美國(guó)白蛾熱激蛋白70基因的鑒定及功能分析

喬 恒, 李 慧, 耿薏舒, 趙旭東, 于曉航, 郝德君,*

(1.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 南京 210037; 2.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 南京 210037)

美國(guó)白蛾Hyphantriacunea屬鱗翅目(Lepidoptera)燈蛾科(Arctiidae)，是一種寄主范圍廣、繁殖力強(qiáng)、適生性強(qiáng)、危害嚴(yán)重的世界性檢疫害蟲(chóng)(季榮等, 2003)。自1979年首次在我國(guó)遼寧省丹東地區(qū)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，至2019年已經(jīng)擴(kuò)散至北京、天津、河北、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、江蘇、安徽、山東、湖北、河南、湖北、陜西共13個(gè)省(區(qū)、市)的近600個(gè)縣級(jí)行政區(qū)(國(guó)家林業(yè)和草原局2020年第3號(hào)公告)，對(duì)我國(guó)的林木資源及相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期外界溫度脅迫下，進(jìn)化出復(fù)雜而多樣的行為、生理生化及分子機(jī)制去抵御外界不利的溫度(Maetal., 2021)，其中熱激蛋白(heat shock protein, HSP)在昆蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用。熱激蛋白又稱熱休克蛋白，是一種物種間和進(jìn)化上均高度保守的蛋白質(zhì)(王宇萍和蔣建東, 2010)。當(dāng)生物體遭遇極端溫度、饑餓脅迫、氧化脅迫、重金屬脅迫時(shí)，會(huì)優(yōu)先轉(zhuǎn)錄該蛋白，引導(dǎo)其他蛋白質(zhì)的正確折疊，幫助生物體抵御不良環(huán)境(Zhao and Jones, 2012)。關(guān)于熱激蛋白的分類，不同的學(xué)者有不同的分類方式，但普遍采納根據(jù)蛋白分子量大小將HSP分為以下5個(gè)家族：HSP110, HSP90, HSP70, HSP60和sHSP(Watersetal., 1996)。其中HSP70作為熱激蛋白家族的重要組成部分，一直備受國(guó)內(nèi)外關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，熱激蛋白70家族主要包括誘導(dǎo)型熱激蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)和組成型熱激蛋白70(heat shock cognate protein 70, HSC70)兩種類型(Simoncellietal., 2010)。HSP70序列由N端保守的ATPase功能域及C端的底物結(jié)合功能域構(gòu)成(Flahertyetal., 1990)。N端的ATPase功能域可水解ATP，C端的底物結(jié)合功能域可與未折疊的多肽底物暴露在外的疏水區(qū)域特異性相結(jié)合(Kangetal., 1990; Nelsonetal., 1992)。許多學(xué)者分別對(duì)煙草天蛾Manducasexta(Marinetal., 1994)、二化螟Chilosuppressalis(崔亞?wèn)|等, 2010)、舞毒蛾Lymantriadispar(Whyardetal., 1986)、粉紋夜蛾Trichoplusiani(Seversonetal., 2005)和葉色草蛉Chrysopaphyllochroma(劉璐, 2014)等昆蟲(chóng)的HSP70基因序列進(jìn)行克隆，并發(fā)現(xiàn)其在抵御高溫脅迫中發(fā)揮重要作用。楊廣生等(2020)基于基因組數(shù)據(jù)，篩選了4條美國(guó)白蛾HSP70基因，并推測(cè)其中一條基因在水解ATP中發(fā)揮著重要作用，但未闡明HSP70基因在美國(guó)白蛾高溫脅迫響應(yīng)中的功能。

在我國(guó)，美國(guó)白蛾呈現(xiàn)不斷向南擴(kuò)散的趨勢(shì)，而在南方地區(qū)，夏季溫度常達(dá)35～40℃(中國(guó)天氣網(wǎng)http:∥www.weather.com.cn/)。由此可見(jiàn)，美國(guó)白蛾在擴(kuò)散的過(guò)程中，不可避免地遭受高溫脅迫，而目前關(guān)于美國(guó)白蛾高溫脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制研究尚屬空白。因此，本研究以美國(guó)白蛾HSP70基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)基因克隆、高溫脅迫下的表達(dá)特性分析、原核表達(dá)及純化及ATPase活性測(cè)定等技術(shù)，探究HSP70基因在美國(guó)白蛾高溫脅迫響應(yīng)中的功能，為美國(guó)白蛾發(fā)生區(qū)域的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及其他昆蟲(chóng)HSP的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)于2019年6月采自江蘇省淮安市楚州區(qū)古城墻遺址公園(33.62°N, 119.02°E)，帶回實(shí)驗(yàn)室后利用人工飼料進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：溫度26±1℃，相對(duì)濕度65%±5%，光周期16L∶8D。成蟲(chóng)羽化后，提供30%蜂蜜水。以室內(nèi)飼養(yǎng)的第2代4齡幼蟲(chóng)作為實(shí)驗(yàn)用蟲(chóng)。

選取新蛻皮的美國(guó)白蛾4齡第2天幼蟲(chóng)，分別在25(對(duì)照), 30, 35和40℃下處理1, 2和3 h，每3頭幼蟲(chóng)混合作為一個(gè)樣本，每個(gè)處理均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。所有的樣本均用1.5 mL的無(wú)核酶離心管保存，轉(zhuǎn)至液氮中速凍，再置于-80℃冰箱中保存用于后續(xù)RNA提取及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2 美國(guó)白蛾總RNA的提取和cDNA的合成

利用Trizol法提取1.1節(jié)中保存樣本的總RNA，通過(guò)微量紫外分光光度儀(NanoDrop ND-2000, Thermo, 美國(guó))和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度。選擇凝膠電泳條帶清晰明亮且OD260/OD280值在1.8～2.0之間的mRNA樣品，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase(Vazyme, 南京)的步驟，合成cDNA模板。

1.3 美國(guó)白蛾熱激蛋白70基因的克隆

基于美國(guó)白蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，未發(fā)表)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物HSP70-F1/HSP70-R1和HSC70-F1/HSC70-R1(表1)，引物由南京金斯瑞生物公司合成。以1.2節(jié)中合成的美國(guó)白蛾4齡幼蟲(chóng)cDNA為模板，利用LA Taq聚合酶(TaKaRa, 大連)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL): dNTP Mix(2.5 mmol/L)8 μL, 10×PCR Buffer 5 μL, Mg2+(25 mmol/L)5 μL, 上下游引物(10 pmol/L)各1 μL, cDNA模板(500 μg/μL)1 μL, LA Taq(5 U/μL)0.5 μL, ddH2O 28.5 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃ 3 min; 98℃ 10 s, 50℃ 15 s, 72℃ 2 min，循環(huán)35次; 72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并且通過(guò)DNA回收試劑盒(TIANGEN, 北京)純化，連接至T/A Blunt Vector載體后，導(dǎo)入大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(Vazyme, 南京)，在含有氨芐青霉素的LB瓊脂板上過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆于LB液體培養(yǎng)基中37℃ 200 r/min孵育2 h，再進(jìn)行菌液PCR鑒定。將驗(yàn)證正確的菌液送至杰李(上海)生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.4 生物學(xué)信息學(xué)分析

利用分子生物學(xué)軟件DNAMAN8.0進(jìn)行序列的對(duì)比和拼接，信號(hào)肽預(yù)測(cè)利用SignalP在線網(wǎng)站(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)，等電點(diǎn)及分子質(zhì)量預(yù)測(cè)利用在線網(wǎng)站(https:∥web.expasy.org/protparam/)，蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用在線網(wǎng)站SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)。利用在線工具NCBI(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索鱗翅目中已知昆蟲(chóng)的熱激蛋白70基因序列，利用Clustalx軟件進(jìn)行序列對(duì)比，同源搜索鱗翅目、鞘翅目、半翅目、膜翅目、雙翅目共5個(gè)目41種的HSP70和HSC70氨基酸序列，用MEGA 7.0軟件結(jié)合鄰接法(neighbor-joining method, NJ)進(jìn)行1 000次抽樣分析來(lái)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，并用在線軟件iTOL(https:∥itol.embl.de/)進(jìn)行修飾。

1.5 qPCR檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)選擇EF1α作為美國(guó)白蛾4齡幼蟲(chóng)不同溫度處理下基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因(陶蓉等, 2019)，內(nèi)參基因的擴(kuò)增引物為EF1α-F/EF1α-R(表1)。根據(jù)1.3節(jié)中克隆獲得的HSP70基因序列，利用在線網(wǎng)站(https:∥www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool)設(shè)計(jì)并篩選qPCR引物HSP70-qF/HSP70-qR和HSC70-qF/HSC70-qR(表1)。qPCR反應(yīng)在Applied Biosystem 7500 System(Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))上進(jìn)行，反應(yīng)體系(20 μL): SYBR Green Master Mix(YEASEN, 上海)10 μL, 上下游引物(10 pmol/L)各0.4 μL, cDNA模板2 μL, RNase-free H2O 7.2 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 5 min; 95℃ 10 s, 60℃ 40 s，循環(huán)40次; 95℃ 15 s, 60℃ 60 s, 95℃ 15 s形成溶解曲線。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)及3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.6 美國(guó)白蛾熱激蛋白70的重組表達(dá)與純化

利用CE Design軟件(Vazyme, 南京)設(shè)計(jì)美國(guó)白蛾熱激蛋白70基因序列的原核表達(dá)引物(HSP70-tPCR-F和HSP70-tPCR-R, 表1)，引物包含NheⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。同1.3節(jié)中操作步驟，引物更換為HSP70-tPCR-F和HSP70-tPCR-R，獲得原核表達(dá)的DNA模板，隨后將其與線性化的pET-28a載體通過(guò)ClonExpress II一步克隆試劑盒(Vazyme, 南京)同源連接，并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素的LB瓊脂板上過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR，送至杰李(上海)生物技術(shù)公司測(cè)序。

表1 本研究所用引物

測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21(Vazyme, 南京)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行蛋白表達(dá)。次日挑選單克隆將其轉(zhuǎn)移至含卡那霉素(30 μg/mL)的100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，然后孵育至OD600=0.5，將異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(Sango, 上海)添加至最終濃度為1 mmol/L，并在30℃ 200 r/min條件下過(guò)夜孵育12 h。在4℃ 11 000 r/min離心15 min得到菌液沉淀，并加入平衡緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4和Na2HPO4, 300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L咪唑, pH 7.9)，攪拌并通過(guò)在冰水中超聲處理破壞混合物。在4℃ 12 000 r/min離心20 min后，獲得上清。重組蛋白通過(guò)His60 Ni Superflow樹(shù)脂和重力柱(TaKaRa, 北京)純化，純化的重組蛋白用7.5% SDS-PAGE凝膠分析。

1.7 免疫印跡分析

以1.6節(jié)純化的HcHSP70蛋白作為抗原，取20 μL蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm的PVDF膜。用5%脫脂奶粉溶液封閉，將膜置于含His-tag抗體(Beyotime, 上海)的一抗孵育液中4℃孵育過(guò)夜，用TBST緩沖液洗膜，然后將膜轉(zhuǎn)入含有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔IgG的二抗孵育液(Beyotime, 上海)中，室溫輕搖孵育1～2 h，洗膜后將膜置于West Pico ECL(Biosharp, 武漢)顯色拍照。

1.8 美國(guó)白蛾熱激蛋白70的酶活性測(cè)定

采用Zhang等(2018)的方法測(cè)定熱激蛋白70的酶活性。配制100 μL反應(yīng)體系，包含2.0 μg HcHSP70/BSA/ddH2O, 1.0 mmol/L Bistris, 1.0 mmol/L KCl, 0.1 mmol/L MgCl2和0.01 mmol/L ATP，其中添加BSA/ddH2O為對(duì)照。將反應(yīng)混合物在25, 30, 35和40℃下孵育10 min后，加入10 μL 55% HClO4終止反應(yīng)。將混合物放置冰上10 min，然后以12 000 r/min 離心3 min。最后，用微量組織無(wú)機(jī)磷含量測(cè)定試劑盒(Solarbio, 北京)確定無(wú)機(jī)磷的濃度。熱激蛋白70的酶活性定義為1 min內(nèi)1 mg HcHSP70催化的無(wú)機(jī)磷的產(chǎn)生量(μmol/min·mg)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用IBM SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用單因素分析法中的Duncan氏多重檢驗(yàn)法對(duì)高溫處理下美國(guó)白蛾熱激蛋白70基因相對(duì)表達(dá)量及不同溫度下HcHSP70重組蛋白的ATP酶活性進(jìn)行差異顯著性分析，差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 美國(guó)白蛾HSP70基因的克隆以及序列

克隆獲得美國(guó)白蛾2條HSP70基因HcHSP70(GenBank登錄號(hào): MT995848)和HcHSC70(GenBank登錄號(hào): MT261583)，其ORF長(zhǎng)度分別為1 917和2 061 bp，分別編碼637和687個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量分別約為69.66和74.96 kD，等電點(diǎn)分別為5.90和5.96。HcHSP70與HcHSC70氨基酸序列中存在HSP70家族中3個(gè)高度保守的區(qū)域GIDLGTTYS, IFDLGGGTFDVSIL和VGGSTRIPKVQ。并具有由AEAYLGKS組成的ATP-GTP結(jié)合位點(diǎn)及由PRALRRLRTAAERAKRTL組成的核定位信號(hào)標(biāo)簽和非細(xì)胞器基序RARFEEL的3個(gè)典型特征也高度保守(圖1)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)HcHSP70位于細(xì)胞質(zhì)中，HcHSC70位于線粒體中。

圖1 美國(guó)白蛾HcHSP70和HcHSC70與其他鱗翅目昆蟲(chóng)HSP70氨基酸序列對(duì)比

利用SWISS-MODEL工具建模，HcHSP70與模板的一致性為53.86%，HcHSC70與模板的一致性為62.27%。預(yù)測(cè)的美國(guó)白蛾HcHSP70和HcHSC70蛋白的三維結(jié)構(gòu)與其他物種熱激蛋白70的三維結(jié)構(gòu)高度相似。如圖2所示，HcHSP70和HcHSC70的三維結(jié)構(gòu)均是由N端ATPase功能域和C端底物結(jié)合功能域所組成。

圖2 美國(guó)白蛾HcHSC70(A)和HcHSP70(B)的SWISS-MODEL三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型

如圖3系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)所示：HcHSP70和HcHSC70分別屬于兩個(gè)分支，HcHSP70與鱗翅目HSP70家族的其他成員聚為一支，HcHSC70與鱗翅目HSC70家族的其他成員聚為另一支。此外，鞘翅目、半翅目、膜翅目及雙翅目各目的熱激蛋白70序列同樣分為HSP70及HSC70兩個(gè)分支。

圖3 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的美國(guó)白蛾和其他昆蟲(chóng)HSP70系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(1 000次重復(fù))

2.2 高溫脅迫下美國(guó)白蛾熱激蛋白70基因的相對(duì)表達(dá)量

從圖4(A)中可以看出，美國(guó)白蛾4齡幼蟲(chóng)在30, 35和40℃下分別處理1, 2和3 h,HcHSP70的表達(dá)量與對(duì)照(25℃)相比顯著上調(diào)：在1 h時(shí)，隨著溫度的升高，HcHSP70基因的相對(duì)表達(dá)量持續(xù)上升；在35℃ 2 h時(shí)，相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，約為對(duì)照組的183.70倍；但在35和40℃處理3 h時(shí)，相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比則無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

由圖4(B)可知，與對(duì)照組(25℃)相比，HcHSC70在每個(gè)溫度梯度、不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比無(wú)顯著性差異，如在40℃下3 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高，為對(duì)照組的4.76倍，但與對(duì)照相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖4 高溫處理不同時(shí)間后美國(guó)白蛾4齡第2天幼蟲(chóng)中HcHSP70(A)和HcHSC70(B)的相對(duì)表達(dá)量

2.3 美國(guó)白蛾熱激蛋白70的重組表達(dá)與純化

HcHSP70重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)SDS-PAGE分析表明，在69.66 kD處檢測(cè)到一條明顯的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白條帶，而pET-28a空載體則無(wú)相應(yīng)的條帶，這與預(yù)測(cè)的分子量大小一致(圖5)。使用Ni2+-His柱進(jìn)一步純化可溶性重組蛋白，并且純化的HcHSP70的濃度為1.7 mg/mL。通過(guò)重組蛋白HcHSP70與His-tag抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表明HcHSP70基因已經(jīng)在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中正確表達(dá)。

圖5 重組蛋白HcHSP70的SDS-PAGE分析

2.4 高溫下HcHSP70蛋白的ATPase活性

在25, 30, 35和40℃的溫度下測(cè)定純化的HcHSP70的ATPase活性分別為27.3039, 25.5823, 23.8551和26.2028 μmol/min·mg pro，高于BSA/ddH2O對(duì)照組的活性(圖6)。而且，隨著溫度的升高，HcHSP70蛋白的ATPase活性在不同溫度處理之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

本研究利用PCR技術(shù)首次在美國(guó)白蛾中克隆出2條熱激蛋白70家族基因的cDNA序列，分別命名為HcHSP70和HcHSC70。氨基酸序列分析表明，這2條基因具備HSP70家族保守的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并具有3個(gè)HSP70蛋白家族的簽名序列(Gupta, 1995)和3個(gè)真核細(xì)胞特征基序(圖1)。亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示HcHSP70定位于細(xì)胞質(zhì)中，HcHSC70定位于線粒體中。線粒體作為真核細(xì)胞的重要“能量工廠”，是細(xì)胞進(jìn)行呼吸等細(xì)胞代謝的主要場(chǎng)所(孫飛等, 2008)，所以推測(cè)HcHSC70可能參與了高溫下細(xì)胞的代謝過(guò)程。

熱激蛋白70家族分為誘導(dǎo)型HSP70和組成型HSC70兩種類型(Zhangetal., 2011)，前者在正常生理狀態(tài)下表達(dá)量極低，脅迫后大量上調(diào)；后者正常條件下含量較高，受到脅迫后僅微量上調(diào)或不上調(diào)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，不同鱗翅目昆蟲(chóng)的誘導(dǎo)型HSP70之間同源性高于同屬于美國(guó)白蛾的HcHSP70和HcHSC70之間的同源性，不同鱗翅目昆蟲(chóng)的組成型HSC70之間的同源性同樣高于同屬于美國(guó)白蛾的HcHSP70和HcHSC70之間的同源性(圖3)。這表明雖然誘導(dǎo)型HSP70和組成型HSC70的序列結(jié)構(gòu)特征十分相似，但熱激蛋白70基因在昆蟲(chóng)進(jìn)化的早期已經(jīng)出現(xiàn)兩支，使得HSP70和HSC70各自在不同物種間的同源性更高(Delelis-Fanienetal., 1997)。

熱激蛋白70基因在轉(zhuǎn)錄水平參與美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)的熱脅迫響應(yīng)。美國(guó)白蛾4齡幼蟲(chóng)在熱激處理1 h后，HcHSP70的表達(dá)量上調(diào)，并且與溫度梯度呈正相關(guān)，在35℃處理2 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值(圖4: A)；而HcHSP70在熱激條件下僅微量上調(diào)或不上調(diào)(圖4: B)，暗示了HcHSP70在美國(guó)白蛾抵御熱脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。但HSP70的上調(diào)表達(dá)存在極限，如在40℃下2和3 h時(shí)HcHSP70表達(dá)量并沒(méi)有上調(diào)。這種現(xiàn)象與其他昆蟲(chóng)熱激蛋白的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)特性一致，如松墨天牛Monochamusalternatus的MaltHSP21.20在45℃時(shí)表達(dá)量最高，而在50℃處理組中相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(李慧等, 2018)；煙粉虱Bemisiatabaci在41℃時(shí)HSP70基因表達(dá)量最高，在43和45℃時(shí)表達(dá)水平迅速降低(崔旭紅等, 2007)。這些結(jié)果表明，昆蟲(chóng)熱激蛋白70對(duì)轉(zhuǎn)錄響應(yīng)存在極限，一方面原因是當(dāng)外界環(huán)境溫度過(guò)高時(shí)，會(huì)破壞昆蟲(chóng)體內(nèi)的正常生理狀況；另一方面熱激蛋白70過(guò)量的表達(dá)可能會(huì)影響昆蟲(chóng)正常的生長(zhǎng)發(fā)育，從而對(duì)許多生理過(guò)程如生殖等帶來(lái)負(fù)面影響(Krebs and Feder, 1997)。

本研究在對(duì)HcHSP70重組表達(dá)與純化的基礎(chǔ)上進(jìn)行分子伴侶功能分析，發(fā)現(xiàn)HcHSP70在25, 30, 35和40℃下具有高且穩(wěn)定的ATPase活性(圖6)。對(duì)松墨天牛的MaltHSP70-2研究中也得到相似結(jié)果(Lietal., 2020)。高溫脅迫下穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象是HSP70發(fā)揮分子伴侶功能的基礎(chǔ)，推測(cè)HcHSP70蛋白在美國(guó)白蛾應(yīng)對(duì)熱脅迫中發(fā)揮著重要作用(趙超越, 2016)。但是本研究?jī)H限于體外表達(dá)重組蛋白來(lái)驗(yàn)證HcHSP70具有穩(wěn)定的ATPase活性，還需要通過(guò)RNA干擾或者基因編輯技術(shù)進(jìn)一步探究HcHSP70蛋白在美國(guó)白蛾抵御高溫脅迫中的作用。

本研究克隆獲得2條美國(guó)白蛾HSP70基因HcHSP70和HcHSC70，序列分析表明2條基因的編碼蛋白均符合熱激蛋白70家族的結(jié)構(gòu)特征，并且亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)位于不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中；檢測(cè)了其在高溫處理下mRNA的相對(duì)表達(dá)量，表明HcHSP70和HcHSC70參與了美國(guó)白蛾抵御高溫脅迫的過(guò)程。此外，通過(guò)原核表達(dá)及純化獲得美國(guó)白蛾HSP70蛋白，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明重組蛋白HcHSP70在高溫處理下具有穩(wěn)定的ATPase活性，進(jìn)一步暗示HcHSP70是影響美國(guó)白蛾耐熱性的重要基因，可以為揭示美國(guó)白蛾的擴(kuò)散機(jī)制以及預(yù)測(cè)潛在分布區(qū)提供參考。