甜菜夜蛾半胱天冬酶基因的克隆及對細胞凋亡誘導劑和病原微生物感染的表達響應(yīng)

宋曉慧, 楊長錦, 黎 妮, 黃國華,*, 于 歡,*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學, 植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室, 長沙 410128; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 長沙 410128)

細胞凋亡是一個高度保守、由基因控制的細胞自主死亡過程。細胞凋亡的啟動會激活一類半胱天冬酶(caspase)，它們是細胞凋亡過程中的重要調(diào)節(jié)者和參與者。半胱天冬酶家族分為兩組：炎性半胱天冬酶和凋亡半胱天冬酶，后者由起始半胱天冬酶(initiator caspase)和效應(yīng)半胱天冬酶(effector caspase)組成(Donepadi and Grutter, 2002)。在一些哺乳動物中，起始半胱天冬酶主要包括caspase-2, caspase-8, caspase-9和caspase-10，效應(yīng)半胱天冬酶主要包括caspase-3, caspase-6和caspase-7。昆蟲中也有相應(yīng)的起始半胱天冬酶和效應(yīng)半胱天冬酶，模式物種黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的起始半胱天冬酶包括Dronc(Drosophila Nedd-2-like caspase), Dredd(death-related ced-3/Nedd2-like)和strica/dream(Ser/Thr-rich caspase)，效應(yīng)半胱天冬酶包括DrICE(death related ICE-like caspase), Decay(death executioner caspase related to Apo-pain/Yama), damm(death associated molecule related to Mch2 caspase)和Dcp-1(death caspase-1)。半胱天冬酶在細胞中以無活性的酶原形式存在，主要由N端結(jié)構(gòu)域(prodomain)、大亞基(p20)與小亞基(p10)組成。起始半胱天冬酶的激活發(fā)生在死亡信號傳遞后大亞基和小亞基之間特定的天冬氨酸殘基被切割后，被切割后的大亞基和小亞基緊密結(jié)合形成一個異源二聚體進而被活化(Nicholsonetal., 1999)。效應(yīng)半胱天冬酶的切割是由相應(yīng)的被活化的起始半胱天冬酶執(zhí)行的(Riedl and Shi, 2004)。

目前，幾種鱗翅目昆蟲半胱天冬酶被相繼報道，大多數(shù)與果蠅Dronc和Drice同源。家蠶Bombyxmori的Dronc同源物Bm-caspase-1具有一個長的含CARD的N端前結(jié)構(gòu)域(Suganumaetal., 2011)。舞毒蛾Lymantriadispar的Dronc同源物也表現(xiàn)出較長的N段結(jié)構(gòu)域，但只能觸發(fā)鱗翅目細胞系的凋亡(Kitaguchietal., 2013)。Sf-caspase-1, Sl-caspase-1和Ha-caspase-1是分別從草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda、海灰翅夜蛾Spodopteralittoralis和棉鈴蟲Helicoverpaarmigera體內(nèi)分離鑒定的半胱天冬酶，都為效應(yīng)半胱天冬酶，且與Drice有較高的同源性(Fraser and Evan, 1997; Duetal., 1999; Yangetal., 2008)。不久前，4個甜菜夜蛾Spodopteraexigua半胱天冬酶蛋白(SeCasp-1, SeCasp-6, SeCasp-7和SeCasp-8)也被鑒定，其中SeCasp-1和SeCasp-7可能是效應(yīng)半胱天冬酶同源物，SeCasp-8可能是起始半胱天冬酶的同源物，而SeCasp-6則被鑒定為一種獨特的甜菜夜蛾半胱天冬酶，與所有已鑒定的昆蟲半胱天冬酶相似性較低(Yuetal., 2020a)。

本研究在前人研究基礎(chǔ)上，根據(jù)已經(jīng)報道的甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Yuetal., 2018)，鑒定了兩個甜菜夜蛾半胱天冬酶基因(SeCasp-3和SeCasp-4)；進一步監(jiān)測了在過氧化氫、放線菌素D和地塞米松3種化學物質(zhì)誘導下以及煙芽夜蛾囊泡病毒3h株(Heliothisvirescensascovirus 3h, HvAV-3h)、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)、大腸桿菌TG1菌株EscherichiacoliTG1(E.coliTG1)和蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensiskurstaki(Btk)4種病原微生物感染的情況下SeCasp-3和SeCasp-4的表達模式。這些結(jié)果豐富和完善了鱗翅目半胱天冬酶功能的認知和理解，為闡釋昆蟲細胞凋亡以及昆蟲與病原微生物互作機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及病原微生物

甜菜夜蛾的室內(nèi)種群根據(jù)Li等(2013)的方法在27±1℃下于光周期16L∶8D中培養(yǎng)，成蟲用10%的蜂蜜水補充營養(yǎng)。甜菜夜蛾的脂肪體細胞系(SeFB)由中國科學院動物研究所秦啟聯(lián)研究員提供(Zhangetal., 2006)，在含有10%胎牛血清(GIBCO, 美國)，青霉素(100 μg/mL)和鏈霉素(50 μg/mL)的SFX昆蟲細胞培養(yǎng)基(HyClone, 美國)中培養(yǎng)(27±1℃)。

HvAV-3h由本實驗室保存并按照Li等(2013)的方法進行接種與擴繁；AcMNPV和E.coliTG1由西北農(nóng)林科技大學王敦老師實驗室饋贈并于本實驗室保存；Btk芽孢粉劑購自北海強星生物科技有限公司(廣西北海)。

1.2 試劑和儀器

TRI REAGENT? RNA/DNA/PROTEIN ISOLATION REAGENT(MRC, 美國)，GoScriptTMReverse Transcription Mix, Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega, 美國)，SYBRPremixExTaqⅡ試劑盒(TaKaRa, 日本)，微柱濃縮DNA凝膠回收試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司, 北京)，30%過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)(國產(chǎn)分析純)，放線菌素D(actinomycin D, ActD)(Sigma, 美國)和地塞米松(dexamethasone, DEX)(Sigma, 美國)等。頂置LED人工氣候培養(yǎng)箱(寧波楊輝儀器有限公司, 寧波)，BIO RAD S1000TMPCR 儀(Bio Rad Laboratories, 美國)，DYY-6C型電泳儀(北京六一生物科技有限公司, 北京)，CFX96 TouchTMReal-Time PCR System儀(Bio-Rad Laboratories, 美國)，Centrifuge 5804 R高速冷凍離心機(Eppendorf, 德國)，Gel Logic 212凝膠成像系統(tǒng)(Kodak, 美國)，ZQLY-180震蕩培養(yǎng)箱，UV-2000型切膠儀等。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

根據(jù)Yu等(2018)的方法，以針刺法模擬寄生蜂的產(chǎn)卵行為接種HvAV-3h。以昆蟲針蘸取HvAV-3h的血淋巴儲存液(其中HvAV-3h的含量約為1.1×1011個病毒粒子/mL)后，從腹背部(第7-11體節(jié))刺入蛻皮后12 h內(nèi)的甜菜夜蛾3齡幼蟲血腔內(nèi)，收集HvAV-3h感染后7 d的試蟲和未經(jīng)過處理的3齡甜菜夜蛾幼蟲(各6頭)。根據(jù)TRI REAGENT? RNA/DNA/PROTEIN ISOLATION REAGENT(MRC, 美國)試劑盒說明書分別提取總RNA。根據(jù)GoScriptTMReverse Transcription Mix, Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega, 美國)的操作說明，以1.0 μg總RNA作為模板，合成cDNA，貯存于-20℃。

1.4 SeCasp-3和SeCasp-4的克隆及序列分析

基于實驗室已經(jīng)獲得的HvAV-3h感染的甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Yuetal., 2018)，篩選通過SwissProt注釋為caspase且FPKM值大于3的unigenes。用ORF Finder(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)檢測篩選獲得的各基因，并繼續(xù)以BLAST(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)在線分析注釋蛋白的準確性。利用Expert Protein Analysis System(ExPASy)對蛋白質(zhì)的分子量和理論等電點進行分析；利用DNAMAN 9(Lynnon Biosoft)對各蛋白序列進行比對分析，并進一步用BLAST(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行蛋白序列一致性(percent identity)分析。利用Primer Premier 5分別設(shè)計各甜菜夜蛾半胱天冬酶基因編碼區(qū)的對框引物(表1)，以1.3節(jié)制備的cDNA為模板，對SeCasp-3和SeCasp-4基因進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系(25 μL): 10×PCR Buffer(Mg2+plus)2.5 μL, dNTPs(2.5 mmol/L)2.0 μL, 正反向引物(10 nmol/L)各0.5 μL, cDNA模板0.5 μL, Taq酶0.3 μL, ddH2O補齊至25 μL。PCR反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 55℃(根據(jù)引物的退火溫度設(shè)置)退火45 s, 72℃延伸1 min(根據(jù)引物的退火溫度設(shè)置，1 kb/min)，35次循環(huán); 72℃延伸5 min, 降溫至4℃保存。將SeCasp-3和SeCasp-4的PCR產(chǎn)物連接至pGEM-T Easy載體(Promega)上，送往擎科生物(長沙)有限公司進行測序分析。

1.5 誘導細胞凋亡后甜菜夜蛾脂肪體細胞中SeCasp-3和SeCasp-4相對表達量的檢測

將生長狀態(tài)良好的SeFB細胞接種于6孔板，置于27℃培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)12 h至細胞匯合度為80%～90%。根據(jù)Yu等(2020a)報道的方法，分別將H2O2(終濃度為100 μmol/L)、ActD(終濃度為10 μg/mL)和DEX(終濃度為50 μg/mL)加入細胞培養(yǎng)基中誘導SeFB細胞凋亡(Kleeffetal., 2000; Petronillietal., 2000; Sánchez-Bretaoetal., 2017)。在誘導后3, 6, 12, 24和48 h收集SeFB細胞，根據(jù)1.2節(jié)所述的方法提取各處理下SeFB細胞的總RNA并合成cDNA。根據(jù)SYBRPremixExTaqⅡ試劑盒(TaKaRa)所述的具體反應(yīng)體系和方法，分別以qSeCasp-3-F和qSeCasp-3-R為引物(表1)，檢測SeCasp-3的相對表達量；以qSeCasp-4-F和qSeCasp-4-R為引物(表1)，檢測SeCasp-4的相對表達量。以甜菜夜蛾的gapdh為內(nèi)參基因，各處理的各時間點設(shè)置3個生物學重復(fù)，每個生物學重復(fù)的qPCR檢測設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)。SeCasp-3和SeCasp-4的相對表達量根據(jù)Livak和Schmittgen(2001)所述的2-ΔΔCt方法計算獲得。

表1 實驗中用到的引物

1.6 不同病原微生物感染甜菜夜蛾3齡幼蟲后SeCasp-3和SeCasp-4相對表達量的檢測

以Btk和E.coliTG1為細菌病原微生物代表、HvAV-3h和AcMNPV為昆蟲病毒代表分別感染甜菜夜蛾3齡幼蟲。根據(jù)Yu等(2020b)報道的方法，分別收集28℃培養(yǎng)48 h的Btk菌體(出芽階段)和37℃培養(yǎng)16 h的E.coliTG1，配制成約108個細菌/mL的菌液；取200 μL配好的菌液，分別均勻涂布于10 cm2的人工飼料表面上，室溫風干30 min后，分別接種6頭健康的甜菜夜蛾3齡幼蟲，27℃進行飼養(yǎng)。根據(jù)Yu等(2020a)報道的方法，將AcMNPV病毒粒子與5%蔗糖和3%藍色食用色素(中國陜西省TOP醫(yī)藥化工有限公司)混合，制成病毒混懸液(5 000 OBs/μL)；取2 μL病毒懸浮液飼喂饑餓處理12 h的甜菜夜蛾3齡幼蟲，5 min內(nèi)取食完病毒懸浮液的幼蟲視為接種成功，然后將接種成功的幼蟲轉(zhuǎn)移至新鮮的飼料上，于27℃飼養(yǎng)。按照Li等(2021)的方法，將病毒滴度為1.16×1011個基因組拷貝/mL的HvAV-3h接種至甜菜夜蛾3齡幼蟲的體腔內(nèi)，并將接種后的試蟲轉(zhuǎn)移至含有新鮮飼料的養(yǎng)蟲盒內(nèi)單頭飼養(yǎng)。在病原微生物接種后1, 2, 3, 4和5 d分別收集試蟲，以不做任何處理由新鮮飼料一直飼養(yǎng)的幼蟲作為對照(CK)。根據(jù)1.2節(jié)中的方法分別提取健康幼蟲以及病原微生物感染試蟲的總RNA，并制備相應(yīng)的cDNA；根據(jù)1.5節(jié)中的方法用qPCR檢測SeCasp-3和SeCasp-4的相對表達水平，測試SeCasps對病原微生物感染的反應(yīng)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0軟件對單一時間點內(nèi)不同化學試劑誘導和對照組的SeFB細胞中SeCasp-3和SeCasp-4的相對表達量進行單因素方差分析，并用LSD法進行方差分析后的多重比較；用一般線性模型(general line model, GLM)對不同病原微生物感染甜菜夜蛾3齡幼蟲體內(nèi)SeCasp-3和SeCasp-4的相對表達量進行整體分析，利用不同病原微生物感染和對照組的甜菜夜蛾體內(nèi)SeCasp-3和SeCasp-4的相對表達量進行Student氏t檢驗。利用GraphPad Prism 5軟件繪制圖，圖中結(jié)果均表示為平均數(shù)±標準差。

2 結(jié)果

2.1 甜菜夜蛾半胱天冬酶基因的克隆和序列特征

擴增獲得長度為942 bp的SeCasp-3(GenBank登錄號: MW183334)和長度為843 bp的SeCasp-4(GenBank登錄號: MW183335)的完整編碼區(qū)。進一步分析表明，SeCasp-3編碼一個313個氨基酸殘基的蛋白，分子質(zhì)量約為35.87 kD，理論等電點為10.06；其N端的第1-88位氨基酸殘基位點被預(yù)測為一個半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域(caspase-recruitment domain, CARD)。SeCasp-4編碼一個280個氨基酸殘基的蛋白，分子質(zhì)量約為31.97 kD，理論等電點為6.14，包含一個白介素-l β轉(zhuǎn)化酶同源物[caspase, interleukin-1 beta converting enzyme(ICE)homologues, CASc]結(jié)構(gòu)域(第11-276位氨基酸殘基)。蛋白序列的同源性比對表明，SeCasp-3和SeCasp-4具有較高的氨基酸序列一致性(56.43%)，且SeCasp-3和SeCasp-4與已知昆蟲的Dronc蛋白具有一定程度上的同源性(圖1)，其中與家蠶Bombyxmori的BmDronc(GenBank登錄號: NM_001195467.1)的氨基酸序列一致性分別為45.54%和58.46%，與黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的DmDronc(GenBank登錄號: NM_079293.4)的氨基酸序列一致性分別為24.13%和27.84%，與東亞飛蝗Locustamigratoria的LmDronc(GenBank登錄號: KY056149.1)的氨基酸序列一致性分別為27.84%和34.63%。

圖1 甜菜夜蛾SeCasps與其同源蛋白的多重比較

2.2 化學物質(zhì)誘導細胞凋亡對SeCasp-3和SeCasp-4表達的影響

在誘導劑處理3 h后，SeCasp-3的相對表達量相對穩(wěn)定，在誘導劑處理后的6-48 h，SeCasp-3的相對表達量開始出現(xiàn)不同程度的波動(圖2: A)；在H2O2的誘導下，SeCasp-3的表達量從處理后6 h開始逐漸升高，在H2O2處理后24 h(F=24.733,d.f.=96,P=0.0122)和48 h(F=7.467,d.f.=96,P=0.0081)時間點，SeCasp-3的相對表達量顯著高于其在健康SeFB細胞中的表達量；在ActD的處理下，SeCasp-3的相對表達量在處理后6-12 h有所下調(diào)，但在24 h(F=24.733,d.f.=96,P=0.0074)和48 h(F=7.467,d.f.=96,P=0.0001)時間點，SeCasp-3的相對表達量則顯著高于健康SeFB細胞中SeCasp-3的相對表達量；SeCasp-3的表達量在DEX處理48 h后，其表達量未見顯著的變化(F=7.467,d.f.=96,P=0.1353)。SeCasp-4在各化學誘導劑處理后12 h內(nèi)的表達調(diào)控趨勢與SeCasp-3大致相同，除了ActD的誘導使SeCasp-4的表達量相對降低，而其他兩種誘導劑處理后SeCasp-4的相對表達量并未發(fā)生顯著性的變化(圖2: B)；在誘導劑處理后24-48 h，SeCasp-4的表達量升高了數(shù)千倍；與SeCasp-3不同的是，DEX的誘導能夠顯著刺激SeCasp-4的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)(F=43.55,d.f.=96,P<0.0001)。

圖2 化學物質(zhì)誘導細胞凋亡后甜菜夜蛾脂肪體細胞中SeCasp-3(A)和SeCasp-4(B)的相對表達量

2.3 不同病原微生物感染對甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)SeCasp-3和SeCasp-4相對表達量的影響

GLM分析顯示，兩個SeCasp基因?qū)煞N細菌的感染均不敏感，SeCasp-3在Btk(F=51.825,d.f.=4, 25,P=0.1160)或E.coliTG1(F=51.825,d.f.=4, 25,P=0.0640)感染試蟲體內(nèi)的表達量以及和SeCasp-4在Btk(F=28.285,d.f.=4, 25,P=0.5710)或E.coliTG1(F=28.285,d.f.=4, 25,P=0.145)感染試蟲體內(nèi)的表達量相較健康幼蟲體內(nèi)SeCasp基因的相對表達量并無顯著差異；與健康幼蟲相比，HvAV-3h感染后SeCasp-3(F=51.825,d.f.=4, 25,P<0.0001)和SeCasp-4(F=28.285,d.f.=4, 25,P<0.0001)的表達被顯著抑制；AcMNPV感染后SeCasp-3的表達量(F=51.825,d.f.=4, 25,P<0.0001)和SeCasp-4的表達量(F=28.285,d.f.=4, 25,P=0.0060)也被顯著抑制(圖3)。

3 討論

本研究通過PCR技術(shù)獲得甜菜夜蛾SeCasp-3和SeCasp-4基因的完整cDNA片段，編碼的蛋白序列具有半胱天冬酶典型特征。蛋白序列同源性比對結(jié)果顯示SeCasp-3和SeCasp-4與BmDronc的序列一致性分別高達45.54%和58.46%，預(yù)示著SeCasp-3和SeCasp-4極有可能具有起始半胱天冬酶功能。

細胞凋亡是昆蟲發(fā)育所必需的重要機制，參與變態(tài)過程中的組織分解(Yietal., 2018; 張淑堯等, 2018; 龍詩慧等, 2019)?；瘜W物質(zhì)、紫外線、病原微生物感染等均可誘導細胞凋亡(王文祥等, 2011; Czarniewskaetal., 2017; Xuetal., 2018)。本研究先后利用H2O2, ActD和DEX作為細胞凋亡的化學誘導劑，具有3種不同的誘導凋亡方式：H2O2可以增加細胞氧化應(yīng)激程度，經(jīng)歷Fas介導的凋亡(Sánchez-Bretaoetal., 2017)；ActD通過激活幾種不同通路來觸發(fā)細胞凋亡，這些通路包括JNK/SAPK通路、p35通路和Kv1.3通路等(Kleeffetal., 2000)；DEX主要參與線粒體介導的凋亡途徑(Petronillietal., 2000)。結(jié)果表明，SeCasp-3響應(yīng)于H2O2和ActD的誘導，卻對DEX的誘導無顯著性響應(yīng)；SeCasp-4則對H2O2, ActD和DEX的誘導均有應(yīng)答，其中DEX的誘導能夠刺激SeCasp-4的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)數(shù)千倍(圖2)；SeCasp-3和SeCasp-4雖然均為Dronc的同源蛋白，但對不同凋亡信號的敏感性存在著明顯差異，SeCasp-4與線粒體主導的細胞凋亡相關(guān)，而SeCasp-3則與之無關(guān)。

作為Dronc的同源蛋白，我們推斷SeCasp-3和SeCasp-4在甜菜夜蛾中承擔起始半胱天冬酶的角色和功能。在果蠅中，存在著3種起始半胱天冬酶(Dronc, Dredd和Strica)和4種效應(yīng)半胱天冬酶(Drice, Dcp-1, Decay和Dcp2/Damm)(Riedl and Shi, 2004)。Dredd主要功能是參與昆蟲先天性免疫反應(yīng)，Dredd基因突變的果蠅不能合成抗菌多肽且對革蘭氏陰性菌易感(Leulieretal., 2000)。Drone和Drice分別是維持果蠅胚胎發(fā)育過程中細胞凋亡最主要的起始半胱天冬酶和效應(yīng)半胱天冬酶(Dorstynetal., 1999a, 1999b)。通常情況下，Drice的激活受Dronc的調(diào)控(Kumar, 2006)。作為病原微生物感染后常見的自我保護手段，細胞凋亡常見于不同病原微生物感染后的宿主中(Zychlinsky and Sansonetti, 1997; 劉凱于等, 2008)，同時病原微生物也會通過抑制宿主細胞的凋亡過程為自身的感染和復(fù)制爭取足夠的時間和空間(Molloyetal., 1994)。在本研究中，我們用了4種病原微生物感染甜菜夜蛾3齡幼蟲，并檢測感染后甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)SeCasp-3和SeCasp-4相對表達量的變化，以期探討SeCasp-3和SeCasp-4的功能異同。兩個SeCasp基因在感染了Btk,E.coliTG1, AcMNPV和HvAV-3h后表現(xiàn)出多種表達模式(圖3)?；谝话憔€性模型的分析結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)HvAV-3h和AcMNPV感染后SeCasp-3和SeCasp-4的表達被顯著抑制，而被Btk或E.coliTG1后其相對表達量并無顯著差異。這些結(jié)果與Yu等(2020a)報道的結(jié)果不完全相同，原因可能是因為SeCasps間的同源性差異導致的；此外，對照組SeCasp-3在處理5 d中，互相之間存在差異，這種差異可能與不同的SeCasps在幼蟲發(fā)育中具有不用的幼蟲發(fā)育齡期表達譜相關(guān)。相似的結(jié)果出現(xiàn)于胡杰(2019)關(guān)于Bmcasp8l的發(fā)育時期表達譜的研究中，顯示Bmcasp8l的表達量在4齡幼蟲期高于3齡幼蟲期，且在同一齡期的不同時間點內(nèi)，Bmcasp8l的表達量也存在較大差異。

本研究鑒定了兩個甜菜夜蛾半胱天冬酶基因，分析了它們在3種細胞凋亡誘導劑和4種病原微生物感染下的表達響應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)為進一步研究半胱天冬酶功能及其在昆蟲細胞凋亡過程中的作用機制提供了重要的理論依據(jù)，并有助于后期深入了解鱗翅目昆蟲在生長發(fā)育過程中被不同病原微生物感染后的細胞凋亡調(diào)控機制。