楊 蓉，周 迪*，燕志宏，任麗群，李 平，李 俊，趙忠海，唐華江，龍清孟，龔 菲，陳昌雪，蔣桂榮

（1.貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心，貴州貴陽 550018，2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；3.遵義市畜牧漁業(yè)站，貴州遵義 563000；4.貴州省草業(yè)研究所，貴州貴陽 550025）

膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要成分[1]，能夠在肌肉和脂肪組織中廣泛分布并形成微細(xì)的原纖維網(wǎng)[2-3]。研究表明，膠原蛋白的類型有18 種之多，且其含量和交聯(lián)程度（主要指非還原性交聯(lián)，羥賴氨酰吡啶嗡（HP）和賴氨酰吡啶嗡（LP）結(jié)構(gòu)，統(tǒng)稱為吡啶交聯(lián)）是影響肉質(zhì)的關(guān)鍵因素[4-6]。膠原分子中的羥基、酰胺基及氨基等極性基團(tuán)能在水中與H 鍵相結(jié)合形成凝膠，對肉的膠粘性、彈性以及咀嚼性等性狀具有重要影響；研究發(fā)現(xiàn)，III 型膠原蛋白是動物機(jī)體中最常見也是最主要的類型之一，其編碼的COL3A1基因由3 條α1（III）鏈組成，其mRNA 表達(dá)水平對肌肉膠原蛋白含量具有重要作用[7-8]，也對其感官性狀和肉質(zhì)性狀有一定影響。賴氨酰氧化酶（LOX）是促進(jìn)彈性蛋白和膠原蛋白共價交聯(lián)的關(guān)鍵酶，主要作用于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的膠原蛋白和彈性纖維，催化氧化ECM 中去氨基的賴氨酸和羥賴氨酸，以促進(jìn)膠原蛋白分子間共價交聯(lián)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而保持細(xì)胞外基質(zhì)的完整和穩(wěn)定。貴州地方豬具有皮糯肉嫩，風(fēng)味極佳等優(yōu)良特性，深受消費(fèi)者青睞，為探索其內(nèi)在原因，本研究以貴州地方豬柯樂豬、宗地花豬與杜長大雜交豬為實(shí)驗(yàn)對象，探究其肌肉和脂肪組織膠原蛋白特性及相關(guān)基因COL3A1、LOX在不同組織中的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與樣品 柯樂豬、宗地花豬和杜大長雜交豬分別由赫章優(yōu)農(nóng)谷生態(tài)畜牧業(yè)有限公司、紫云紫薇畜牧業(yè)開發(fā)有限公司和貴州臺農(nóng)興旺公司提供。隨機(jī)選取體質(zhì)健康、飼喂水平相同、體重約100 kg 的柯樂豬、宗地花豬和杜大長雜交豬各3 頭進(jìn)行屠宰，采集其皮下脂肪、背最長肌等組織，用0.9%生理鹽水清洗后，置于液氮中暫存，帶回實(shí)驗(yàn)室至-80℃超低溫冰箱保存，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠原蛋白含量測定 稱取0.2 g 組織樣品置于試管中，加入2 mL 6 mol/L 鹽酸提取液，100℃消化2～6 h，冷卻至室溫后，12 000 r/min、25℃離心20 min，隨后用10 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 至6～8，取上清，測定管加入待測液60 μL，加入試劑一混勻靜置20 min，加試劑二和H2O，混勻，60℃水浴20 min，室溫靜置15 min，酶標(biāo)儀測定吸光值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線后計算羥脯氨酸（HYP）含量再換算成算膠原蛋白含量。

1.2.2 吡啶交聯(lián)含量測定 稱取1 g 組織樣品用PBS（0.01 mol/L,pH=7.2～7.4）沖洗，剪碎放入玻璃勻漿器底部，加入9 mL PBS 在冰上研磨，5 000 r/min 離心15 min，取上清液待測。標(biāo)準(zhǔn)孔加標(biāo)準(zhǔn)品50 μL。空白孔加樣品稀釋液50 μL；樣品孔先加樣品稀釋液40 μL，再加待測樣品10 μL，每孔加抗體100 μL，37℃避光孵育60 min。棄去液體，拍干，每孔加洗滌液靜置1 min 甩去液體，拍干，重復(fù)5 次。加顯色劑A 50 μL，再加顯色劑B 50 μL，混勻，避光顯色15 min。加終止液終止顯色，用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處的OD 值。再以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為x 軸，OD 值為y 軸，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，計算各樣品濃度。

1.2.3 RNA 提取和cDNA 第一條鏈合成 采用Trizol法提取組織總RNA，根據(jù)RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟將RNA 樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中豬LOX、COL3A1基因mRNA 序列，采用Primer 5 軟件設(shè)計特異性熒光引物，選用GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物序列見表1，設(shè)計完畢后交由生工生物（上海）股份有限公司合成。

表1 LOX、COL3A1 基因引物信息

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR 用SYBR Green I 熒光染料法進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)，總體系為10 μL，cDNA 模板1 μL，F(xiàn)orward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，SsoFASt EvaGreen Supermix 5 μL，RNase-free ddH2O 3.2 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃ 延伸1 min，39 個循環(huán)。熔解曲線以每5 s 上升0.5℃的速率從65℃升高到95℃。每個樣品設(shè)3 個重復(fù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 利用Excel 2007 軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，并用2-ΔΔCt法計算LOX、COL3A1基因在不同豬種背最長肌和皮下脂肪的相對表達(dá)量。并用SPSS 19.0 分析軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 實(shí)驗(yàn)得出a 值為0.039，b 值為0.118 2，帶入羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程y=0.039x+0.1183，R2為0.987 7。將所測樣品ΔA（A測定管-A 空白管）的OD 值帶入方程得出x 值。

2.2 膠原蛋白含量 如圖1 所示，3 個品種皮下脂肪膠原蛋白含量均高于背最長肌組織，且在皮下脂肪和背最長肌中膠原蛋白含量均是宗地花豬最高，極顯著高于柯樂豬和杜大長雜交豬，柯樂豬含量居中，杜大長雜交豬含量最低。

圖1 不同品種和組織膠原蛋白含量（單位：μg/g）

2.3 吡啶交聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x 軸，OD 值為y 軸建立線性回歸方程：y=kx+b，結(jié)果表明：HP 實(shí)驗(yàn)所得a 值為0.22，b 值為0.095 5，帶入方程y=0.22x+0.0955，且R2=0.996 4；LP 實(shí)驗(yàn)所得a 值為0.377 7，b 值為0.033 7，帶入方程y=0.3777x+0.0337，且R2=0.972 6。將所測樣品OD 值帶入方程，求出x 值。

2.4 宗地花豬、柯樂豬及杜大長雜交豬HP 含量、LP 含量差異性分析 如表2 所示，相同組織不同品種間采用單因素方差分析，對于同一品種的2 個組織間采用t檢驗(yàn)。由表2 可知，對于HP 含量，在背最長肌中，宗地花豬、柯樂豬均極顯著高于杜大長雜交豬，宗地花豬和柯樂豬之間差異不顯著；在皮下脂肪中，柯樂豬含量最高，杜大長雜交豬次之，宗地花豬的含量最低，且柯樂豬顯著高于宗地花豬，杜大長雜交豬與柯樂豬、宗地花豬之間均不呈顯著關(guān)系。在同一品種不同組織中，3 個豬種皮下脂肪HP 含量均高于背最長肌，其中柯樂豬皮下脂肪HP 含量顯著高于背最長肌，宗地花豬和杜大長雜交豬皮下脂肪HP 含量均極顯著高于背最長肌。

表2 HP 含量、LP 含量比較分析結(jié)果

對于LP 指標(biāo)，在背最長肌中，柯樂豬含量最高，杜大長雜交豬次之，宗地花豬最低，柯樂豬與杜大長雜交豬差異不顯著，但均極顯著高于宗地花豬；在皮下脂肪中，杜大長雜交豬含量最高，極顯著高于柯樂豬和宗地花豬，柯樂豬含量高于宗地花豬但差異不顯著。在同品種不同組織中，柯樂豬背最長肌中LP 含量極顯著高于皮下脂肪，宗地花豬背最長肌中LP 含量顯著高于皮下脂肪。

2.5LOX、COL3A基因RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果 擬用于RTPCR 擴(kuò)增引物，經(jīng)梯度PCR 擴(kuò)增檢測，發(fā)現(xiàn)目的片段大小相近，且條帶清晰、無雜帶、無引物二聚體，說明引物特異性好，可直接用于RT-PCR 擴(kuò)增。

2.6 實(shí)時熒光定量PCR 結(jié)果分析

2.6.1LOX基因差異表達(dá)分析 如圖2 可知，在背最長肌中，杜大長雜交豬LOX基因表達(dá)量與柯樂豬和宗地花豬之間呈差異極顯著，宗地花豬與柯樂豬之間未達(dá)到顯著水平；在皮下脂肪組織，杜大長雜交豬極顯著高于柯樂豬和宗地花豬；對同一豬種不同組織分析結(jié)果顯示，3 個豬種皮下脂肪組織LOX基因表達(dá)均極顯著高于背最長肌組織。

圖2 LOX 基因在不同豬種組織表達(dá)水平

2.6.2COL3A1基因差異表達(dá)分析 如圖3 所示，背最長肌組織COL3A1基因在宗地花豬中表達(dá)量極顯著高于柯樂豬和杜大長雜交豬，柯樂豬次之，杜大長雜交豬最低；皮下脂肪組織COL3A1基因表達(dá)量宗地花豬顯著高于柯樂豬，極顯著高于杜大長雜交豬。同一品種不同組織分析結(jié)果顯示，皮下脂肪COL3A1基因表達(dá)量均極顯著高于背最長肌。

圖3 COL3A1 基因在不同豬種組織表達(dá)水平

3 討 論

膠原蛋白普遍存在于動物機(jī)體內(nèi)的結(jié)締組織、骨骼、肌肉、內(nèi)臟器官等組織中，它對肌肉生長和保持肌肉塑性具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，在3 個豬種中，皮下脂肪膠原蛋白含量高于背最長肌組織，且宗地花豬2 個組織膠原蛋白含量高于柯樂豬和杜大長雜交豬。研究表明[10]，隨著膠原蛋白含量增加，彈性增強(qiáng)，表明膠原蛋白含量越高，肉質(zhì)就越富有彈性。另外膠原蛋白網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)使其具有很強(qiáng)的熱收縮性，且與水分子結(jié)合能力較強(qiáng)，這使得膠原蛋白熱溶解于水中呈凝膠狀，因此，提高膠原蛋白含量使肉質(zhì)更富有粘彈性和糯性，從而提高口感豐富度和咀嚼性。有研究表明，膠原蛋白影響肌肉嫩度，其含量與嫩度呈負(fù)相關(guān)[11-13]，而梁夢帆等[14]人卻表明肌內(nèi)結(jié)締組織膠原蛋白能在一定程度上保持肉的嫩度。因此，關(guān)于膠原蛋白對肌肉嫩度的影響還需進(jìn)一步探究，或許膠原蛋白含量對嫩度的影響只是在動物生長的某個年齡階段。因?yàn)閯游矬w在成熟后膠原蛋白數(shù)量不再增加，而是轉(zhuǎn)變?yōu)槟z原蛋白分子間交聯(lián)程度的加強(qiáng)，膠原分子肽鏈之間可以形成共價交聯(lián)（偶聯(lián)）作用，主要是HP 交聯(lián)和LP 交聯(lián)，導(dǎo)致膠原蛋白的理化性質(zhì)改變。HP 交聯(lián)和LP 交聯(lián)有很強(qiáng)的穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，對肌肉嫩度和熱溶解性有一定影響[15-16]。在本研究中，宗地花豬、柯樂豬背最長肌中HP 濃度均高于三元雜交豬，且宗地花豬的含量最高；但在脂肪組織卻呈現(xiàn)與之不同的結(jié)果，宗地花豬與柯樂豬HP 含量均極顯著低于外三元雜交豬；LP 交聯(lián)在肌肉和脂肪組織中含量宗地花豬與柯樂豬均低于外三元雜交豬。Nishimura[17]曾提出脂肪沉積可破壞結(jié)締組織結(jié)構(gòu)，隨著年齡增加，牛肉剪切力不再增加，且嫩度也有所改善，推測脂肪沉積破壞了結(jié)締組織結(jié)構(gòu)。盧桂松等[15]研究發(fā)現(xiàn)，隨著脂肪沉積的增加，牛肉花紋等級提高，HP和LP 含量均有下降趨勢，據(jù)此可推測，脂肪沉積可能會導(dǎo)致膠原蛋白交聯(lián)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，主要是非還原性交聯(lián)HP 和LP。本研究表明，膠原蛋白含量在宗地花豬脂肪組織中最高，但HP 和LP 交聯(lián)含量卻較低，說明其脂肪沉積量較多[18]，分子間交聯(lián)程度較小，溶解性增大，對HP 和LP 共價交聯(lián)結(jié)構(gòu)形成具有抑制作用，但具體影響機(jī)制還需繼續(xù)探索。

本研究發(fā)現(xiàn)，COL3A1基因表達(dá)量在不同品種間存在差異，其表達(dá)量順序依次為：宗地花豬＞柯樂豬＞杜大長雜交豬；在品種內(nèi)不同組織表達(dá)量也存在差異性，即在皮下脂肪COL3A1基因表達(dá)量極顯著高于背最長肌，這與組織本身膠原蛋白含量高低有一定關(guān)系。同時COL3A1基因表達(dá)趨勢與膠原蛋白含量分布有一定相關(guān)性，膠原蛋白含量較多的組織和品種其表達(dá)量較高，即COL3A1基因表達(dá)水平越高，膠原蛋白含量越多；LOX是膠原蛋白分子間形成共價交聯(lián)的關(guān)鍵性酶，其mRNA表達(dá)水平直接影響著膠原蛋白分子交聯(lián)程度，表達(dá)水平越高，HP 和LP 交聯(lián)含量越多，本實(shí)驗(yàn)中LOX基因mRNA 表達(dá)量在皮下脂肪中宗地花豬最低，其交聯(lián)含量也是最低，但在肌肉卻呈現(xiàn)不一樣的規(guī)律，這除了與組織本身膠原蛋白含量及品種有關(guān)外，還有可能和脂肪沉積有一定關(guān)系，脂肪沉積可能對LOX基因表達(dá)具有調(diào)控作用，但具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

3 個豬種膠原蛋白含量皮下脂肪組織均高于背最長肌，與柯樂豬和杜大長雜交豬相比，宗地花豬2 個組織膠原蛋白含量較高，而交聯(lián)含量卻較低，HP 在皮下脂肪組織中宗地花豬顯著低于柯樂豬和杜大長雜交豬，LP 含量在背最長肌中宗地花豬含量最低，表明宗地花豬交聯(lián)含量越低，其熱穩(wěn)定性差，熱溶解性較強(qiáng)，嫩度較好。COL3A1的表達(dá)與膠原蛋白含量呈正相關(guān)，即膠原蛋白含量越多，其表達(dá)水平越高；LOX的表達(dá)對HP和LP 交聯(lián)含量有重要影響，其表達(dá)水平越高，交聯(lián)越多，嫩度就越差。