH 和δ'εH）的化學(xué)位移不同，從而獲得不同的峰面積AαH和A'αH（AεH和A'εH）。AαH/A'αH（或AεH/A'εH） 表示內(nèi)部α-H 的重復(fù)單元數(shù)，AαH/A'αH+1（或AεH/A'εH+1）可以視為平均聚合度（）。因此，通過(guò)該方法可以估計(jì)不同成分的ε-PL 的數(shù)均分子質(zhì)量。從表1可以看出，3 個(gè)組分ε-PL 的數(shù)均分子質(zhì)量分別為1 027.44，1 967.77，2 836.39 u，樣品如圖1所示。

圖1 不同分子質(zhì)量ε-PL 樣品Fig.1 ε-PL with different molecular weights

表1 不同組分ε-PL 的平均聚合度及數(shù)均分子質(zhì)量以及對(duì)應(yīng)鹽酸鹽的數(shù)均分子質(zhì)量Table 1 ，n and ns of different fractions of ε-PL

表1 不同組分ε-PL 的平均聚合度及數(shù)均分子質(zhì)量以及對(duì)應(yīng)鹽酸鹽的數(shù)均分子質(zhì)量Table 1 ，n and ns of different fractions of ε-PL

注：a.小于1 ku；b.1～3 ku；c.大于3 ku。

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2.2 不同分子質(zhì)量ε-PL 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用

由圖2a 可以得出，ε-PL 產(chǎn)品和不同分子質(zhì)量ε-PL 均表現(xiàn)出對(duì)金黃色葡萄球菌的細(xì)胞存活率有影響，并且隨著分子質(zhì)量的增大，細(xì)胞存活率顯著下降；圖2b 為不同分子質(zhì)量ε-PL（<1 ku，1～3 ku 和>3 ku） 和ε-PL 產(chǎn)品對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度結(jié)果，<1 ku 組分質(zhì)量濃度達(dá)到1 000 μg/mL 時(shí)，抑菌作用明顯，1～3 ku 和>3 ku 以及ε-PL 產(chǎn)品質(zhì)量濃度達(dá)到250 μg/mL 時(shí)，抑菌作用明顯，且>3 ku 組分的抑制作用強(qiáng)于1～3 ku 組分和ε-PL 產(chǎn)品。由此表明ε-PL 的抑菌活性與分子質(zhì)量密切相關(guān)，且分子質(zhì)量大的組分（>3 ku）對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性高于分子質(zhì)量小的組分（<1 ku，1～3 ku）以及ε-PL 產(chǎn)品，這與Shima 等[17]的試驗(yàn)結(jié)果相似。從圖2c 的抑菌曲線得出不同分子質(zhì)量ε-PL 和產(chǎn)品均對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，且抑制程度不同。<1 ku 組與對(duì)照組菌體生長(zhǎng)情況相似，1～3 ku、>3 ku 和產(chǎn)品組對(duì)菌體生長(zhǎng)抑制較為明顯，其中>3 ku 組尤為明顯。

圖2 不同分子質(zhì)量ε-PL 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用Fig.2 Antibacterial effect of ε-PL with different molecular weights on S.aureus

2.3 不同分子質(zhì)量ε-PL 對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面性質(zhì)及次級(jí)損傷的影響差異

不同分子質(zhì)量ε-PL 對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面疏水性的影響如圖3a 所示，1～3 ku 和>3 ku ε-PL 處理組使金黃色葡萄球菌的表面疏水性明顯上升，作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞表面疏水性的影響較小。根據(jù)洪軍等[18]的研究，推測(cè)由于ε-PL 帶正電荷，與帶負(fù)電荷的磷壁酸接觸后，可能使磷壁酸結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞表面疏水性上升。由圖3b 可知，不同分子質(zhì)量ε-PL 作用于金黃色葡萄球菌2 h 后，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)ε-PL 處理的細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。作用4 h 后，<1 ku 組和產(chǎn)品組細(xì)胞熒光強(qiáng)度幾乎不變，1～3 ku、>3 ku 組及對(duì)照組則略有上升。因PI 染料不能進(jìn)入完整的活細(xì)胞內(nèi)，只能穿過(guò)破損的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而與胞內(nèi)的DNA 形成復(fù)合物。熒光強(qiáng)度增強(qiáng)說(shuō)明金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜破損，使得PI 進(jìn)入細(xì)胞與DNA 結(jié)合。由此說(shuō)明1～3 ku 和>3 ku 組對(duì)細(xì)胞膜影響最大，產(chǎn)品次之，<1 ku 組影響最小。圖3c 中，通過(guò)DHR123 檢測(cè)了金黃色葡萄球菌細(xì)胞胞內(nèi)ROS 含量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)不同分子質(zhì)量ε-PL 作用4 h后，在高分子質(zhì)量（1～3 ku 和>3 ku）以及產(chǎn)品ε-PL 處理組中ROS 顯著積累，熒光強(qiáng)度值分別顯著增強(qiáng)1.86 倍、2.75 倍和2.01 倍，低分子質(zhì)量（<1 ku）處理組則增強(qiáng)了1.38 倍，與陽(yáng)性對(duì)照組處理組結(jié)果相似（H2O2處理組增強(qiáng)1.34 倍）。微生物的FTIR 光譜通常分為5 個(gè)區(qū)域[19]，從紅外光譜圖3d可以看出，對(duì)照組的光譜在1 200～900 cm-1位移處出現(xiàn)了細(xì)胞壁多糖的特征信號(hào)峰。與對(duì)照組相比，1～3 ku、>3 ku ε-PL 組以及ε-PL 產(chǎn)品組在作用2 h 后，1 200～900 cm-1位移處峰強(qiáng)度明顯減弱，<1 ku ε-PL 組也出現(xiàn)了一定程度的減弱。

圖3 不同分子質(zhì)量ε-PL 對(duì)金黃色葡萄球菌的細(xì)胞表面性質(zhì)及次級(jí)損傷的影響差異Fig.3 Effects of ε-PL on cell surface properties and secondary damage of S.aureus with different molecular weights

2.4 不同分子質(zhì)量ε-PL 對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面形態(tài)的影響

使用SEM 觀察不同分子質(zhì)量ε-PL 和ε-PL產(chǎn)品對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)的影響。如圖4所示，經(jīng)ε-PL 處理過(guò)的和未經(jīng)ε-PL 處理過(guò)的金黃色葡萄球菌在細(xì)胞大小上沒(méi)有明顯變化。經(jīng)<1 ku ε-PL 處理后，細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有發(fā)生明顯變化，某些細(xì)胞的細(xì)胞膜表面有輕微的凹陷（圖4c）。經(jīng)1～3 ku、>3 ku ε-PL 和ε-PL 產(chǎn)品處理后與對(duì)照組相比，細(xì)胞形態(tài)皺縮且表面變得粗糙，出現(xiàn)明顯的凹陷和微小孔洞（圖4b，4d，4e）。由此可以得出高分子質(zhì)量（1～3 ku，>3 ku）ε-PL 的抑菌作用機(jī)制與膜損傷機(jī)制相似，在Shima 等[17]和Hyldgaard 等[20]對(duì)ε-PL 作用機(jī)制的報(bào)道中也有類似結(jié)果。因此，可以推測(cè)出高分子質(zhì)量（1～3 ku，>3 ku）ε-PL 的作用機(jī)制是通過(guò)與磷壁酸的靜電作用吸附到細(xì)胞表面與細(xì)胞壁接觸，破壞肽聚糖層結(jié)構(gòu)，再穿過(guò)肽聚糖層與細(xì)胞膜接觸后，破壞細(xì)胞膜的完整性。

圖4 掃描電鏡觀察不同分子質(zhì)量ε-PL 對(duì)金黃色葡萄球菌表面形態(tài)的影響（處理時(shí)間2 h）Fig.4 Scanning electron microscope to observe the effect of different molecular weight ε-PL on surface morphology of S.aureus（treat for 2 hours）

2.5 胞內(nèi)代謝

采用GC-MS 對(duì)不同分子質(zhì)量ε-PL 作用后金黃色葡萄球菌細(xì)胞的代謝進(jìn)行測(cè)定，對(duì)質(zhì)譜圖分析得到共59 種代謝產(chǎn)物，通過(guò)非監(jiān)督模式識(shí)別方法-PCA 分析法對(duì)多元數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。PCA 分析法是采用線性投影將原來(lái)的多個(gè)變量空間轉(zhuǎn)換成一組新正交變量的統(tǒng)計(jì)分析方法，其主要應(yīng)用于高維數(shù)據(jù)空間降維，從而降低問(wèn)題的復(fù)雜性[21]。從圖5可看出，處理時(shí)間為2 h 時(shí)，1～3 ku 和>3 ku ε-PL 以及無(wú)水乙醇處理組不好區(qū)分，與其它3 組有明顯不同的聚類效果；處理時(shí)間為4 h 時(shí)，>3 ku ε-PL 和乙醇處理組聚為一類，1～3 ku ε-PL 和產(chǎn)品處理組聚為一類，<1 ku ε-PL 和空白對(duì)照組各為一類。

圖5 對(duì)照組與不同分子質(zhì)量ε-PL 處理組主成分分析得分圖Fig.5 PCA scores plot for control group and ε-PL treated groups

為了進(jìn)一步驗(yàn)證不同分子質(zhì)量ε-PL 對(duì)金黃色葡萄球菌胞內(nèi)代謝的影響，在PCA 分析的基礎(chǔ)上，采用PLS 分析代謝物含量數(shù)據(jù)。圖6a、6c 分別為偏最小二乘分析第一主成分和第二主成分得分圖，顯示了處理組樣本與空白對(duì)照組的聚類結(jié)果，與PCA 分析結(jié)果相一致，表明不同分子質(zhì)量ε-PL 處理可能引起金黃色葡萄球菌胞內(nèi)代謝的系統(tǒng)性改變。

圖6 偏最小二乘分析得分圖與載荷圖Fig.6 Score plot and loading plot generated by PLS

如圖7所示，將檢測(cè)到的代謝物變化映射在金黃色葡萄球菌代謝途徑網(wǎng)絡(luò)中。結(jié)果顯示，ε-PL和乙醇能促使胞內(nèi)葡萄糖積累，<1 ku ε-PL 組中金黃色葡萄球菌胞內(nèi)葡萄糖積累量遠(yuǎn)小于其它組，>3 ku ε-PL 組和乙醇組葡萄糖積累量最高，1～3 ku ε-PL 和ε-PL 產(chǎn)品組次之。表明糖酵解途徑受到不同程度抑制，細(xì)胞利用碳源能力下降，從而表現(xiàn)出經(jīng)不同分子質(zhì)量ε-PL 處理后生長(zhǎng)狀況被不同程度抑制。

圖7 不同分子質(zhì)量ε-PL 下金黃色葡萄球菌的中心碳代謝變化情況Fig.7 A model of the central carbon metabolic variations under different molecular weights of ε-PL

在TCA 循環(huán)中，高分子質(zhì)量（1～3 ku，>3 ku）ε-PL、ε-PL 產(chǎn)品和乙醇使檸檬酸的含量分別在2 h 和4 h 時(shí)顯著積累，<1 ku ε-PL 組沒(méi)有顯著累積；TCA 的中間代謝物琥珀酸和延胡索酸的含量在<1 ku ε-PL 組中，均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；而高分子質(zhì)量（1～3 ku，>3 ku）ε-PL、ε-PL 產(chǎn)品和乙醇組中沒(méi)有此現(xiàn)象。表明細(xì)胞內(nèi)TCA 循環(huán)受到影響，且不同分子質(zhì)量ε-PL 對(duì)TCA 循環(huán)的影響不同。

糖酵解途徑和TCA 循環(huán)是微生物獲得能量的主要途徑，這2 個(gè)途徑受到抑制會(huì)降低胞內(nèi)ATP 的含量，同時(shí)，TCA 循環(huán)中的許多中間代謝物是合成其它代謝物的原料。TCA 循環(huán)中的檸檬酸可以轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，α-酮戊二酸繼續(xù)參與TCA 循環(huán)，也可用于合成谷氨酸；而谷氨酸和天冬酰胺是微生物中維持碳氮平衡的2 個(gè)重要代謝物，可為細(xì)胞內(nèi)含氮化合物的合成提供氮源[21]。不同處理組中的谷氨酸含量變化有明顯差異，<1 ku ε-PL 組中谷氨酸含量與空白組變化趨勢(shì)相同，1～3 ku、>3 ku ε-PL、ε-PL 產(chǎn)品和乙醇組中谷氨酸含量均下降。表明不同分子質(zhì)量ε-PL 對(duì)TCA 循環(huán)具有不同的作用。

2.6 不同分子質(zhì)量ε-PL 對(duì)金黃色葡萄球菌可能的作用模式

通過(guò)以上不同分子質(zhì)量ε-PL 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用以及代謝分析，由此得出其對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞可能的作用模式：不同分子質(zhì)量的ε-PL 首先通過(guò)靜電引力與金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜表面帶陰離子的物質(zhì)磷壁酸結(jié)合；帶有較少量正電荷、分子質(zhì)量<1 ku 的ε-PL 使細(xì)胞壁肽聚糖層發(fā)生微弱變化，細(xì)胞膜磷脂雙分子層輕微彎曲，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變得疏松，通透性改變，從而使<1 ku ε-PL 進(jìn)入金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)部，對(duì)糖酵解途徑產(chǎn)生輕微抑制作用，金黃色葡萄球菌細(xì)胞啟動(dòng)自我保護(hù)機(jī)制，一些保護(hù)性代謝物含量上升，減弱傷害，并啟動(dòng)自我修復(fù)機(jī)制，維持細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度和滲透壓平衡，使金黃色葡萄球菌細(xì)胞生長(zhǎng)受到輕微抑制；而高分子質(zhì)量（1～3 ku，>3 ku）的ε-PL 作用則在肽聚糖層上形成微小孔洞，借此穿過(guò)肽聚糖層與細(xì)胞膜接觸，磷脂雙分子層彎曲，對(duì)細(xì)胞膜功能產(chǎn)生不同程度的破壞，細(xì)胞膜的損傷能夠誘導(dǎo)其它次級(jí)損傷，干擾胞內(nèi)的初級(jí)代謝途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)中采用不同分子質(zhì)量的ε-PL 作用于金黃色葡萄球菌，結(jié)果表明不同分子質(zhì)量的ε-PL在不同濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用有明顯區(qū)別，分子質(zhì)量<1 ku 的ε-PL 質(zhì)量濃度達(dá)到1 000 μg/mL 時(shí)抑菌作用明顯，1～3 ku 和>3 ku 以及ε-PL 產(chǎn)品質(zhì)量濃度達(dá)到250 μg/mL 時(shí)，抑菌作用明顯。根據(jù)抗菌肽抑菌機(jī)制，推測(cè)較高分子質(zhì)量（1～3 ku，>3 ku）的ε-PL 是通過(guò)與磷壁酸的靜電作用，吸附到細(xì)胞表面，進(jìn)而與細(xì)胞壁接觸，破壞肽聚糖層結(jié)構(gòu)，穿過(guò)肽聚糖層與細(xì)胞膜接觸后，破壞細(xì)胞膜的完整性。同時(shí)通過(guò)代謝組學(xué)分析得到，不同分子質(zhì)量ε-PL 對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞中的糖酵解途徑、TCA 循環(huán)的影響不同，細(xì)胞中的保護(hù)性代謝物含量不同，一些保護(hù)性氨基酸的含量在<1 ku ε-PL 組中有所積累，然而在高分子質(zhì)量（1～3 ku，>3 ku）ε-PL 和ε-PL 產(chǎn)品組中均下降，可能由于高分子質(zhì)量的ε-PL 和ε-PL 產(chǎn)品改變了細(xì)胞膜通透性，造成細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失衡，從而使得自我保護(hù)機(jī)制失效。