酶輔助發(fā)酵生產(chǎn)右旋糖酐

常國煒，梁達(dá)奉，柳穎，黎志德，張九花

廣東省科學(xué)院生物工程研究所，中國輕工業(yè)甘蔗制糖工程技術(shù)研究中心，廣東省酶制劑與生物催化工程技術(shù)研究中心（廣州 510316）

右旋糖酐是由某些微生物（如腸膜明串珠菌，Leuconostoc mesenteroides）發(fā)酵蔗糖產(chǎn)生的聚D-葡萄糖，其合成機(jī)理是微生物分泌右旋糖酐蔗糖酶（EC 2.4.1.5）催化蔗糖生成右旋糖酐和副產(chǎn)物果糖，是一條經(jīng)典的蔗糖深加工路徑[1]。不同分子質(zhì)量的右旋糖酐有不同的應(yīng)用[2]，但都不乏在食品方面的應(yīng)用[3-9]，其中分子質(zhì)量在千和萬數(shù)量級的右旋糖酐（以下稱為低分子質(zhì)量右旋糖酐）具有益生元作用[10]。低分子質(zhì)量右旋糖酐傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵效率低，目標(biāo)產(chǎn)物比例不高，常伴有大量分子質(zhì)量更高的右旋糖酐，因此發(fā)酵后需高溫酸解大分子質(zhì)量右旋糖酐，提高目標(biāo)產(chǎn)物比例后再用氫氧化鈉中和。“發(fā)酵-酸解-中和”三步法工藝不僅耗費(fèi)大量危險(xiǎn)化學(xué)品，還使體系引入氯離子和鈉離子，增加純化難度；酸解過程需保持高溫，對設(shè)備要求高、損耗大、能耗高。針對該工藝，已有不同的改進(jìn)方案，利用右旋糖酐酶（EC 3.2.1.11）酶解代替鹽酸酸解[11]，可形成“發(fā)酵-酶解”二步法工藝，在一定程度上優(yōu)化了流程，但未能解決發(fā)酵效率低的問題；利用酶法合成低分子質(zhì)量右旋糖酐[12-14]，但已脫離傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)范疇，企業(yè)改造和應(yīng)用成本較高。在發(fā)酵過程中添加右旋糖酐酶輔助發(fā)酵，形成“酶輔助發(fā)酵”一步法工藝，極大地優(yōu)化流程，同時(shí)達(dá)到提高發(fā)酵效率和目標(biāo)產(chǎn)物比例的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸膜明串珠菌（編號GIM1.473，廣東省微生物菌種保藏中心）；右旋糖酐酶酶液（酶活2.053×104U/mL，廣東省科學(xué)院生物工程研究所提供）；右旋糖酐分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品（American Polymer Standards Corporation）；蔗糖、果糖、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、無水乙醇、無水硫酸鈉、疊氮化鈉（國產(chǎn)分析純）；細(xì)菌學(xué)蛋白胨（國產(chǎn)生化試劑）。

1.2 設(shè)備與儀器

LC-20A高效液相色譜儀（日本SHIMADZU）；Shodex SUGAR KS-803、ShodexOHpak SB-806M HQ高效液相色譜填充柱（日本昭和電工株式會(huì)社）；GRJB-5D發(fā)酵系統(tǒng)（鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司）；等。

1.3 傳統(tǒng)發(fā)酵和酶輔助發(fā)酵的對比

1.3.1 傳統(tǒng)發(fā)酵操作

培養(yǎng)基：配制含蔗糖、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀分別為13，0.2，0.14和0.03 g/dL的溶液。

一級種子液：將40 mL培養(yǎng)基倒入100 mL三角瓶中，于121 ℃、20 min滅菌。接兩環(huán)斜面上的菌種到三角瓶中，在搖床中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)條件：轉(zhuǎn)速100 r/min、溫度26 ℃。得到一級種子液。

二級種子液：將360 mL培養(yǎng)基倒入500 mL三角瓶中，按照以上步驟滅菌。將一級種子液倒入三角瓶中，在搖床中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件：轉(zhuǎn)速100 r/min、溫度26 ℃。得到二級種子液。

傳統(tǒng)發(fā)酵：將3.6 L培養(yǎng)基倒入發(fā)酵罐中，于121℃、20 min滅菌。將二級種子液倒入發(fā)酵罐中，轉(zhuǎn)速100 r/min，以0.5 mol/L NaOH溶液作為酸堿調(diào)節(jié)液，控制pH 6.5。發(fā)酵過程適時(shí)取樣，按1.3.3測定蔗糖和果糖含量、醇沉物量、發(fā)酵液黏度以及右旋糖酐分子質(zhì)量分布等指標(biāo)。結(jié)束發(fā)酵的標(biāo)志為蔗糖轉(zhuǎn)化率超過90%。

1.3.2 酶輔助發(fā)酵操作

培養(yǎng)基、一級種子液、二級種子液同1.3.1小節(jié)。酶輔助發(fā)酵：在發(fā)酵至12 h時(shí)，加入一定量右旋糖酐酶酶液，其余操作同1.3.1小節(jié)。

1.3.3 分析方法

1.3.3.1 蔗糖、果糖的測定

將蔗糖和果糖置于96 ℃烘箱中干燥2 h[15]，用超純水配制質(zhì)量濃度分別為0.6，1.2，1.8，2.4和3.0 g/dL的蔗糖和果糖溶液，用液相色譜進(jìn)行測定，色譜條件：以經(jīng)0.45 μm膜過濾的超純水為流動(dòng)相；Shodex SUGAR KS-803色譜柱；柱溫50 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測器為示差折光檢測器。以峰高對濃度制得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程（過原點(diǎn)）。蔗糖標(biāo)曲為h=70191c，R2＞0.9999；果糖標(biāo)曲為h=61006c，R2＞0.9999。

將發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)（V/V），經(jīng)0.45 μm膜過濾后按上述條件進(jìn)行液相色譜分析，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋倍數(shù)計(jì)算出蔗糖、果糖含量。

1.3.3.2 醇沉物質(zhì)量的測定

取3 mL發(fā)酵液，加入6 mL無水乙醇，劇烈振蕩后，以8000 r/min離心5 min，棄上清液，用濾紙輕輕吸干管內(nèi)壁和沉淀表面液體，得出醇沉物的質(zhì)量。

1.3.3.3 黏度的測定

加入發(fā)酵液至10 mL ep管的管口，倒置ep管使液體流出，待液體流出至10 s無液滴滴出，測得殘留在管內(nèi)的液體質(zhì)量，用該質(zhì)量代表發(fā)酵液黏稠程度。設(shè)定：小于0.08 g，為低黏度；0.08～0.24 g，為中黏度；大于0.24 g，為高黏度。

1.3.3.4 右旋糖酐分子質(zhì)量分布的測定

測定方法為高效液相色譜法，具體步驟和條件參照文獻(xiàn)[16]。所用色譜柱為Shodex OHpak SB-806M HQ色譜柱，理論板數(shù)計(jì)算公式見式1（源于色譜柱使用說明書）。經(jīng)試驗(yàn)，得出理論板數(shù)為N=5.54×（21.300÷0.494）2=10299＞5000，說明柱子效能正常，可用于右旋糖酐分子質(zhì)量測定。分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品選用720000，95000，53000和43000 g/mol，得到分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線lgMW=-0.6857tR+16.80。用兩倍濃度的流動(dòng)相稀釋發(fā)酵液2倍后進(jìn)行測定。

式中：N為理論板數(shù)；tR為出峰時(shí)間，min；W為半峰寬度，min。

1.4 酶輔助發(fā)酵不同加酶方案對產(chǎn)物的影響

酶輔助發(fā)酵操作按1.3.2小節(jié)進(jìn)行，其中加酶方案按表1進(jìn)行；右旋糖酐分子質(zhì)量分布的測定按1.3.3.4小節(jié)進(jìn)行。

表1 酶輔助發(fā)酵不同加酶方案 單位：μL

2 結(jié)果與討論

2.1 傳統(tǒng)發(fā)酵和酶輔助發(fā)酵的對比分析

由圖1～圖3可知，兩種發(fā)酵工藝前12 h的情況是相同的。前10 h蔗糖含量變化不大，蔗糖轉(zhuǎn)化率處于較低水平（約5%），果糖和醇沉物量也沒有明顯變化，說明各主要成分均無明顯變化，是典型的微生物生長遲緩期。到了12 h，蔗糖轉(zhuǎn)化率提高至11.9%，說明在10～12 h，碳源利用速度加快。此時(shí)果糖和醇沉物量仍無明顯變化，可能是因?yàn)樘荚粗饕糜诰w生長繁殖，用于合成右旋糖酐的右旋糖酐蔗糖酶未大量分泌，所以右旋糖酐未被大量合成，副產(chǎn)物果糖未大量生成。前12 h的發(fā)酵液黏度處于低黏度階段（如表2所示），因?yàn)榫w和右旋糖酐的含量均較低，此時(shí)黏度主要來源應(yīng)是蔗糖。

圖1 兩種工藝蔗糖轉(zhuǎn)化率對比

圖2 兩種工藝果糖增量

圖3 兩種工藝醇沉物質(zhì)量對比

兩種發(fā)酵工藝主要區(qū)別在發(fā)酵12 h后。通過圖2和圖3可知，傳統(tǒng)發(fā)酵至14 h，果糖量和醇沉物量有明顯上升，說明右旋糖酐開始被大量合成。從蔗糖加速消耗至果糖、醇沉物量明顯上升有約2 h的時(shí)間差，這可認(rèn)為是微生物從生長遲緩期慢慢進(jìn)入酶系活躍、代謝旺盛的對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)變特征。與此同時(shí)，發(fā)酵液黏度增加到中等黏度。

發(fā)酵至20 h，蔗糖轉(zhuǎn)化率達(dá)50%，醇沉物量和果糖量不斷增大，意味著右旋糖酐含量不斷增大。在取樣過程中可明顯感到流動(dòng)性變差，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，難以使用如移液管、移液槍等工具準(zhǔn)確量取體積，發(fā)酵液黏度達(dá)到了高黏度階段。到了28 h，蔗糖轉(zhuǎn)化率達(dá)89.6%，從圖1可看出蔗糖轉(zhuǎn)化開始減慢；到29 h，蔗糖轉(zhuǎn)化率達(dá)91.2%，結(jié)束發(fā)酵，估算出蔗糖轉(zhuǎn)化率達(dá)90%的時(shí)間約28.3 h。根據(jù)果糖增量可以計(jì)算出結(jié)束發(fā)酵時(shí)右旋糖酐產(chǎn)量（數(shù)據(jù)見表2），此時(shí)產(chǎn)物與底物比（發(fā)酵結(jié)束時(shí)的右旋糖酐生成量：蔗糖消耗量）為37.83%（理想最大值為47.37%，即蔗糖全部用于合成右旋糖酐）。

上述過程是傳統(tǒng)發(fā)酵的情況，而酶輔助發(fā)酵則是在12 h添加右旋糖酐酶，其直接作用的是水解發(fā)酵體系中的右旋糖酐的α-1,6糖苷鍵，降低其分子質(zhì)量。由圖1和圖2可知，在12 h后，酶輔助發(fā)酵蔗糖轉(zhuǎn)化率和果糖增速明顯高于傳統(tǒng)發(fā)酵，達(dá)90%的時(shí)間僅用25.0 h，比傳統(tǒng)發(fā)酵縮短3.3 h，即發(fā)酵周期縮短11.7%。通過表2可知，酶輔助發(fā)酵的低黏度期延長了6 h，并將中黏度期延長至發(fā)酵結(jié)束；在12～24 h，酶輔助發(fā)酵的蔗糖消耗速率和果糖增長速率分別提高了21.4%和18.2%；右旋糖酐產(chǎn)量提高了3.5%；產(chǎn)物與底物比增加2.64個(gè)百分點(diǎn)，至40.47%。綜上分析，酶輔助發(fā)酵由于右旋糖酐酶作用，使右旋糖酐分子質(zhì)量下降，發(fā)酵體系黏度降低，改善了發(fā)酵環(huán)境，提高了底物利用效率和產(chǎn)物生成效率。

表2 兩種發(fā)酵工藝數(shù)據(jù)對比

從圖3可知，發(fā)酵25 h時(shí)，兩個(gè)工藝醇沉物量相差不大，是由于1.3.3.2小節(jié)所用的乙醇量不大，比例為1∶2（發(fā)酵液∶無水乙醇），且沉淀時(shí)間較短，這均不利于低分子質(zhì)量右旋糖酐沉淀析出。所以看似相近的數(shù)據(jù)，實(shí)際上酶輔助發(fā)酵的右旋糖酐量應(yīng)該更多。

2.2 傳統(tǒng)發(fā)酵和酶輔助發(fā)酵產(chǎn)物分子質(zhì)量分布對比

表3詳細(xì)地列出了不同發(fā)酵工藝和加酶方案發(fā)酵結(jié)束時(shí)產(chǎn)物分子質(zhì)量分布情況，不同數(shù)量級的比例為高效液相色譜圖中對應(yīng)保留時(shí)間區(qū)間積分面積的比例，表3中所有數(shù)據(jù)均沒有將百級的產(chǎn)物納入統(tǒng)計(jì)和計(jì)算。傳統(tǒng)發(fā)酵所得右旋糖酐分布極分散，最高達(dá)千萬級。低分子質(zhì)量右旋糖酐比例只有54.2%，還有45.8%的大分子質(zhì)量右旋糖酐，這部分右旋糖酐發(fā)酵液黏度增大，影響發(fā)酵效率，且不僅無法直接利用，還需要通過“酸解-中和”工序或“酶解”工序進(jìn)行水解來提高目標(biāo)產(chǎn)物比例，所需水解條件較強(qiáng)[17]。

表3 各工藝產(chǎn)物分子質(zhì)量分布

酶輔助發(fā)酵中，右旋糖酐酶添加量僅為每升發(fā)酵液幾至十幾微升酶液，發(fā)酵結(jié)束時(shí)目標(biāo)產(chǎn)物比例上升至86%～99%，僅含比例不高的十萬級右旋糖酐，分散系數(shù)從74.96下降至5以下，效果極顯著。根據(jù)式（2）可以計(jì)算出右旋糖酐酶的有效水解數(shù)，不同方案的有效水解效率有所差異，均值為0.0238×10-3NA/（h·μL酶液），該數(shù)據(jù)可指導(dǎo)酶輔助發(fā)酵加酶量控制。

式中：n為有效水解數(shù)；NA為阿伏伽德羅常量；m為右旋糖酐質(zhì)量，g；M1為水解前右旋糖酐數(shù)均分子質(zhì)量，g/mol；M2為水解后右旋糖酐數(shù)均分子質(zhì)量，g/mol；18為水的摩爾質(zhì)量，g/mol。

根據(jù)方案2和方案4的數(shù)據(jù)可知，在一次加酶輔助發(fā)酵基礎(chǔ)上，在24 h再次加入酶液，可形成二次加酶輔助發(fā)酵工藝。通過有效水解數(shù)可計(jì)算出，二次加酶輔助發(fā)酵工藝最后1 h平均酶解效率達(dá)0.112×10-3NA/（h·μL酶液），是一次加酶輔助發(fā)酵的4.7倍，說明該工藝可在結(jié)束發(fā)酵前1 h進(jìn)一步調(diào)節(jié)右旋糖酐分子質(zhì)量分布，為生產(chǎn)帶來一定的靈活性。綜上，酶輔助發(fā)酵僅需極少量右旋糖酐酶液，就能顯著提高目標(biāo)產(chǎn)物比例，大幅降低分散系數(shù)，使產(chǎn)物分子質(zhì)量更加集中，并可通過多次加酶靈活調(diào)節(jié)產(chǎn)物分子質(zhì)量分布。

3 結(jié)論

在發(fā)酵生產(chǎn)低分子質(zhì)量右旋糖酐過程中，添加極少量右旋糖酐酶，可形成“酶輔助發(fā)酵”工藝。酶輔助發(fā)酵中，右旋糖酐酶能高效水解大分子質(zhì)量右旋糖酐，降低發(fā)酵液黏度，改善發(fā)酵環(huán)境，從而提高發(fā)酵效率，使蔗糖轉(zhuǎn)化率達(dá)90%的發(fā)酵周期比傳統(tǒng)發(fā)酵縮短11.7%，右旋糖酐產(chǎn)量提高3.5%，目標(biāo)產(chǎn)物比例提高至90%以上，且分布集中。多次加酶輔助發(fā)酵還可靈活控制產(chǎn)物分子質(zhì)量分布。酶輔助發(fā)酵省去傳統(tǒng)發(fā)酵后續(xù)的酸解和中和工段，極大地優(yōu)化流程，達(dá)到節(jié)能減排的目的。