茶樹中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因（CsG6PDHs）的克隆與表達(dá)分析

王彥丁，王緩，李娜娜，王璐，郝心愿，王玉春，丁長慶，楊亞軍，王新超*，錢文俊*

茶樹中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因（）的克隆與表達(dá)分析

王彥丁1，王緩1，李娜娜2，王璐2，郝心愿2，王玉春3，丁長慶2，楊亞軍2，王新超2*，錢文俊1*

1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266109；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國家茶樹改良中心/農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008；3. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 杭州 311300

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH，EC1.1.1.49）是戊糖磷酸途徑中的關(guān)鍵限速酶，在植物逆境脅迫響應(yīng)和生長發(fā)育中具有重要作用。然而，目前有關(guān)在茶樹中的研究尚處空白。在茶樹中克隆到3個(gè)基因，分別命名為（MW025829）、（MW025830）、（MW025831）。聚合進(jìn)化樹結(jié)果顯示，CsG6PDH1和CsG6PDH4均為質(zhì)體型蛋白，而CsG6PDH2為胞質(zhì)型蛋白。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在不同組織中均有表達(dá)；低溫或炭疽菌侵染條件下，和均被抑制表達(dá)；冷馴化期間，和在不同品種中均上調(diào)表達(dá)；此外，在茶芽休眠和萌發(fā)過程中均不同程度上調(diào)表達(dá)。以上結(jié)果表明，在茶樹生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用，這為后續(xù)深入研究在茶樹中的功能奠定了理論基礎(chǔ)。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；茶樹；表達(dá)分析；低溫；冷馴化

戊糖磷酸途徑（Pentose phosphate pathway，PPP）是植物體內(nèi)葡萄糖氧化分解代謝的一種重要方式，該途徑能產(chǎn)生供細(xì)胞生物合成所需的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）和供脂肪酸、氨基酸合成所需的中間產(chǎn)物，以及核酸代謝所需的磷酸戊糖[1-3]。而NADPH是細(xì)胞生物合成的必需物質(zhì)，也是抗氧化系統(tǒng)中過氧化氫酶和谷胱甘肽還原酶等抗氧化酶的關(guān)鍵輔助因子[4]。在PPP途徑中，NADPH由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）催化生成。G6PDH作為該催化反應(yīng)中的關(guān)鍵限速酶，控制著PPP途徑的反應(yīng)速率，在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。

近年來，隨著生物技術(shù)手段的不斷發(fā)展和完善，植物中基因的鑒定和功能研究已越來越多。目前，已相繼在馬鈴薯[5]、菠菜[6]、玉米[7]、大豆[8]、擬南芥[9]、水稻[10]和小麥[11]等植物中分離鑒定出多個(gè)基因。已有研究表明，植物中的G6PDH主要分為質(zhì)體型和胞質(zhì)型兩類，二者的區(qū)別在于胞質(zhì)型G6PDH的氨基酸序列比質(zhì)體型G6PDH氨基酸序列缺少一段約60個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，該轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列具有多態(tài)性和組織特異性[12]。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)，G6PDH廣泛參與了植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)過程。病原侵染[13]、鹽[14]、干旱[15]、澇害[16]、低溫[17]等生物或非生物脅迫均可誘導(dǎo)不同植物中G6PDH蛋白活性或基因表達(dá)水平的顯著變化。Wang等[18]對蘆葦愈傷組織進(jìn)行H2O2和鹽脅迫處理后發(fā)現(xiàn)：蘆葦愈傷組織中的G6PDH活性被誘導(dǎo)升高；相反，在鹽脅迫條件下通過添加質(zhì)膜NADPH氧化酶抑制劑則能抑制NaCl誘導(dǎo)的H2O2積累，從而降低蘆葦愈傷組織中的G6PDH活性。低溫處理下楊樹中的胞質(zhì)型G6PDH的活性會(huì)被誘導(dǎo)升高，同時(shí)抗氧化系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性也同樣升高，推測低溫條件下，G6PDH可能參與了楊樹抗氧化防御響應(yīng)系統(tǒng)[17]。另外，植物在遭受病菌侵染后，G6PDH活性被誘導(dǎo)增加，同時(shí)還伴隨著過敏性細(xì)胞死亡和活性氧產(chǎn)生[19]。由此可見，基因在植物抵抗逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用，可能的作用機(jī)制是調(diào)控G6PDH催化產(chǎn)生NADPH，而后者參與植物的抗氧化系統(tǒng)，能清除多余的活性氧（ROS），進(jìn)而保護(hù)植物免受氧化脅迫傷害。

茶樹作為喜溫、喜濕常綠葉用植物，其生長對環(huán)境要求較高，病菌侵染、不適宜的土壤、光照、水分、溫度等環(huán)境脅迫限制茶樹的自然分布，并造成茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)下降?；诖?，通過開展茶樹抗逆響應(yīng)的分子機(jī)制研究，能為茶樹抗性分子育種奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。G6PDH作為植物PPP途徑中的關(guān)鍵調(diào)控酶，其在茶樹中肯定發(fā)揮著重要作用，且課題組前期在對參與茶樹抗性響應(yīng)的蔗糖水解酶（Invertase，INV）功能進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，INV和G6PDH之間存在密切聯(lián)系[20-21]。然而，目前關(guān)于G6PDH在茶樹生長發(fā)育和抗逆響應(yīng)的研究尚未見報(bào)道。為此，本研究結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)手段和現(xiàn)有的茶樹轉(zhuǎn)錄組、基因組數(shù)據(jù)，開展了茶樹中基因的鑒定和克隆工作，同時(shí)，檢測了基因在茶樹不同組織和不同脅迫處理下的表達(dá)，以期篩選出與茶樹生長發(fā)育和抗逆作用相關(guān)的基因，為茶樹抗逆作用機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2年生盆栽龍井43用于分析的組織表達(dá)特異性和對低溫脅迫的響應(yīng)模式；3年生盆栽龍井43進(jìn)行炭疽菌侵染后，分析對生物脅迫的響應(yīng)模式；另外，4個(gè)15年生的不同抗寒茶樹品種（浙農(nóng)113、龍井43、浙農(nóng)12和大面白）用于分析在茶樹冷馴化期間的響應(yīng)模式；最后，取15年生龍井43的休眠芽用于分析茶芽中的低溫響應(yīng)模式。上述所有試驗(yàn)材料均種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所實(shí)驗(yàn)基地內(nèi)。試驗(yàn)試劑主要有RNA提取試劑CTAB、EDTA、LiCl、-巰基乙醇、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析醇；SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real-time）試劑盒、Prime Script RT Reagent Kit、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和rTaq酶等購自TaKaRa公司（北京）；DNA凝膠回收試劑盒（Invitrogen Carlsbad，USA）購自Axygen公司（Silicon valley，USA）。

1.2 試驗(yàn)處理

選取15年樹齡的4個(gè)不同抗寒茶樹品種（浙農(nóng)113、龍井43、浙農(nóng)12和大面白）進(jìn)行冷馴化分析。取樣方法如下：取樣時(shí)間為2016年10月到2017年3月，每半月取一次樣，每次取樣時(shí)間為當(dāng)天上午9：30—10：30；取樣時(shí)，每個(gè)品種隨機(jī)選取10余株長勢基本一致的茶樹，取頂芽下第三至第五片健康成熟葉混合作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后于–80℃保存?zhèn)溆?，?次生物學(xué)重復(fù)。為檢測在茶芽休眠過程中的表達(dá)情況，以田間栽培15年樹齡的龍井43為試材，于2015年秋末到2016年早春每半個(gè)月取1次樣，每次取樣時(shí)間也為當(dāng)天上午9：30—10：30；取樣時(shí)，隨機(jī)選取20余株長勢基本一致的茶樹，采集頂芽和腋芽作1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后于–80℃保存?zhèn)溆茫?次生物學(xué)重復(fù)。參照Yue等[22]的方法分析在茶樹不同組織中的表達(dá)，具體如下：在茶樹開花季（10月），以生長于露天茶園的大小和長勢基本一致的盆栽2年樹齡的龍井43為試材，分別取茶樹的頂芽、幼葉、成熟葉、根、莖、果實(shí)和花等于液氮速凍后–80℃保存?zhèn)溆?，?次生物學(xué)重復(fù)。參照Qian等[21]的方法對茶樹進(jìn)行低溫處理，具體如下：以自然環(huán)境下2年樹齡的盆栽龍井43扦插苗為試材，待茶苗春季長出一芽三葉后移至人工溫室緩苗7?d，然后溫室溫度降至4℃低溫處理8?d，之后將溫室溫度再升至25℃恢復(fù)生長2?d，分別取低溫處理后0～8?d的樣品，分析在低溫處理下的表達(dá)，1個(gè)生物學(xué)重復(fù)包含3盆茶苗，每盆包含3株，取樣后液氮速凍后于–80℃保存?zhèn)溆?，?次生物學(xué)重復(fù)。參照Wang等[23]所述方法進(jìn)行炭疽菌侵染試驗(yàn)，具體如下：以3年樹齡的龍井43茶樹為試材，茶樹在溫室生長1個(gè)月后利用噴壺將炭疽菌噴灑在茶樹葉片表面，分別在接種后0、12、48?h和96?h取頂芽下第三至第五片健康成熟葉混合作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，取樣后液氮速凍后于–80℃保存?zhèn)溆?，?次生物學(xué)重復(fù)。常溫下，溫室中茶樹的培養(yǎng)條件為：14?h光照/10?h黑暗，相對濕度為75%，溫度為(25±0.5)℃。

1.3 茶樹中CsG6PDHs的鑒定和克隆

共采用3種方法查找和鑒定茶樹中的基因。首先，以“Glucose-6-phosphate dehydrogenase”或“G6PDH”為關(guān)鍵詞，在茶樹基因組數(shù)據(jù)庫（TPIA，http://tpia.teaplant.org/index.htmL）檢索。然后，用“Glucose-6-phosphatedehydrogenase”或“G6PDH”作關(guān)鍵詞，在已公布的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中搜索。最后，在Phytozome v12.1數(shù)據(jù)庫（JGI，https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.htmL）檢索擬南芥、水稻、香蕉、葡萄和煙草中的G6PDH核酸序列和蛋白質(zhì)序列，將所得核酸序列和蛋白質(zhì)序列在TPIA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastn和Blastx分析，并用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）比對分析，最終確定G6PDH的同源序列。以龍井43為材料，采用RT-PCR對鑒定獲得的進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增獲得的目標(biāo)條帶進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和測序，具體的試驗(yàn)方法，參照錢文俊等[24]的方法進(jìn)行，略有修改，具體如下：利用高保真酶PrimeSTAR HS DNA polymerase（TaKaRa Da Lian，China）進(jìn)行PCR，50?μL反應(yīng)體系中包含5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+plus）10.0?μL，dNTP Mixture（各2.5?mmol·L-1）4.0?μL，cDNA 2.0?μL，上下游引物各1.0?μL，HS DNA polymerase 0.5?μL，最后用ddH2O補(bǔ)足至50?μL；然后在BIO-RAD型PCR儀上進(jìn)行98℃預(yù)變性2?min；98℃變性10?s，55℃退火30?s，72℃延伸2?min，30個(gè)循環(huán)，最后12℃保存。PCR反應(yīng)后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并將目的片段切膠回收，取2?μL回收產(chǎn)物與平末端載體（TransGen Biotech，北京）連接并轉(zhuǎn)化至（TaKaRa，北京）感受態(tài)中進(jìn)行陽性篩選，最后，挑選陽性單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測序。引物合成和基因測序由上海華津生物有限公司完成。RT-PCR用引物如表1所示。

1.4 茶樹中CsG6PDHs的生物信息學(xué)分析

使用NCBI ORFfinder網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）查找開放閱讀框（ORF）和編碼的氨基酸。使用ProtParam工具（https://web.expasy.org/protparam）預(yù)測蛋白質(zhì)分子量和理論等電點(diǎn)。使用SignalP 3.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0）和TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預(yù)測信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。Plant-mPLoc（http://www.Csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi）、WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）、TargetP 1.1server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/index.php）3個(gè)網(wǎng)站預(yù)測CsG6PDHs的亞細(xì)胞定位。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將茶樹、橡膠樹、毛果楊、蓖麻、擬南芥、玉米、水稻和小麥中已鑒定的G6PDH蛋白進(jìn)行聚合進(jìn)化樹分析。首先，使用ClustX 2.1軟件將這些G6PDHs進(jìn)行聚類，然后利用MEGA 5.0軟件中的鄰接法進(jìn)行1?000次引導(dǎo)序列重復(fù)以構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.6 CsG6PDHs保守結(jié)構(gòu)域分析

用Clustlx 2.0軟件對茶樹中的CsG6PDHs氨基酸進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域比對，比對結(jié)果用Genedoc軟件導(dǎo)出。

1.7 基因結(jié)構(gòu)和順式元件分析

通過GSDS 2.0網(wǎng)站（http://gsds.gao-lab.org）可視化基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。使用PlantCARE軟件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）預(yù)測每個(gè)基因2?000?bp上游啟動(dòng)子序列中與脅迫反應(yīng)有關(guān)的順式元件。

1.8 總RNA提取及cDNA的合成

參照錢文俊等[24]的方法提取樣品中的總RNA。RT-PCR擴(kuò)增用cDNA和表達(dá)分析用cDNA的合成分別參照SuperScript Ⅲ試劑盒和Prime Script RT Reagent試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9 qRT-PCR分析

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)分析

基于1.3章節(jié)中的鑒定方法和測序結(jié)果，共克隆獲得3個(gè)，分別命名為：、和；GenBank登錄號分別為：MW025829、MW025830和MW025831。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)基因的ORF長度為1?782～2?127?bp，編碼593～708個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為59.16～79.13?kDa，理論等電點(diǎn)為6.17～8.51，預(yù)測均為不穩(wěn)定蛋白（表2）。將這3個(gè)基因編碼的氨基酸與已完成測序的舒茶早品種茶樹基因組中對應(yīng)的同源基因氨基酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，CsG6PDH1與同源蛋白XP_028115810.1的氨基酸序列僅有1個(gè)氨基酸不同，一致性達(dá)99%；CsG6PDH2與同源蛋白XP_028056677.1的氨基酸序列完全相同，一致性為100%；CsG6PDH4與同源蛋白XP_028064051.1的氨基酸序列也僅有1個(gè)氨基酸不同，一致性為99%。由此可見，這3個(gè)基因在不同茶樹品種中的氨基酸序列都具有高度保守性。

2.2 信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

SignalP 3.0 Server預(yù)測發(fā)現(xiàn)CsG6PDH1/2/4均不含信號肽，且TMHMM Server v.2.0預(yù)測發(fā)現(xiàn)CsG6PDH1/2/4均不包含跨膜結(jié)構(gòu)域，不屬于跨膜蛋白。

表1 RT-PCR和qRT-PCR用引物表

表2 CsG6PDHs理化性質(zhì)分析

2.3 亞細(xì)胞定位

TargetP1.1預(yù)測顯示CsG6PDH1蛋白可能定位于線粒體，而CsG6PDH2蛋白預(yù)測可能定位于細(xì)胞質(zhì)中，CsG6PDH4蛋白可能定位在葉綠體上。

2.4 茶樹CsG6PDHs進(jìn)化樹構(gòu)建

聚合進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果顯示，CsG6PDH1與AtG6PDH1親緣關(guān)系最近，CsG6PDH4與PtG6PDH親緣關(guān)系最近，而CsG6PDH2與HbG6PDH3親緣關(guān)系最近。另外，我們發(fā)現(xiàn)，CsG6PDH1和CsG6PDH4屬于質(zhì)體型蛋白，其分別被聚類到B類質(zhì)體型和C類質(zhì)體型中，而CsG6PDH2屬于胞質(zhì)型蛋白（圖1）。該結(jié)果與亞細(xì)胞定位結(jié)果基本一致。

2.5 CsG6PDHs保守結(jié)構(gòu)域分析

保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)CsG6PDHs蛋白序列具有較高的相似性，均包含保守的羅斯曼折疊結(jié)構(gòu)（Rossman fold，GXXGXXG/A），還分別包含1個(gè)潛在的底物結(jié)合位點(diǎn)（IDHYLG）和潛在的NADP結(jié)合位點(diǎn)（NEFVIRLQP）（圖2）。

注：構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的G6PDH蛋白質(zhì)序列分別為：茶樹CsG6PDH1～2（XP_028115810.1、XP_028056677.1）和CsG6PDH4（XP_028064051.1）；擬南芥AtG6PDH1～6（Q43727、Q9FY99、Q8L743、Q93ZW0、Q9LK23、Q9FJI5）；橡膠樹HbG6PDH1～4（AIE47266、AIE47267、AIE47268、AIE47269）；水稻OsG6PDH（BAC84352、ABF96582、ABF95637、AAL79959）；毛果楊PtG6PDH（EEE79649、ERP53365、EEE94856、EEF03929）；小麥TaG6PDH（BAA97662）；蓖麻RcG6PDH（EEF47431、EEF32168、EEF50009)）；玉米ZmG6PDH（AFW57831、DAA45780、XP_008658752、ACG39996）

2.6 CsG6PDHs基因結(jié)構(gòu)和順式作用元件分析

在線軟件GSDS 2.0分析發(fā)現(xiàn)基因有10個(gè)外顯子、9個(gè)內(nèi)含子；基因含15個(gè)外顯子、14個(gè)內(nèi)含子；基因包含12個(gè)外顯子、11個(gè)內(nèi)含子（圖3）。

如圖4所示，對起始密碼子上游2?000?bp啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，中包含5個(gè)與環(huán)境脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件（3個(gè)ARE、1個(gè)MBS和1個(gè)TC-rich repeats），中有3個(gè)與環(huán)境脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件（2個(gè)WUN-motif、

注：紅色矩形框中的氨基酸殘基為保守的羅斯曼折疊（Rossman fold，GXXGXXG/A)，綠色框?yàn)闈撛诘牡孜锝Y(jié)合位點(diǎn)（IDHYLG），黃色框?yàn)闈撛诘腘ADP結(jié)合位點(diǎn)（NEFVIRLQP）

圖3 CsG6PDHs基因結(jié)構(gòu)

圖4 CsG6PDHs啟動(dòng)子分析

2.7 茶樹中CsG6PDHs的組織特異性分析

為了解在茶樹不同組織的表達(dá)情況，分別檢測了在茶樹頂芽、幼葉、成熟葉、根、莖、果和花中的表達(dá)情況。結(jié)果如圖5所示，基因在所檢測的不同組織中均有表達(dá)。其中，在成熟果實(shí)中的表達(dá)最低，在第二、三葉和幼果具有較高的表達(dá)；在嫩莖中表達(dá)量最高，在第一葉中表達(dá)量最低，在第二、三葉中也有較低表達(dá)量；在成熟果中表達(dá)量最低，在嫩莖中表達(dá)量最高（圖5）。

2.8 茶樹CsG6PDHs基因的表達(dá)分析

低溫處理下，和表達(dá)受抑制，二者在低溫處理8?d后表達(dá)量最低，其中，受低溫抑制最為明顯。然而，基因的表達(dá)基本不受低溫處理影響。此外，隨著溫度恢復(fù)到正常溫度后，所有的的表達(dá)又恢復(fù)到了正常水平（圖6）。

圖5 CsG6PDHs組織表達(dá)特異性

2.9 茶樹CsG6PDHs在冷馴化條件下的表達(dá)分析

在冷馴化過程中，在4種不同茶樹品種中的表達(dá)趨勢基本一致，從10月14日氣溫降低開始，表達(dá)逐漸降低，在12月16日—翌年1月3日，其表達(dá)量又逐漸升高。

基因冷馴化期間在抗寒性強(qiáng)的浙農(nóng)113和龍井43中的表達(dá)均低于其他2個(gè)品種，其表達(dá)在4個(gè)品種中均呈升高趨勢，直到脫馴化之后，其表達(dá)又逐漸降低。冷馴化期間，在浙農(nóng)113、浙農(nóng)12和大面白中的表達(dá)逐漸升高，直到1月3日之后表達(dá)逐漸降低。不同的是，在龍井43中的表達(dá)與其他3個(gè)品種表現(xiàn)出相反的趨勢（圖7）。

2.10 茶樹CsG6PDHs在休眠芽中的表達(dá)分析

在冬季茶芽休眠過程中，隨著溫度降低在茶芽中的表達(dá)逐漸增加，直到翌年1月16日以后，其表達(dá)又逐漸降低。

注：Re-1/2d：茶樹常溫25℃恢復(fù)生長1天或2天

圖7 CsG6PDHs基因在冷馴化下的表達(dá)分析

在冬季茶芽休眠過程中表達(dá)規(guī)律不明顯，但我們發(fā)現(xiàn)，除了少數(shù)幾個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)外，其他取樣點(diǎn)的表達(dá)均高于9月30日時(shí)的表達(dá)。在9月30—11月17日（類休眠階段）表達(dá)逐漸升高，隨后表達(dá)逐漸降低，直到3月14日以后其表達(dá)又逐漸升高。此外，所有的表達(dá)隨著氣溫升高（3月1日后，茶芽膨大期），三者的表達(dá)呈先急劇降低又逐漸升高的趨勢（圖8）。

2.11 茶樹在炭疽菌侵染條件下的表達(dá)分析

為探究對生物脅迫的響應(yīng)情況，本研究檢測了炭疽菌侵染條件下茶樹的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著炭疽菌侵染時(shí)間的增加，的表達(dá)逐漸降低且在病菌侵染4?d后表達(dá)為最低（圖9），說明茶樹炭疽菌侵染會(huì)抑制的表達(dá)。

3 討論

基因廣泛存在于各類高等植物的細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體中，在植物應(yīng)對各種環(huán)境脅迫和調(diào)節(jié)生長發(fā)育方面具有重要作用。目前，已在多種植物中鑒定獲得多個(gè)基因。例如，擬南芥中共有6個(gè)基因[9]，桉樹中存在6個(gè)基因[26]，而大豆中則有9個(gè)基因[8]等。本研究從茶樹中共克隆獲得3個(gè)基因。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，CsG6PDHs氨基酸序列中均存在保守的羅斯曼折疊（Rossman fold，GXXGXXG/A)，潛在的底物結(jié)合位點(diǎn)（IDHYLG）和NADP結(jié)合位點(diǎn)（NEFVIRLQP），這一結(jié)果與擬南芥[9]和橡膠樹[27]中報(bào)道的G6PDHs研究結(jié)果一致，表明它們是典型的G6PDH蛋白。另外，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，這3個(gè)CsG6PDHs被聚類到3個(gè)不同的亞群中，其中CsG6PDH2與已報(bào)道的胞質(zhì)型異構(gòu)體聚為一類，而CsG6PDH1和CsG6PDH4則分別與已報(bào)到的B類和C類質(zhì)體型異構(gòu)體聚為一類，且這一聚類結(jié)果和亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果相似。有研究表明，胞質(zhì)型G6PDH比質(zhì)體型G6PDH更穩(wěn)定，氧化脅迫、磷酸化和光照等會(huì)影響質(zhì)體型G6PDH的活性，而這些脅迫對胞質(zhì)型G6PDH的活性影響不大[28]?；诖?，我們推測茶樹中質(zhì)體型CsG6PDH1和CsG6PDH4蛋白活性可能受逆境脅迫影響較大。

圖8 茶芽休眠過程中CsG6PDHs的表達(dá)情況

圖9 炭疽菌侵染條件下CsG6PDHs的表達(dá)分析

目前研究表明，不同類型的G6PDHs異構(gòu)體在植物的不同組織中發(fā)揮作用。其中，胞質(zhì)型G6PDHs廣泛存在于所有植物組織中，尤其是在庫組織中具有較高的表達(dá)豐度，而質(zhì)體型G6PDHs主要在源組織中表達(dá)豐度較高，而在庫組織中表達(dá)豐度較低[29]。例如，臘梅中胞質(zhì)型基因在莖和葉中表達(dá)量較少，而在花和根中的表達(dá)較高[30]；苧麻中質(zhì)體型基因在葉中表達(dá)量最高，在根中表達(dá)量最低[31]。相似的，本研究發(fā)現(xiàn)茶樹中2個(gè)質(zhì)體型基因在庫組織（成熟果）中的表達(dá)均為最低，而在源組織（葉、莖）中的表達(dá)均較高；另外，胞質(zhì)型基因在源組織（葉）中的表達(dá)為最低，而在庫組織（幼莖、芽、根）中的表達(dá)較高，表明不同類型的基因在茶樹源庫代謝過程中各自發(fā)揮著重要作用。

植物體中G6PDH的活性受生物和非生物脅迫影響。例如，在病原菌侵染后，煙草葉片中的G6PDH活性顯著增加[13]；相似的，甜楊在低溫脅迫下，G6PDH活性同樣被誘導(dǎo)增加[32]。然而，本研究通過對茶樹進(jìn)行短時(shí)低溫和炭疽菌侵染處理后發(fā)現(xiàn)，//均隨處理時(shí)間延長表達(dá)逐漸降低，這一結(jié)果與上述研究結(jié)果相反。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是多方面的?，F(xiàn)有研究表明，G6PDH參與植物逆境脅迫的核心機(jī)制主要是其通過控制PPP途徑第一步不可逆氧化反應(yīng)生成的NADPH產(chǎn)物來發(fā)揮作用[4]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)NADPH的合成除了來源于PPP途徑外，還可通過糖酵解途徑合成[33]。此外，雖然G6PDH在提供NADPH過程中起重要作用，但胞質(zhì)型G6PDH沒有變構(gòu)調(diào)節(jié)的性質(zhì)，其會(huì)受氧化產(chǎn)物NADPH的抑制，所以NADPH/NADP+的比率是決定胞質(zhì)中G6PDH活性的關(guān)鍵；另外，質(zhì)體型G6PDH除了受到自身產(chǎn)生的NADPH的反饋抑制之外，光合作用中NADP+還原生成的NADPH也會(huì)抑制質(zhì)體型G6PDH的催化過程；再者，G6PDH的活性還受到硫氧還原蛋白/鐵氧還原蛋白系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[34]。因此，我們認(rèn)為短時(shí)逆境脅迫下，茶樹中NADPH可能主要是由糖酵解途徑產(chǎn)生，產(chǎn)生的NADPH可能會(huì)反饋抑制茶樹PPP途徑中基因的表達(dá)，從而降低了G6PDH的活性以促進(jìn)茶樹體內(nèi)NADPH的平衡。

冷馴化期間（12月16日—翌年1月3日），茶樹中胞質(zhì)型基因和質(zhì)體型基因被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，說明這兩個(gè)基因在茶樹冷馴化誘導(dǎo)抗寒中發(fā)揮著重要作用。目前研究表明，NADPH含量的提高一方面可以使以NADPH作為還原劑的抗氧化酶如SOD、POD等活性增強(qiáng)，從而調(diào)節(jié)植物細(xì)胞膜透性并防止細(xì)胞膜的損傷，增強(qiáng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[35]；另一方面，產(chǎn)生的NADPH可以參與合成大量ATP，從而提高植物中ATP酶的活性，使植物保持高能狀態(tài)以及時(shí)利用ATP合成與植物發(fā)育有關(guān)的RNA、蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì)[36]。因此，我們推測，低溫冷馴化條件下，基因的上調(diào)表達(dá)能促進(jìn)茶樹中G6PDH活性升高，以催化葡萄糖-6-磷酸酯化生成更多的NADPH，NADPH含量的提高又會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)茶樹中抗氧化酶、ATP酶等的活性，最終提高茶樹抗寒能力。

開展茶樹芽的休眠機(jī)制研究對茶樹抗寒品種選育和茶葉品質(zhì)形成機(jī)理研究具有重要的理論意義。近幾年，茶芽休眠的調(diào)節(jié)機(jī)制研究已取得了一定的進(jìn)展。例如，Hao等[37]利用RNA-Seq技術(shù)全面解析了茶樹芽在類休眠、內(nèi)休眠、生態(tài)休眠和茶芽膨大期的表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有16?125個(gè)基因在這幾個(gè)階段中差異表達(dá)，這些基因主要涉及到表觀遺傳調(diào)控、植物激素調(diào)控和胼胝質(zhì)相關(guān)細(xì)胞級聯(lián)調(diào)控三大通路；同時(shí)，還富集到很多、-、-、-、-、-、-、-、-、-、-、-、-、-和-相關(guān)基因。相似的，本研究檢測了//在茶芽不同階段的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，質(zhì)體型基因在茶芽休眠過程中表達(dá)逐漸上調(diào)，而質(zhì)體型基因在類休眠階段（9月30日—12月2日）表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果表明，質(zhì)體型基因和在茶芽休眠階段參與了茶芽的休眠調(diào)控，但具體的調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。另外，我們發(fā)現(xiàn)在茶芽膨大期（3月14日—4月13日），//均表現(xiàn)出急劇上調(diào)的表達(dá)趨勢。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，G6PDH酶活性的升高可打破種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)[38]。因此，我們推測，茶芽膨大期//上調(diào)表達(dá)提高了G6PDH的活性，從而有助于茶芽打破休眠，并加快新梢的萌發(fā)。

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Identification and Expression Analysis of Glucose-6-hosphate Dehydrogenase Gene () in

WANG Yanding1, WANG Huan1, LI Nana2, WANG Lu2, HAO Xinyuan2, WANG Yuchun3, DING Changqing2, YANG Yajun2, WANG Xinchao2*, QIAN Wenjun1*

1. College of Horticulture, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2. Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Center for Tea Improvement/Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China; 3. College of Agriculture and Food Science, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, China

As a key rate-limiting enzyme in pentose phosphate pathway, glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH, EC1.1.1.49) plays an important role in plant growth and development, and also in responding to environmentalstresses. However, the function of G6PDH in tea plants has not yet been reported. In our study, 3genes were cloned from tea plant, named as(MW025829),(MW025830) and(MW025831), respectively. Phylogenetic analysis shows that CsG6PDH1 and CsG6PDH4 belong to plastid protein, while CsG6PDH2 belongs to cytoplasmic protein. Quantitative analysis shows that the expressions ofvaried in different tissues. Under cold orinfection treatments, the time course expressions of bothandwere gradually reduced. Besides, bothandwere induced by cold acclimation in different tea cultivars. In addition, the expressions ofwere up-regulated during bud dormancy and flush periods. Consequently, our results implicate thatare widely participated in tea plant growth and development, and also involved in responding to abiotic and biotic stresses. This study provided a theoretical basis for in-depth study of the function of Csin tea plants.

glucose-6-phosphate dehydrogenase,, expression analysis, cold, cold acclimation

S571.1；Q946.84+1；Q939.1

A

1000-369X(2021)04-497-14

2020-08-10

2020-09-23

國家自然科學(xué)基金（31800588）、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)科研啟動(dòng)基金（1118025）、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目

王彥丁，女，本科，主要從事茶樹遺傳育種研究。*通信作者：xcw575@tricaas.com；qau-WenjunQian@qau.edu.cn

（責(zé)任編輯：趙鋒）