鄭燕燕，朱雨田，李錦才，黎燕玲，何麗香

（深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，國家營養(yǎng)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（廣東），深圳518131）

0 引 言

維生素A、D均屬于脂溶性維生素。維生素A功能上可防止夜盲癥和視力減退，同時(shí)可維護(hù)上皮組織細(xì)胞的健康和促進(jìn)免疫球蛋白的合成、維持骨骼正常生長(zhǎng)發(fā)育以及抑制腫瘤生長(zhǎng)，缺乏維生素A可導(dǎo)致兒童發(fā)育不良、干眼病、夜盲癥等疾病的發(fā)生[1]。維生素D功能上可防止佝僂病，同時(shí)可促進(jìn)皮膚細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及調(diào)節(jié)免疫功能作用，缺乏維生素D的兒童可患佝僂病，成人患骨質(zhì)軟化癥[2-3]。而另一方面，維生素A、維生素D攝入過量時(shí)，也會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生較大危害，由于該類脂溶性維生素不易通過尿液排出體外，容易在體內(nèi)大量蓄積，從而引起皮膚、骨骼、腦、肝等多種臟器組織病變，對(duì)人體健康造成巨大影響[4-6]。GB10765-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》及GB10767-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)較大嬰兒和幼兒配方食品》均規(guī)定了維生素A和維生素D的含量范圍[7-8]。維生素A和維生素D的測(cè)定在保障嬰幼兒配方食品質(zhì)量安全中發(fā)揮重要作用，因此開展此項(xiàng)能力驗(yàn)證工作對(duì)確保實(shí)驗(yàn)室維持該項(xiàng)檢測(cè)能力在較高水平具有至關(guān)重要意義[9-11]。

嬰幼兒配方乳粉基質(zhì)復(fù)雜，但樣品均勻性好，方便樣品制備，且維生素A和維生素D在嬰幼兒配方乳粉中可以穩(wěn)定存在，符合能力驗(yàn)證樣品的穩(wěn)定性和均勻性要求。該項(xiàng)目有相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[12]，方法成熟穩(wěn)定，已被廣泛采用，可以保證本能力驗(yàn)證項(xiàng)目順利完成。本能力驗(yàn)證的目的是為了了解和評(píng)價(jià)目前國內(nèi)嬰幼兒配方乳粉中維生素A、D檢測(cè)能力和水平，識(shí)別實(shí)驗(yàn)室間存在的差異，推動(dòng)和提高參加實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中維生素A、D的技術(shù)能力和水平，起到規(guī)范實(shí)驗(yàn)室管理的作用。

1 材料與方法

1.1 樣品設(shè)計(jì)及制備

本次能力驗(yàn)證的測(cè)試樣品為嬰幼兒配方乳粉，所涉及項(xiàng)目為維生素A、維生素D。根據(jù)方案設(shè)計(jì)，制備3組樣品（組別編號(hào)分別為A、B、C），為了盡可能地與日常檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉一致，同時(shí)保證樣品制備時(shí)的均勻性，由兩家品牌乳粉生產(chǎn)商采用濕法噴霧干燥工藝制備所需樣品原料。定量（40 g/包）分裝，真空密封后，放入鋁箔袋中封好。分裝后的樣品，粘貼唯一性標(biāo)識(shí)，常溫、避光儲(chǔ)存。

1.2 樣品均勻性檢驗(yàn)

樣品均勻性檢驗(yàn)按CNAS-GL003:2018《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》（以下簡(jiǎn)稱“CNAS-GL003:2018”）[13]、GB/T 28043-2019《利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)進(jìn)行能力驗(yàn)證的統(tǒng)計(jì)方法》（以下簡(jiǎn)稱“GB/T 28043-2019”）附錄B的規(guī)定[14]，從分裝好的三組能力驗(yàn)證樣品中各隨機(jī)抽取10份，維生素A采用GB 5009.82-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中維生素A、D、E的測(cè)定》（以下簡(jiǎn)稱“GB 5009.82-2016”）第一法進(jìn)行檢測(cè)，維生素D采用GB 5009.82-2016第四法進(jìn)行檢測(cè)。均勻性檢驗(yàn)由同一檢測(cè)人員在同一時(shí)間段使用相同測(cè)試方法、相同測(cè)試條件、同一測(cè)試儀器對(duì)抽取的每份樣品進(jìn)行2次測(cè)試。采用單因子方差分析法，通過F檢驗(yàn)初步評(píng)價(jià)3組樣品的均勻性，結(jié)果表明樣品之間無顯著差異，證明樣品是均勻的，可以進(jìn)行樣品發(fā)放。參加實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)回收后，采用SS≤0.1δE準(zhǔn)則再次評(píng)價(jià)樣品均勻性（SS表示樣品間標(biāo)準(zhǔn)差，δE表示最大允許誤差），結(jié)果（SS＜0.1δE）滿足均勻性的要求。

1.3 樣品穩(wěn)定性檢驗(yàn)

本次能力驗(yàn)證項(xiàng)目穩(wěn)定性測(cè)定方法同均勻性檢驗(yàn)，對(duì)3個(gè)水平樣品進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)。均勻性檢驗(yàn)符合要求后，在樣品發(fā)放前和回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別從制備好的能力驗(yàn)證樣品中各隨機(jī)抽取6份樣品，每份樣品獨(dú)立進(jìn)行2次檢測(cè)。穩(wěn)定性檢驗(yàn)涵蓋整個(gè)計(jì)劃實(shí)施周期，按CNAS-GL003:2018、GB/T 28043-2019附錄B規(guī)定，采用t檢驗(yàn)法中“二個(gè)平均值之間的一致性”方法及|x-y|≤0.1δE準(zhǔn)則進(jìn)行評(píng)定。結(jié)果表明，本次能力驗(yàn)證樣品穩(wěn)定性滿足要求。

1.4 檢測(cè)方法

本次能力驗(yàn)證推薦采用GB 5009.82-2016進(jìn)行測(cè)定，每份樣品報(bào)送2次平行測(cè)定結(jié)果的平均值。樣品前處理偏離情況及所用儀器設(shè)備、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等信息需要在結(jié)果報(bào)告單中詳細(xì)說明。

1.5 樣品的發(fā)放

按預(yù)先分組情況，從3組樣品中的兩組各隨機(jī)抽取1包樣品，放入粘貼有快遞單的白色泡沫盒內(nèi)，記錄樣品編號(hào)、實(shí)驗(yàn)室代碼，核對(duì)無誤后，再使用膠帶進(jìn)行包裝，以快遞的方式向各參加實(shí)驗(yàn)室發(fā)放考核樣品。

1.6 指定值的確定

按GB/T 28043-2019附錄C中算法A計(jì)算穩(wěn)健平均值（x*），以x*作為本次能力驗(yàn)證的指定值（X）。

1.7 評(píng)價(jià)依據(jù)

（1）本次能力驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)的參數(shù)為百分相對(duì)差（D%）。具體計(jì)算公式如下：

（2）判定原則。

根據(jù)GB/T 32465-2015《化學(xué)分析方法驗(yàn)證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制要求》第7.4條及GB 5009.82-2016第7、21、28條對(duì)精密度的要求[15]。設(shè)置2倍的維生素A、D的精密度為本次能力評(píng)定百分相對(duì)差的判定限值，即20%、30%。本次能力驗(yàn)證判定原則設(shè)置如下：

維生素A項(xiàng)目：當(dāng)兩個(gè)樣品的維生素A項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均符合｜D%｜≤20%時(shí)，結(jié)果為滿意；當(dāng)兩個(gè)樣品的任一維生素A項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果符合｜D%｜＞20%時(shí)，結(jié)果為不滿意。

維生素D項(xiàng)目：當(dāng)兩個(gè)樣品的維生素D項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均符合｜D%｜≤30%時(shí)，結(jié)果為滿意；當(dāng)兩個(gè)樣品的任一維生素D項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果符合｜D%｜＞30%時(shí)，結(jié)果為不滿意。

2 結(jié)果與分析

2.1 參加實(shí)驗(yàn)室概況

參加本次能力驗(yàn)證的機(jī)構(gòu)為224家（強(qiáng)制參加實(shí)驗(yàn)室有186家，自愿報(bào)名參加實(shí)驗(yàn)室有38家），來自全國30個(gè)省、自治區(qū)和直轄市，其中報(bào)名參加維生素A項(xiàng)目有221家，報(bào)名參加維生素D項(xiàng)目有198家。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，有1家參加實(shí)驗(yàn)室未反饋維生素A測(cè)試結(jié)果，4家實(shí)驗(yàn)室未反饋維生素D測(cè)試結(jié)果，實(shí)際收到維生素A測(cè)試結(jié)果220項(xiàng)、維生素D測(cè)試結(jié)果194項(xiàng)。參加本次能力驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室行業(yè)及地域分布情況見表1、表2。

表1 參加實(shí)驗(yàn)室的行業(yè)分布及占比

表2 實(shí)際參加實(shí)驗(yàn)室地域分布情況

2.2 能力統(tǒng)計(jì)結(jié)果

本次能力驗(yàn)證的結(jié)果數(shù)、穩(wěn)健平均值、最大允許誤差、穩(wěn)健標(biāo)準(zhǔn)差、指定值不確定度、穩(wěn)健變異系數(shù)等統(tǒng)計(jì)量匯總見表3。本次能力驗(yàn)證維生素A項(xiàng)目的最大允許誤差為指定值的，維生素D項(xiàng)目的最大允許誤差為指定值的。指定值不確定度ux均小于0.1δE，表明本次能力驗(yàn)證指定值的不確定度可以忽略不計(jì)。

表3 檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)量匯總表

2.3 結(jié)果統(tǒng)計(jì)及評(píng)價(jià)

分別統(tǒng)計(jì)3組維生素A和維生素D結(jié)果分布的頻率，繪制分布頻率直方圖，見圖1～3，圖中表明本次能力驗(yàn)證回收的結(jié)果服從單峰、近似對(duì)稱分布，用穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)技術(shù)算法A進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

圖1 A組樣品參加者結(jié)果直方圖

本次能力驗(yàn)證共224家實(shí)驗(yàn)室參加，報(bào)名參加維生素A和維生素D的實(shí)驗(yàn)室數(shù)量分別為221家和198家，其中實(shí)際回收維生素A項(xiàng)目結(jié)果220家，結(jié)果滿意實(shí)驗(yàn)室為182家，占結(jié)果總數(shù)的82.7%，不滿意實(shí)驗(yàn)室為38家，占結(jié)果總數(shù)的17.3%；維生素D項(xiàng)目結(jié)果提交實(shí)驗(yàn)室共計(jì)194家，結(jié)果滿意實(shí)驗(yàn)室為182家，占結(jié)果總數(shù)的93.8%，不滿意實(shí)驗(yàn)室為12家，占結(jié)果總數(shù)的6.2%，具體見表4。各組維生素A、D評(píng)價(jià)情況見表5、表6。

表4 各測(cè)試項(xiàng)目評(píng)價(jià)情況匯總表 家

表5 各組維生素A項(xiàng)目評(píng)價(jià)情況匯總表

表6 各組維生素D項(xiàng)目評(píng)價(jià)情況匯總表

2.4 技術(shù)分析與建議

2.4.1 檢測(cè)方法的差異

反饋維生素A結(jié)果的220家實(shí)驗(yàn)室中，有217家均采用了GB 5009.82-2016第一法對(duì)維生素A進(jìn)行測(cè)定；1家實(shí)驗(yàn)室使用了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)維生素A，但該方法的適用范圍并不包含維生素A，屬于使用了偏離的標(biāo)準(zhǔn)方法，且該實(shí)驗(yàn)室的維生素A屬于不滿意結(jié)果，但該實(shí)驗(yàn)室并未提供相關(guān)方法驗(yàn)證材料，無法進(jìn)一步分析；2家實(shí)驗(yàn)室聲稱依據(jù)GB 5009.82-2016第三法同時(shí)對(duì)維生素A和維生素D進(jìn)行了測(cè)定，但該方法不能同時(shí)檢測(cè)維生素A和維生素D，屬于實(shí)驗(yàn)室對(duì)所使用的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)生了偏離，且其中1家實(shí)驗(yàn)室維生素A結(jié)果為不滿意。

圖2 B組樣品參加者結(jié)果直方圖

圖3 C組樣品參加者結(jié)果直方圖

反饋維生素D結(jié)果的194家實(shí)驗(yàn)室中，有93家使用了GB 5009.82-2016第三法液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)維生素D進(jìn)行了檢測(cè)，占總數(shù)的47.9%，其中結(jié)果滿意的實(shí)驗(yàn)室占比為89.2%；有99家使用了GB 5009.82-2016第四法高效液相色譜法對(duì)維生素D進(jìn)行了檢測(cè)，占總數(shù)的51.0%，其中結(jié)果滿意的實(shí)驗(yàn)室占比為99.0%；2家實(shí)驗(yàn)室偏離GB 5009.82-2016標(biāo)準(zhǔn)，使用同一方法同時(shí)對(duì)維生素A和維生素D進(jìn)行檢測(cè)，且其中1家實(shí)驗(yàn)室維生素D結(jié)果為不滿意。

2.4.2 檢測(cè)過程的質(zhì)量控制

影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的因素有人員、設(shè)備、試劑、方法、環(huán)境等。檢測(cè)過程中要嚴(yán)格控制好實(shí)驗(yàn)條件，通過分析各參加實(shí)驗(yàn)室反饋的原始記錄，本次能力驗(yàn)證測(cè)定過程中應(yīng)注意以下幾個(gè)方面。

（1）樣品前處理操作。樣品前處理是影響結(jié)果準(zhǔn)確性的最關(guān)鍵因素之一，測(cè)定維生素A和維生素D時(shí)，前處理要注意避光操作，防止紫外線對(duì)結(jié)果造成干擾。皂化要充分，如皂化液冷卻后，液面有浮油，需要加入適量氫氧化鉀溶液，并適當(dāng)延長(zhǎng)皂化時(shí)間。提取時(shí)，不宜劇烈振蕩，容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象。凈化過程，個(gè)別實(shí)驗(yàn)室采用GB 5009.82-2016第四法測(cè)定維生素D時(shí)，未按標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行凈化，導(dǎo)致較多雜質(zhì)干擾目標(biāo)物出峰。

（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的影響。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是實(shí)驗(yàn)室定量檢測(cè)的準(zhǔn)繩，其計(jì)量溯源性非常重要。建議實(shí)驗(yàn)室優(yōu)先選用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用過程中，要考慮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、有效期、儲(chǔ)存方式及目標(biāo)成分變化等。同時(shí)，在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，使用的移液管、容量瓶等要經(jīng)過檢定且滿足要求。配制好的維生素A、D標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在使用前一定要按GB 5009.82-2016附錄B的要求校正后使用。部分實(shí)驗(yàn)室未對(duì)配制的維生素A、D標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行校正。標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍應(yīng)覆蓋試樣的測(cè)定值，某些實(shí)驗(yàn)室計(jì)算維生素A含量時(shí)超出了線性范圍。

（3）儀器設(shè)備。儀器設(shè)備測(cè)試條件的優(yōu)化是影響結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。有個(gè)別實(shí)驗(yàn)室沒有做好儀器條件的優(yōu)化，導(dǎo)致目標(biāo)物與雜質(zhì)的峰分離度不夠，不能滿足準(zhǔn)確定量的要求。個(gè)別實(shí)驗(yàn)室測(cè)定維生素A、D時(shí)，色譜峰明顯有雜峰干擾，目標(biāo)峰與雜峰未明顯分開；個(gè)別實(shí)驗(yàn)室選擇維生素D2作為內(nèi)標(biāo)，利用內(nèi)標(biāo)法對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量，但是維生素D2與維生素D3未完全分開。這些都可能會(huì)影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

（4）檢測(cè)方法。應(yīng)嚴(yán)格按照所選擇的方法進(jìn)行測(cè)試，如發(fā)生偏離時(shí)應(yīng)對(duì)方法進(jìn)行確認(rèn)，個(gè)別實(shí)驗(yàn)室偏離了所選擇的方法，且未使用質(zhì)控樣品或加標(biāo)回收予以確認(rèn)。部分實(shí)驗(yàn)室使用GB 5009.82-2016第三法檢測(cè)維生素D，但并未按標(biāo)準(zhǔn)要求使用內(nèi)標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，而是偏離標(biāo)準(zhǔn)采用外標(biāo)法或單點(diǎn)校正計(jì)算結(jié)果。對(duì)平行樣的精密度控制也尤其重要，個(gè)別實(shí)驗(yàn)室上報(bào)的同一樣品的精密度不滿足方法要求，說明實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)性有問題。

2.4.3 參加者結(jié)果誤差分析

從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，某些實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)維生素A或維生素D時(shí)，其各自的兩份樣品結(jié)果存在較為一致的正偏倚或負(fù)偏倚，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室提供的原始記錄等材料審核發(fā)現(xiàn)，個(gè)別實(shí)驗(yàn)室偏離標(biāo)準(zhǔn)，方法誤差可能是造成較大一致性偏倚的原因之一。因?qū)嶒?yàn)室提供材料有限，無法進(jìn)一步分析判斷。對(duì)于結(jié)果出現(xiàn)一致性較大偏倚的實(shí)驗(yàn)室，建議應(yīng)從方法、儀器、試劑、人員操作等可能存在的系統(tǒng)誤差對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，及時(shí)找出可能存在的問題。

3 結(jié) 論

從本次能力驗(yàn)證結(jié)果來看，我國大多數(shù)檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)結(jié)果是滿意的，從參加者提供的原始記錄來分析，其檢測(cè)能力均基本符合要求。產(chǎn)生不滿意結(jié)果的主要原因包括儀器設(shè)備測(cè)試條件、對(duì)方法理解、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制、樣品前處理等方面。本次能力驗(yàn)證部分實(shí)驗(yàn)室結(jié)果出現(xiàn)不滿意情況，建議這些實(shí)驗(yàn)室參照技術(shù)報(bào)告給出的信息，根據(jù)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，結(jié)合自身的實(shí)際，認(rèn)真對(duì)本實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估，真正找出差距和問題所在，制定糾正措施，有效整改，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，持續(xù)保持和提高技術(shù)能力及管理水平。