龍亞芹，羅梓文，王雪松，龍麗雪，玉香甩，李金龍，曲浩，汪云剛，陳林波

茶谷蛾成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組及嗅覺相關(guān)基因分析

龍亞芹，羅梓文，王雪松，龍麗雪，玉香甩，李金龍，曲浩，汪云剛，陳林波*

云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/云南省茶樹種質(zhì)資源創(chuàng)新與配套栽培技術(shù)工程研究中心/云南省茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 勐海 666201

為篩選茶谷蛾嗅覺相關(guān)基因，采用IlluminaHiSeq 4000高通量測序平臺分別對茶谷蛾雌雄成蟲觸角進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)分析，共獲得茶谷蛾觸角轉(zhuǎn)錄組37?708條unigenes。通過同源性比對，在NR數(shù)據(jù)庫成功注釋16?027條unigenes；有11?701條unigenes得到GO注釋，根據(jù)其功能可分為細(xì)胞組分、分子功能和生物過程三大類40亞類；有6?047個unigenes得到KOG注釋，按照功能分為25類；根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫，有12?009條unigenes注釋到283個通路。根據(jù)注釋信息，挖掘到238個候選嗅覺相關(guān)基因，包括108個氣味結(jié)合蛋白基因，55個氣味/嗅覺受體基因，26個味覺受體基因、25個離子型受體基因、11個化學(xué)感受蛋白基因、4個感覺神經(jīng)元膜蛋白基因、4個感官知覺基因、4個化學(xué)感受受體基因和1個氣味降解酶基因。通過基因差異表達(dá)分析，篩選出12個氣味結(jié)合蛋白基因、9個氣味/嗅覺受體基因、4個信息素結(jié)合蛋白、3個味覺受體基因、1個化學(xué)感受蛋白基因和1個離子型受體蛋白基因。本研究獲得了茶谷蛾觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并鑒定出候選嗅覺相關(guān)基因，為進(jìn)一步研究茶谷蛾的基因功能及嗅覺感受機(jī)制奠定分子基礎(chǔ)。

茶谷蛾；觸角轉(zhuǎn)錄組；高通量測序；基因注釋；嗅覺相關(guān)基因

茶谷蛾（），又名茶灰木蛾，鱗翅目谷蛾科，是茶樹重要的食葉害蟲之一。在我國臺灣、海南、廣東、福建曾有茶谷蛾發(fā)生的記錄，在印度等地一度為茶樹主要害蟲[1-2]。茶谷蛾幼蟲吐絲綴葉成苞，隱藏于苞內(nèi)咀食成熟葉片葉肉，暴食期甚至能將成熟葉、嫩枝樹皮一并吃光，對產(chǎn)量和樹勢造成巨大影響。近幾年茶谷蛾在云南部分茶區(qū)發(fā)生極其嚴(yán)重[3]。茶谷蛾幼蟲隱蔽性強(qiáng)，隱匿在葉苞內(nèi)取食，受驚嚇或干擾后，立即落入地面或其他隱蔽場所，除人工采蟲外，目前缺乏有效的防控措施，迫切需要尋求新的防治方法。

嗅覺是昆蟲寄主定位、取食、求偶、交配以及尋找產(chǎn)卵場所、躲避敵害等各種行為活動的基礎(chǔ)，對其種群生存、繁衍有著重要的作用[4-5]。昆蟲嗅覺系統(tǒng)的主要器官是觸角，觸角上著生有許多的嗅覺感受器且有各種嗅覺蛋白，參與對外界氣味化合物的識別進(jìn)而調(diào)控昆蟲的行為活動[6-7]。研究表明，嗅覺系統(tǒng)中存在許多蛋白，參與完成昆蟲嗅覺識別過程，主要包括氣味結(jié)合蛋白（Odorant binding proteins，OBPs）、嗅覺/氣味受體（Olfactory/odorant receptors，ORs）、化學(xué)感受蛋白（Chemosensory proteins，CSPs）、離子型受體（Ionotropie receptors，IRs）、味覺受體（Gustatoryreceptors，GRs）和昆蟲感覺神經(jīng)元膜蛋白（Sensoryneuron membrane proteins，SNMPs）等。目前在13種鱗翅目昆蟲家族中的35種昆蟲中發(fā)現(xiàn)超過150種OBPs[8]，隨著對其研究的不斷深入，多種昆蟲如光肩星天牛[9]、茶尺蠖[10-11]、蘋果蠹蛾[12]等開展了嗅覺相關(guān)蛋白種類、功能及嗅覺機(jī)制研究。昆蟲的嗅覺相關(guān)蛋白是未來害蟲防治的潛在靶標(biāo)[13-15]。因此，對茶谷蛾嗅覺相關(guān)基因進(jìn)行深入研究，可以揭示茶谷蛾的嗅覺行為反應(yīng)，進(jìn)而為茶谷蛾引誘劑或趨避劑研制提供理論依據(jù)，也可為茶谷蛾的綜合防控提供新思路。

高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展極大地促進(jìn)了昆蟲基因組、轉(zhuǎn)錄組，特別是非模式昆蟲轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面的研究。目前，該技術(shù)被成功地應(yīng)用于多種昆蟲，如大蠟螟[16]、亞洲玉米螟[17]、草地貪夜蛾和斜紋夜蛾[18]、云斑天牛[19]、七星瓢蟲[7]、綠豆象[6]等，篩選出昆蟲中大量與嗅覺相關(guān)的基因，為深入研究嗅覺相關(guān)基因功能奠定了基礎(chǔ)。本研究采用高通量測序技術(shù)對茶谷蛾成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，并通過生物信息學(xué)方法對其基因功能注釋，挖掘嗅覺相關(guān)基因，研究結(jié)果可為今后開展茶谷蛾的行為調(diào)控和生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

茶谷蛾為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所室內(nèi)飼養(yǎng)2代以上成蟲，羽化后選取未交配的雌雄茶谷蛾成蟲各100頭，分別將雌雄蟲觸角剪下，經(jīng)液氮速凍后保存于–80℃超低溫冰箱備用。

1.2 樣品RNA的提取與檢測

使用Trizol法分別提取雌雄茶谷蛾觸角RNA，利用NanoDrop對RNA的純度進(jìn)行檢測，采用Qubit2.0對RNA的濃度進(jìn)行定量，并用Agilent 2100精檢RNA的完整性，以保證樣品RNA的質(zhì)量，轉(zhuǎn)錄組測序分析由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 cDNA文庫構(gòu)建與測序

取檢測合格的RNA樣品，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集測序樣品中的mRNA，隨后加入fragmentation buffer將mRNA進(jìn)行隨機(jī)打斷；以打斷的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物（Random hexamers）合成第一鏈cDNA；隨后用RNaseH降解RNA鏈，并在DNA polymerase I體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈，用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA；純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，用AMPure XP beads篩選250～300?bp左右的cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物獲得文庫。使用Qubit2.0對文庫進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至1.5?ng·μL-1，隨后使用Agilent 2100對文庫的插入片段進(jìn)行檢測，插入片段符合預(yù)期后，利用qRT-PCR對文庫有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫有效濃度高于2?nmol·L-1。庫檢合格后，使用高通量測序平臺IlluminaHiSeq 4000測序。

1.4 轉(zhuǎn)錄本的拼接組裝及完整性評估

對原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別（Base calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列raw reads，進(jìn)行過濾，去除帶接頭的Reads、N（N表示無法確定堿基信息）、低質(zhì)量Reads（質(zhì)量值Qphred≤20的堿基數(shù)占整個Reads的50%以上的Reads），得到clean reads。采用Trinity軟件對clean reads進(jìn)行組裝拼接[20]，獲得高質(zhì)量的茶谷蛾觸角的unigenes庫。

1.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析及嗅覺相關(guān)基因鑒定

將獲得的茶谷蛾unigenes序列與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫（NCBI non-redundant protein sequences，NR），NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫（NCBI non-redundant necleotide sequences，NT），Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫（A manually annotated and reviewed protein sequence database），基因本體論（Gene ontology，GO），京都基因與基因組（KEGG ortholog database，KO），蛋白家族（Protein family，Pfam）和直系同源基因簇（Clusters of orthologous groups of proteins，KOG/COG）七大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得相應(yīng)的unigenes注釋信息，再利用諾禾致源售后服務(wù)NovoMagic平臺，通過關(guān)鍵詞篩選嗅覺相關(guān)基因。

1.6 差異表達(dá)基因分析

為了比較嗅覺相關(guān)基因在雌、雄茶谷蛾成蟲觸角之間表達(dá)量的差異，利用RSEM軟件對bowtie的比對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用FPKM值對基因表達(dá)量進(jìn)行評估[21]，對無生物學(xué)重復(fù)，選用edgeR軟件來進(jìn)行基因表達(dá)差異顯著性分析[22]，差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2(FoldChange)|>1或者q value<0.005。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶谷蛾觸角轉(zhuǎn)錄組測序統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)組裝

利用Illumina測序平臺對茶谷蛾雌、雄觸角2個樣本轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，測序統(tǒng)計(jì)如表1所示，從測序得到reads考察其堿基質(zhì)量值可以看出，雌、雄茶谷蛾觸角樣品堿基質(zhì)量值超過Q30的堿基所占比例均高于92%，說明本次轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較好，可信度高。從茶谷蛾雌觸角轉(zhuǎn)錄組中獲得22?532?189條raw reads，Q20和Q30準(zhǔn)確度分別為97.47%和92.64%，其序列的GC堿基占總堿基數(shù)比例為40.24%；雄觸角轉(zhuǎn)錄組中獲得23?301?776條raw reads，Q20和Q30準(zhǔn)確度分別為97.47%和92.56%，其序列的GC堿基占總堿基數(shù)的比例為37.89%（表1）。采用Trinity軟件對clean reads拼接組裝，獲得unigenes數(shù)為37?708條，將其作為后續(xù)分析基因，其長度在301～500?bp的有12?987條，501～1?000?bp的有10?655條，1?001～2?000?bp的有7?118條，大于等于2?001?bp的有6?948條，平均長度為698?bp，N50長度值為2?147，N90長度值為489（表2），說明組裝完整性較好。

2.2 茶谷蛾觸角unigenes基因功能注釋

將拼接后的unigenes序列分別在NR、NT、KO、Swiss-prot、PFAM、GO和KOG/COG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行功能注釋，結(jié)果表明，雌、雄成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組在所有數(shù)據(jù)庫中注釋成功的基因分別為2?871（9.20%）、2?846條（7.61%）；至少在一個數(shù)據(jù)庫里注釋成功的基因分別為19?292條（61.84%）、21?598條（57.79%）。雌、雄成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)注釋到NR數(shù)據(jù)庫的基因數(shù)目最多，分別為15?209條（48.75%）、17?011條（45.51%）；KOG數(shù)據(jù)庫注釋基因最少，分別為5?959條（19.10%）、6?285（16.81%），詳見表3。

表1 茶谷蛾觸角轉(zhuǎn)錄組測序統(tǒng)計(jì)

注：CGEC為茶谷蛾雌成蟲，CGEX為茶谷蛾雄成蟲。Q20：質(zhì)量值≥20的堿基所占百分比，Q30：質(zhì)量值≥30的堿基占比

Note: CGEC is female. CGEX is male. Q20: Percentages of bases with the quality value≥20. Q30: Percentages of bases with the quality value≥30

表2 茶谷蛾觸角轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果

表3 茶谷蛾基因注釋成功率統(tǒng)計(jì)

2.3 同源比對

將茶谷蛾觸角轉(zhuǎn)錄組所有unigenes序列在NCBI中的NR蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTx比對，結(jié)果16?027個unigenes（42.50%）有BLASTx比對結(jié)果。根據(jù)NR數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果，進(jìn)一步對這些注釋序列的同源物種進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖1），茶谷蛾觸角注釋的基因序列與海波斯莫科馬屬蛾（）相似基因最多，占15.20%、其他依次為亞洲玉米螟（）占11.20%、大蠟螟（）占7.90%、棉鈴蟲（）占6.90%、粉紋夜蛾（）占6.30%，其他物種占52.50%。

2.4 茶谷蛾觸角unigenes基因功能分類

茶谷蛾觸角轉(zhuǎn)錄組共有37?708條unigenes，其中在GO數(shù)據(jù)庫中注釋到11?701條（圖2），分為3個大類和40個亞類，3個大類包括生物進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能。生物進(jìn)程中參與細(xì)胞過程的unigenes數(shù)量最多（6?729條），其次為代謝過程（5?692條）；細(xì)胞組分中參與細(xì)胞解剖實(shí)體的unigenes數(shù)量最多（5?257條），其次是細(xì)胞部分內(nèi)（2?897條）；分子功能中參與結(jié)合和催化活性的unigenes數(shù)量最多，分別有6?221條和4?435條（圖2）。

將茶谷蛾觸角轉(zhuǎn)錄組unigenes與KOG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對并根據(jù)其功能進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)（表4），6?047個unigenes得到注釋，按照功能分為25類，其中一般功能預(yù)測最多，有1?040個，其次是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，有822個；細(xì)胞運(yùn)動最少，有16個。

茶谷蛾轉(zhuǎn)錄組有7?892條unigenes注釋KEGG代謝通路，被分為3個層次，第一層次分為五大類，即細(xì)胞加工、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝和有機(jī)體系統(tǒng)，第二層為34小類（表5），第三層次為283個代謝途徑分支。涉及與茶谷蛾信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的有973條、信號分子與相互作用相關(guān)的有123條，涉及到環(huán)境適應(yīng)108條，感覺系統(tǒng)93條。這些unigenes為今后深入開展茶谷蛾環(huán)境適應(yīng)性研究奠定了基礎(chǔ)。

2.5 茶谷蛾觸角轉(zhuǎn)錄組嗅覺相關(guān)基因分析

通過諾禾致源售后服務(wù)NovoMagic平臺，采用關(guān)鍵詞搜索和注釋基因分析，從茶谷蛾觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，鑒定出238個候選嗅覺相關(guān)基因（表6）。其中，氣味結(jié)合蛋白基因108個，占比達(dá)45.4%、氣味/嗅覺受體基因55個、味覺受體基因26個、離子型受體基因25個、化學(xué)感受蛋白基因11個、神經(jīng)元膜蛋白基因4個、感官知覺基因4個、化學(xué)感受受體基因4個、氣味降解酶基因1個，各基因占比見表6。

圖1 NR數(shù)據(jù)庫中注釋的茶谷蛾unigenes

圖2 茶谷蛾觸角轉(zhuǎn)錄組GO分類圖

表4 茶谷蛾觸角轉(zhuǎn)錄組的KOG系統(tǒng)分類

表5 茶谷蛾觸角轉(zhuǎn)錄組的KEGG分類

表6 茶谷蛾觸角轉(zhuǎn)錄組嗅覺相關(guān)基因

2.6 茶谷蛾雌雄成蟲觸角差異表達(dá)基因分析

通過對茶谷蛾雌雄蟲觸角差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，共有1?307個差異基因，其中上調(diào)基因474個，下調(diào)基因833個（圖3）。為進(jìn)一步了解嗅覺相關(guān)基因在雌、雄茶谷蛾觸角中的表達(dá)情況，共鑒定出30個與嗅覺相關(guān)的差異表達(dá)基因（DEGs），其中20個基因在茶谷蛾雄蟲中上調(diào)表達(dá)，包括4個信息素結(jié)合蛋白基因、7個氣味結(jié)合蛋白基因、5個氣味/嗅覺受體基因、3個味覺受體基因以及1個化學(xué)感受蛋白基因；下調(diào)表達(dá)10個，包括5個氣味結(jié)合蛋白基因、4個氣味/嗅覺受體基因和1個離子型受體基因（表7）。由此可見，雌、雄茶谷蛾成蟲對外界氣味化合物的識別存在差異。

注：CEGC：雌性茶谷蛾，CGEX：雄性茶谷蛾

表7 茶谷蛾嗅覺相關(guān)基因表達(dá)模式

續(xù)表7

3 討論

高通量測序技術(shù)已成為一種重要的生物學(xué)研究手段，開展昆蟲轉(zhuǎn)錄組測序，可以獲得大量的序列信息，對于很多沒有完整基因組數(shù)據(jù)的昆蟲來說，可直接解決分子生物學(xué)試驗(yàn)中的無參基因這一重要難題[23-25]。本研究通過Illumina HISeq 4000高通量測序平臺對茶谷蛾雌雄成蟲觸角進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和功能分析，共獲得37?708條unigenes，平均長度為698?bp，其樣本數(shù)據(jù)的Q30堿基比例大于90%，而N50長度為2?147?bp，據(jù)報(bào)道N50長度值越大表示序列拼接的完整性越好[26]，說明本研究獲得的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，保證了后續(xù)分析的準(zhǔn)確性和可靠性。對unigenes功能注釋發(fā)現(xiàn)，有16?027條unigenes在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫（NR）成功注釋，11?701條unigene在基因GO數(shù)據(jù)庫得到注釋，12?009條unigenes得到KEGG富集，歸屬于283個通路，與大多數(shù)研究結(jié)果相似[16,18]。其中茶谷蛾觸角unigenes序列與鱗翅目昆蟲海波斯莫科馬屬蛾、玉米螟、大蠟螟、棉鈴蟲、粉紋夜蛾的基因序列相似度高，表明茶谷蛾觸角基因可能與鱗翅目昆蟲基因具有相似的功能。

嗅覺系統(tǒng)對于昆蟲的生長和生殖至關(guān)重要，是昆蟲對外界信號進(jìn)行識別、傳遞并作出相應(yīng)行為的重要器官，系統(tǒng)中涉及多種蛋白家族[27-29]。本研究利用生物信息學(xué)手段，從茶谷蛾成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中共鑒定出9類嗅覺相關(guān)基因238個，其中氣味結(jié)合蛋白基因108個（包括信息素結(jié)合蛋白、普通氣味結(jié)合蛋白和觸角結(jié)合蛋白3類），數(shù)量最多；其次是氣味/嗅覺受體基因55個，包括典型氣味受體和非典型氣味受體。另外，還包括26個味覺受體基因、25個離子型受體基因、11個化學(xué)感受蛋白基因、4個神經(jīng)元膜蛋白基因、4個感官知覺基因、4個化學(xué)感受受體基因和1個氣味降解酶基因。這些基因在昆蟲嗅覺感受過程中都起到關(guān)鍵性的作用[30]。與其他已知的鱗翅昆蟲如大蠟螟觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定獲得226個候選嗅覺相關(guān)基因[20]、草地貪夜蛾轉(zhuǎn)錄組中鑒定到233個和斜紋夜蛾中鑒定到217個嗅覺相關(guān)基因數(shù)量相比[18]，本研究獲得茶谷蛾嗅覺基因數(shù)量處于合理范疇。

此外，通過基因差異表達(dá)分析，初步鑒定出30個嗅覺相關(guān)基因在雌雄茶谷蛾觸角中差異表達(dá)，其中4個信息素結(jié)合蛋白基因，在雄蟲中為上調(diào)表達(dá)；氣味結(jié)合蛋白基因12個，在雄蟲中7個上調(diào)表達(dá)，5個下調(diào)表達(dá)；3個味覺受體基因和1個化學(xué)感受蛋白基因在雄蟲中上調(diào)表達(dá)；9個氣味/嗅覺受體基因，5個為上調(diào)表達(dá)，4個為下調(diào)表達(dá)；1個離子型受體基因在雄蟲中下調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果表明，雌、雄茶谷蛾成蟲對外界氣味化合物的識別存在差異，同時(shí)這些嗅覺差異表達(dá)基因可能在茶谷蛾性信息素識別過程中發(fā)揮著重要作用，可以作為潛在的干擾茶谷蛾嗅覺識別的靶標(biāo)基因，為后續(xù)茶谷蛾化學(xué)生態(tài)學(xué)分子機(jī)制的深入研究提供足夠的數(shù)據(jù)支持和參考依據(jù)。

[1] 陳宗懋, 孫曉玲. 茶樹主要病蟲害簡明識別手冊[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2013: 185-187.

Chen Z M, Sun X L. Concise manual for identification of major pests and diseases of tea plant [M]. Beijing: China Agricultural Press, 2013: 185-187.

[2] 廣州軍區(qū)生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)六師十三團(tuán)茶葉試驗(yàn)站. 茶谷蛾研究初報(bào)[J]. 中國茶葉, 1974(6): 6-10.

Tea Experimental Station of the 13th Regiment of the 6th Division of Production and Construction Corps of Guangzhou Military Region. A preliminary study on[J]. China Tea, 1974(6): 6-10.

[3] 董祖祥. 一個人和640萬條蟲的戰(zhàn)爭[J]. 農(nóng)藥市場信息, 2015, 541(23): 57-59.

Dong Z X. The war between a man and 6.4 million worms [J]. Pesticide Market Information, 2015, 541(23): 57-59.

[4] Zhang S, Pang B P, Zhang L. Novel odorant-binding proteins and their expression patterns in grasshopper,[J]. Biochemicaland Biophysical Research Communications, 2015, 460(2): 274-280.

[5] Gadenne C, Barrozo R B, Anton S. Plasticity in insect olfaction: to smell or not to smell [J]. Annual Review of Entomology, 2016, 61(1): 317-333.

[6] 鄭海霞, 張耀文, 張仙紅, 等. 綠豆象觸角轉(zhuǎn)錄組及嗅覺相關(guān)基因的分析[J]. 昆蟲學(xué)報(bào), 2018, 61(2) : 168-177.

Zheng H X, Zhang Y W, Zhang X H, et al. Analysis of the antennal transcriptome and olfaction-related genes of(Coleoptera: Bruchuidae) [J]. Acta Entomologica Sinica, 2018, 61(2): 168-177.

[7] 楊雪嬌, 張蔓, 江宇航, 等. 七星瓢蟲觸角轉(zhuǎn)錄組及嗅覺相關(guān)基因分析[J]. 昆蟲學(xué)報(bào), 2020, 63(6): 717-726.

Yang X J, Zhang M, Jiang Y H, et al. Analysis of the antennal transcriptome and olfaction-related genes of() [J]. Acta Entomologica Sinica, 2020, 63(6): 717-726.

[8] Zhou J J. Odorant-binding proteins in insects [J]. Vitamins & Hormones, 2010, 83: 241-272.

[9] 王菁楨. 兩種星天牛嗅覺相關(guān)蛋白基因的鑒定及關(guān)鍵氣味結(jié)合蛋白的功能分析[D]. 北京: 北京林業(yè)大學(xué), 2019.

Wang J Z. Identification of olfactory related genes and functional analysis of the key odorant binding protein from two species of Anoplophora [D]. Beijing: Beijing Forestry University, 2019.

[10] 趙磊, 崔宏春, 張林雅, 等. 茶尺蠖普通氣味結(jié)合蛋白GOBP2與茶樹揮發(fā)物的結(jié)合功能研究[J]. 茶葉科學(xué), 2014, 34(2): 165-171.

Zhao L, Cui H C, Zhang L Y, et al. Molecular binding characterization with tea plant volatiles of a general odorant-bingding proteinGOBP2 in the Tea Geometrid,Prout (Lepidoptera: Geometridae) [J]. Journal of Tea Science, 2014, 34(2): 165-171.

[11] 馬龍. 茶尺蠖化學(xué)感受相關(guān)基因的克隆與功能研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2016.

Ma L. Molecular and functional characterization of chemosensory genes in[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2016.

[12] 田振. 蘋果蠹蛾信息素結(jié)合蛋白的研究及活性氣味分子的篩選[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2016.

Tian Z. Study on cydia pomonella pheromone binding Proteins and screening of potentially active semiochemicals [D]. Yangling: Northwest Agriculture & Forestry University, 2016.

[13] Wang B, Liu Y, Wang G R. Chemosensory genes in the antennal transcriptome of two syrphid species,and(Diptera: Syrphidae) [J]. BMC Genomics, 2017, 18(1): 586. doi: 10.1186/s12864-017-3939-4.

[14] 王曉雙, 唐良德, 吳建輝. 昆蟲嗅覺相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2017, 38(6): 1171-1179.

Wang X S, Tang L D, Wu J H. Research progress on olfactory proteins of insects [J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2017, 38(6): 1171-1179.

[15] Jia X J, Wang H X, Yan Z G, et al. Antennal transcriptome and differential expression of olfactory genes in the yellow peach moth,(Lepidoptera: Crambidae) [J]. Scientific Reports, 2016, 6: 29067. doi: 10.1038/srep29067.

[16] 楊爽, 趙慧婷, 徐凱, 等. 大蠟螟觸角轉(zhuǎn)錄組及嗅覺相關(guān)基因分析[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2019, 56(6): 1279-1291.

Yang S, Zhao H T, Xu K , et al. Analysis of the antennal transcriptome and olfaction-related genes of the greater wax moth(Lepidoptera: Pyralidae) [J]. Chinese Journal of Applied Entomology, 2019, 56(6): 1279-1291.

[17] Zhang T, Coates B S, Ge X, et al. Male-and female-biased gene expression of olfactory-related genes in the antennae of asian corn borer,(Guenée) (Lepidoptera: Crambidae) [J]. Plos One, 2015, 10(6): e0128550. doi:10.1371/journal. pone.0128550.

[18] 黃鈞鴻, 張銘淇, 馮啟理, 等. 草地貪夜蛾與斜紋夜蛾嗅覺味覺相關(guān)基因的比較分析[J]. 環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào), 2019, 41(5): 937 -946.

Huang J H, Zhang M Q, Feng Q L, et al. Comparison of olfactory and gustatory genes betweenand[J]. Journal of Environmental Entomology, 2019, 41(5): 937-946.

[19] 胡佳萌, 徐丹萍, 卓志航, 等. 云斑天牛成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組及嗅覺相關(guān)基因分析[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2019, 56(5): 1037-1047.

Hu J M, Xu D P, Zhuo Z H, et al. Analysis of antennal transcriptome and olfaction-related genes of adult(Hope) [J]. Chinese Journal of Applied Entomology, 2019, 56(5): 1037-1047.

[20] Grabherr M G, Haas B J, Yassour M, et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome [J]. Nature Biotechnology, 2011, 29(7): 644-652. doi: 10.1038/nbt.1883.

[21] Li B, Dewey C. RSEM: Accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome [J]. BMC Bioinformatics, 2011, 12: 323. doi: 10.1186/1471-2105-12-323.

[22] Robinson M D, McCarthy D J, Smyth G K. A bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data [J]. Bioinformatics, 2010, 26: 139-140. doi: 10.1093/bioinformatics/btp616.

[23] 楊海博, 胡鎮(zhèn)杰, 李定旭, 等. 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽觸角轉(zhuǎn)錄組及嗅覺相關(guān)基因分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2018, 26(12): 2109-2120.

Yang H B, Hu Z J, Li D X, et al. Analysis of the antennal transcriptome and olfactory-related genes of the(Corythucha ciliata) [J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2018, 26(12): 2109-2120.

[24] 張新, 陳成聰, 杜琴, 等. 茶尺蠖絲氨酸蛋白酶基因的克隆、時(shí)空表達(dá)及對饑餓的表達(dá)響應(yīng)[J]. 茶葉科學(xué), 2019, 39(6): 669-680.

Zhang X, Chen C C, Du Q, et al. Cloning and expression analysis of serine proteasein Tea Geometrid () and its response to starvation [J]. Journal of Tea Science, 2019, 39(6): 669-680.

[25] 劉新, 陳紅平, 王國慶. 中國茶葉質(zhì)量安全40年[J]. 中國茶葉, 2019, 41(12): 1-9.

Liu X, Wang G Q, Chen H P, et al. The development of tea quality and safety in China over the past 40 years [J]. China Tea, 2019, 41(12): 1-9.

[26] 王興春, 譚河林, 陳釗, 等. 基于RNA-Seq技術(shù)的連翹轉(zhuǎn)錄組組裝與分析及SSR分子標(biāo)記的開發(fā)[J]. 中國科學(xué): 生命科學(xué), 2015, 45(3): 301-310.

Wang X C, Tan H L, Chen Z, et al. Assembly and characterization of the transcriptome and developmentof SSR markers in Forsythia suspense based on RNA-Seq technology [J]. Scientia Sinica (Vitae), 2015, 45(3): 301-310.

[27] 謝翠琴, 聶紅毅, 蘇松坤. 昆蟲觸角轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2016, 53(6): 1157-1164.

Xie C Q, Nie H Y, Su S K. Advances in research on antennal transcriptome in insects [J]. Chinese Journal of Applied Entomology, 2016, 53(6): 1157-1164.

[28] Allen J E, Wanner K W. Asian corn borer pheromone binding protein 3 a candidate for evolving specificity to the 12-tetradecenyl acetate sex pheromone [J]. Insect Biochemistry & Molecular Biology, 2011, 41(3): 141-149.

[29] 任倩倩, 莊明珠, 蔡曉明, 等. 小貫小綠葉蟬取食誘導(dǎo)抗、感茶樹品種揮發(fā)物的釋放[J]. 茶葉科學(xué), 2020, 40(6): 795-806.

Ren Q Q, Zhuang M Z, Cai X M, et al. The release of volatiles in resistant and susceptible tea cultivars underfeeding [J]. Journal of Tea Science, 2020, 40(6): 795-806.

[30] Leal W S. Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes [J]. Annual Review of Entomology, 2013, 58(1): 373-391.

Analysis of the Antennal Transcriptome and Olfactory-related Genes in the

LONG Yaqin, LUO Ziwen, WANG Xuesong, LONG Lixue, YU Xiangshuai, LI Jinlong, QU Hao, WANG Yungang, CHEN Linbo*

Tea Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Technology Engineering Research Center of Tea Germplasm Innovation and Supporting Cultivation/Yunnan Provincial Key Laboratory of Tea Science, Menghai 666201, China

To identify the olfactory-related genes, the transcriptome analysis of thewas performed using Illumina HiSeq 4000. Through sequence alignment, 16?027 unigenes were annotated in NR databases. Totally 11?701 unigenes were annotated in GO database, which can be divided into 3 groups according to their functions: cellular component, molecular function and biological process. Totally 6?047 unigenes were further annotated and divided into 25 functional groups in KOG databases. KEGG pathway analysis shows that 12?009 unigenes were annotated into 283 metabolism pathways. According to the annotation information, 238 candidate olfactory-related genes were obtained including 108 odorant binding protein () genes, 55 odorant /olfactory receptor () genes, 26 gustatory receptor () genes, 25 ionotropic receptor () genes, 11 chemosensory protein () genes, 4 sensory neuron membrane protein () genes, 4 sensory perception () genes , 4 chemosensory receptor () genes and an odorant degrading enzyme () gene. It was found that 12 odorant binding protein genes, 9 odorant/olfactory receptorgenes, 4 pheromone binding protein genes, 3 gustatory receptor genes, chemosensory protein gene and 1ionotropic receptor gene were differentially expressed in the antenna of. In this study, the identification of candidate olfactory-related genes laid a molecular foundation for further studies on gene function and olfactory perception mechanism of the.

, antennal transcriptome, high-throughput sequencing, genome annotation, olfaction-related genes

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2021)04-553-11

2020-10-10

2020-11-26

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0200903）、財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）

龍亞芹，女，副研究員，主要從事茶樹病蟲害研究，longyaqin19831212@126.com。*通信作者：chenlinbo2002@sina.com

（責(zé)任編輯：趙鋒）